Expressionsprofil von Mucinen (MUC2, MUC5AC und MUC6) in Helicobacter pylori infiziert präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magen epithelium

Expressionsprofil von Mucinen (MUC2, MUC5AC und MUC6) in Helicobacter pylori
präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magen-Epithel infiziert
Abstrakte
Hintergrund Helicobacter pylori
(H. pylori
) verursacht Gastritis und intestinale Metaplasie (IM), die an Magenkarzinom entwickeln kann. Das Ziel dieser Studie war es, das Profil von Mucinen in den progressiven Stadien von H. pylori
infizierten präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magen-Epithel zu vergleichen. Wir haben eine Reihe von monoklonalen Antikörpern mit gut definierten Spezifitäten von MUC2, MUC5AC und MUC6 das Expressionsmuster von Mucinen durch Immunhistochemie zu charakterisieren.
Methoden
RUT und ELISA waren unten für H. pylori
Bestätigung. Menschlichen Magenbiopsieabschnitte wurden mittels Immunhistochemie mit MUC2, MUC5AC und MUC6 Antikörpern gefärbt.
Ergebnisse
MUC5AC wurde in die oberflächliche Epithel und dem oberen Teil der Magen Pits ausgedrückt. MUC6-Expression wurde in den unteren Teil der Magendrüsen nachgewiesen. MUC2 wurde in intestinale Metaplasie, meist in Becherzellen exprimiert wird. Das Mucin Expressionsprofil in den progressiven Stufen der H. pylori infizierten menschlichen
Magenepithel ermöglicht die Identifizierung von intestinalen Metaplasien, die durch eine verminderte Expression des Magen Mucinen (MUC5AC und MUC6) und de novo
Expression charakterisiert ist aus MUC2.
Fazit
Abschließend unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass es mit dem aberranten Expression von MUC2 in intestinale Metaplasie, während des Prozesses der Karzinogenese Magen Expression MUC5AC und MUC6 gemeinsam verändert wird. Die vorliegende Studie zeigt, dass das Mucin MUC2 Expressionsmuster ein zuverlässiger Marker für intestinale Metaplasie ist, die in Zusammenhang mit H. pylori infizierten Individuen
erscheint.
Hintergrund Helicobacter pylori
kolonisiert menschlichen Magenschleimhaut und verursacht Gastritis und intestinale Metaplasie (IM), die gegenüber Magenkarzinom entwickeln kann [1-3]. H.-pylori-Infektion
wurde als Typ-I-menschliches Karzinogen in IARC etabliert [4]; es wurde vor kurzem gezeigt, dass die Bakterien induzieren Gastritis, IM auch in der Lage sind, und Magenkarzinom in der mongolischen Wüstenrennmäusen [5-8]. Beim Menschen H. pylori
kolonisiert auch die Duodenalschleimhaut wenn es Magen-Metaplasie ist [9]. H.-pylori-Infektion
in Mensch ist daher abhängig von der Magen-Mikroumgebung, die zu einem großen Teil durch die Mucin und Kohlenhydrat-Zusammensetzung der Magen Muzinschicht bestimmt wird.
Mucine sind stark glykosylierte Glykoproteine, die die Hauptkomponenten sind die Schleimhaut viskoses Gel die Oberfläche Epithelgewebe abdeckt [10]. Bisher wurden neun verschiedenen epithelialen Mucin Gene (MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 6, 7 und 8) sind identifiziert worden [11-21]. In situ Hybridisierung und
immunhistochemische Studien haben gezeigt, dass diese Mucine sind in Epithelien mit Zelltypspezifität differentiell exprimierte [21-24]. Die normale Magenschleimhaut zeigt Zelltypen spezifische Expression von MUC1, MUC5AC, und MUC6, mit zwei ersten im oberflächlichen Epithel und MUC6 in den tiefen Drüsen Mucine [22, 25, 26]. MUC6 wird vor allem in der Magenschleimhaut exprimiert wird. Die normale Magenschleimhaut nicht MUC2 exprimieren [25, 27].
Veränderungen der Expressionsniveaus und Glycosylierungsmuster Mucine wurden mit verschiedenen Krankheiten assoziiert, einschließlich Karzinomen [27-31]. In Magenkrebs, haben Veränderungen in Mucin-Polypeptid berichtet: Verlust der Expression von MUC5AC [23, 26, 32], erhöhte Mucin heterogenesity [23]. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Mucin Veränderungen können als "molekularen" Marker für maligne Transformation von Magenschleimhaut angesehen werden. Weiter mehr, ein vor kurzem stark MUC5AC als ein mutmaßliches H. pylari
Rezeptor vorgeschlagen veröffentlichte Untersuchung [33, 34]. In der vorliegenden Studie
haben wir das Muster der Mucin-Expression in den progressiven Stadien von H. pylori gekennzeichnet
infizierten menschlichen Magenkarzinom. Wir haben ein umfassendes Panel von monoklonalen Antikörpern, mit gut charakterisierten Besonderheiten zu MUC2, MUC5AC und MUC6 mucins Verwendung.
Ergebnisse | Expressionsmuster von MUC2, MUC5AC und MUC6 Muzine in normalen Magenschleimhaut
MUC5AC war hoch in Becherzellhyperplasie Epithel und Schleimhäute Hals Zellen von Antrum ausgedrückt (>. 75%, 1b, Fig. 3b; Tabelle 2). Expression von MUC6 wurde in den Drüsen des Antrums nachgewiesen (> 75%, 1c, Fig. 3c;. Tabelle 3) und MUC2 wurde nicht in normaler Magenschleimhaut nachgewiesen (Fig 1a;. Fig. 3a; Tabelle 2). Abbildung 1 Immunhistochemische Färbung von MUC2, MUC5AC und MUC6 Muzine in H. pylori-infizierten Patienten. ein. MUC2 Färbung der normalen Magenschleimhaut (Original Vergrößerung × 100). b. MUC5AC Färbung der normalen Magenschleimhaut (Original Vergrößerung × 100). c. MUC6 Färbung der normalen Magenschleimhaut (Original Vergrößerung × 100). d. MUC2 Färbung der atrophischen Gastritis (Original Vergrößerung × 100). e. MUC5AC Färbung der atrophischen Gastritis (Original Vergrößerung × 100). f. MUC6 Färbung der atrophischen Gastritis (Original Vergrößerung × 100). G. MUC2 Färbung der intestinalen Metaplasie (Original Vergrößerung × 100). h. MUC5AC Färbung der intestinalen Metaplasie (Original Vergrößerung × 100).
Abbildung 2 Immunhistochemische Färbung von MUC2, MUC5AC und MUC6 Muzine in H. pylori-infizierten Patienten. ein. MUC6 Färbung der intestinalen Metaplasie (Original Vergrößerung × 100). b. MUC2 Färbung von Dysplasie (Originalvergrößerung × 100). c. MUC5AC Färbung von Dysplasie (Originalvergrößerung × 100). d. MUC6 Färbung von Dysplasie (Originalvergrößerung × 100). e. MUC2 Färbung von Karzinomen (Original Vergrößerung × 100). f. MUC5AC Färbung von Karzinomen (Original Vergrößerung × 100). G. MUC6 Färbung von Karzinomen (Original Vergrößerung × 100).
Abbildung 3 Expressionsmuster von Mucinen (MUC2, MUC5AC und MUC6) in H. pylori infiziert präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magenepithels. ein. MUC2-Expression in H. pylori
präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magenepithels infiziert. b. MUC5AC Expression in H. pylori
infizierten präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magenepithels. c. MUC6 Expression in H. pylori
präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magen-Epithel infiziert.
Tabelle 1 Spezifitäten, Herkunft und Verdünnungen der monoklonalen Antikörper.
Monoklonale Antikörper
Spezifität
Referenz
Dilution
pMH1
MUC2
Reis et al
[11]
unverwässerte
CLH2
MUC5AC
Reis et al
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al
[10]
1: 2
Tabelle 2 Expression von Mucinen (MUC2, MUCSAC und MUC6) in H. pylori
infizierten präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magenepithels
Stages

H. pylori
MUC2 Expression
MUC5AC Expression
MUC6 Expression
N
P
- +
++
+++
++++
- +
++
+++
++++
- + +
+
+++
++++
normal (n = 7)
7
- n = 7 (100%)
- -
-
- -
-
- n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%)
- -
- Seite 1 (14,3%)
6 (85,7%)
atrophische Gastritis (n = 26)
- 26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%)
- -
- - Suche - Seite 1 (38%)
13 (50%)
12 (46,2%)
- Suche - Seite 1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
intestinale Metaplasie (n = 21)
- 21
-
- n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) **
- - Seite 1 (4,8%)
16 ( 76,2%) **
4 (19%)
-
- 5 (23,8%)
14 (66,7%) **
2 (9,5%)
-
Dysplasien (n = 17)
- 17
- n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5.9 %)
-
- 3 (17,6%)
10 (58,8%)
4 (23,5%)
-
- 3 (17,6%)
11 (64,7%)
3 (17,3%)
- Karzinom (n = 36)
- 36
- 22 (61,1%)
14 (38,9%)
- -
- 28 (77,8%)
8 (22,2%)
-
- 12 (33,3% )
17 (47,2%)
7 (19,4%)
-
- N - negativ - (> 5%) negativ
P - positive + (5-25%) wenige positive Zellen
n - Anzahl der Fälle ++ (25-50%) gut definierten Bereich
+++ (50- 75%) umfassenden Bereich gefärbt
++++ (75-100%) die meisten der Zellen gefärbt
** p < 0,00, * p < 0,05 (Signifikanter Unterschied in expression)
Immunnachweis von Mucinen in atrophische Gastritis
Es war die Expression von MUC5AC in allen Fällen von prismatischen Zellen (Fig 1e;. Fig. 3b; Tabelle 2). Der Prozentsatz der gefärbten Zellen von Fall zu Fall variieren, in den meisten Fällen gab es einen Trend für eine höhere Anzahl von Zellen, MUC5AC (> 75%) in dem oberflächlichen Teil der metaplastischen Drüsen als im tiefen Teil. MUC6 wurde in prismatischen Zellen nachgewiesen werden (> 50%; Abb. 1f; Abb. 3c; Tabelle 2) und MUC2 wurde nicht in atrophische Gastritis (Abb 1d.) Nachgewiesen
Immunnachweis von Mucinen in intestinale Metaplasie
Es. verminderte Expression von MUC5AC und MUC6 in allen Fällen wurde (> 50%), die beide in Becher und in prismatischen Zellen (Abb 1h, 2a;... Abb. 3b, 3c; Tabelle 2). Der Prozentsatz der gefärbten Zellen von Fall zu Fall variiert, de novo
Expression von intestinalen Mucin MUC2 wurde (> 75%) beobachtet, und seine Expression eine diffuse cytoplasmatische Muster in Becherzellen (Fig angezeigt 1g;. Fig. 3a; . Tabelle 2)
Immunnachweis von Mucinen in Dysplasie
wurde Es verminderte Expression von MUC5AC und MUC6, als intestinale Metaplasie (> 50%). MUC5AC und MUC6 zeigten eine diffuse cytoplasmatische Expressionsmuster in säulen Zellen (Fig 2c, Fig. 2d, Fig. 3d;. Fig. 3, Tabelle 2). MUC2-Expression zeigte eine diffuse zytoplasmatische Muster in Kelchen Zellen (> 50%, 2b, Fig. 3a; Tabelle 2)
Immunnachweis von Mucinen in Karzinom
MUC5AC und MUC6 Expression wurden in frühen Karzinom häufig beobachtet (>.; 50%) als erweiterte Karzinome (> 25%). In fortgeschrittenen Karzinomen, beobachteten wir einen Trend für verringerte Immunreaktivität in tiefen Bereichen als in den oberflächlichen Bereichen. MUC5AC und MUC6 Ausdrücke wurden in fortgeschrittenen Karzinomen verringert (> 25%; 3a, Fig. 3b;. Abb. 3c, Fig. 2e, 2f, 2g Abb;.. Tabelle 2).
Diskussion
in der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass das Muster der Mucin-Expression in den progressiven Stadien von H. pylori
infizierten Menschen Magenepithels. Mucine sind mit zell- und gewebespezifische Muster in normalem Gewebe exprimiert wird. Veränderungen des Expressionsmusters von Mucinen wurden in Karzinomen sowie in deren Vorläuferläsionen beschrieben; in den letzteren, veränderte Mucin Kohlenhydrat- und Peptideinheiten können molekulare Marker für ein erhöhtes Risiko einer malignen Transformation dar [27, 35, 36, 38-40].
In Übereinstimmung mit früheren Studien, die die Verteilung von Mucinen im normalen Magen berichten wir gefunden MUC5AC ist hoch in Becherzellhyperplasie Zellen Antrum ausgedrückt, wie berichtet [26, 27, 32, 37-39]. Wir fanden auch, dass MUC6 wird in Schleimzellen der Halszone in Pylorusdrüsen des Antrums mit ähnlichen Muster zu exprimierenden dass zuvor beschrieben [22, 23, 47]. Die Expression von MUC2 wurde in der Regel nicht in normaler Magenschleimhaut nachgewiesen, wie in den früheren Berichten beschrieben [25, 27, 40].
Intestinale Metaplasie ist eine der in der Kaskade von Ereignis identifizierten Läsionen, die die Entwicklung von Magenkarzinomen [voran ,,,0],41]. Intestinale Metaplasie umfasst den Ersatz der Magenschleimhaut von einem Epithel, das histologisch die Darmschleimhaut ähnelt. Veränderte Mucin-Expressionsmuster wurden in H. pylori
infizierten intestinale Metaplasie beobachtet, einschließlich unter Expression von MUC5AC und MUC6 und de novo
Expression von MUC2 meist in Becherzellen [30, 48]. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass die intestinale Metaplasie macht eine Differenzierung der Schleimhaut zu einer Darm-Phänotyp darstellen [42, 43].
Die verminderte Expression von MUC5AC und MUC6 Mucin in Magenkarzinomen wurden in der vorliegenden Studie bestätigt. Die Expression von MUC5AC in frühen Magenkarzinom der vorliegenden Serie, unabhängig von der histologischen Typ der Tumoren, im Gegensatz zu der verringerten Expression von MUC5AC Immunreaktivität in fast der Hälfte der fortgeschrittenen Karzinomen, die darauf hindeuten, dass alle Magenkarzinomen mindestens einige Zellen behalten mit ein Magen-Phänotyp bei den ersten Schritten der Tumorentwicklung (26). Diese Annahme wird weiter durch die verringerte Immunreaktivität in tiefen Bereichen unterstützt verglichen mit oberflächlichen Bereiche der fortgeschrittenen Karzinomen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen zeigt, dass Magenkrebs Progression durch Veränderung der Expression mehrerer Mucin-Gene begleitet wird [14]. Schließlich beobachteten wir, dass die intestinale Mucin MUC2 in jedem intestinale Metaplasie exprimiert, das eine Läsion ist, die während des Prozesses der Karzinogenese des Magens im Rahmen der H. pylori infizierten Individuen
erscheint.
Schlussfolgerung Obwohl
H . pylori
als Klasse I von der IARC wurde [4] der Mechanismus der Karzinogenese des Magens bleibt schlecht verstanden krebserzeugend eingestuft. In präneoplastischen Magenschleimhaut, die Expression aller drei Mucin Antigene anscheinend nicht mit der Schwere der Entzündung und H. pylori
Status korrelieren. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung kann vorschlagen, dass H.
Infektion wirkt als Initiator der Karzinogenese Kaskade durch Induzierung der Entzündung und, in einigen Fällen die nachfolgende metaplastische Veränderung pylori. Intestinale Metaplasie wird durch die Induktion der Expression MUC2 begleitet und verminderte Expression von MUC5AC und MUC6. Diese Veränderungen können die Entwicklung von Magenkrebs begünstigen. Die vorliegende Studie legt nahe, dass MUC2 ein Marker für intestinale Metaplasie und kann für die Früherkennung dieser Läsion in H. pylori
infizierten präneoplastischen menschlichen Magenepithels.
Materialien und Methoden
Gewebeproben verwendet werden
Fünfzig neun Magen-Biopsie-Proben und 3 ml Blut wurden von Stanley Medical College and Hospital, Chennai erhalten. Alle Biopsie Gewebeproben wurden nach informierte Einwilligung erhoben. Diese Studie wurde nach der Freigabe erhalten, von der ethischen Bord des Krankenhauses durchgeführt. Alle Biopsien wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert und routinemßig in Paraffinwachs eingebettet. 4 um dünne Serienschnitte wurden für die Immunhistochemie geschnitten und verwendet. H. pylori-Infektion wurde
von Rut und ELISA bestätigt [43]. Hämatoxylin und Eosin gefärbte Schnitte wurden verwendet, Gastritis nach revidiert Sydney gestuft zu klassifizieren [44], nach Magentumoren auf die Klassifizierung von Lauren [45] und der WHO-Klassifikation [46]. Wir untersuchten sieben Fälle von normalen menschlichen Magen-Epithel (7 Biopsien), 26 Fälle von atrophischen Gastritis (26 Biopsien), 21 Fälle von Intestinale Metaplasie (21 Biopsien), 17 Fälle von Dysplasie (17 Biopsien) und 36 Fälle von Karzinomen, bei denen 21 Fälle frühen Karzinom und 15 Fälle fortgeschrittene Karzinom (16 Biopsien und 20 OP-Präparate).
monoklonale Antikörper Ein Gremium von drei monoklonalen Antikörpern
verwendet wurde, um die Expression von Mucin (MUC2, MUC5AC und MUC6) zu bestimmen. Die Spezifitäten, Referenzen und Verdünnungen der Antikörper in der Tabelle aufgelistet sind 1.
Immunohistochemistry
Sections von normalen, präneoplastischen und neoplastischen Magengewebe wurden immuno gebeizt nach Reis et al
[47] mit leichten Modifikationen . (; St Louis, MO Sigma), verdünnt in 0,1 M Na-Acetatpuffer, pH 5,5 bis Abschnitte für Neuraminidase-Behandlung entwickelt wurden zweimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 gewaschen und mit Neuraminidase aus Clostridium perfringens Typ VI
gewaschen um eine Endkonzentration von 0,1 U /ml. Die Inkubation wurde bei 37 ° C für 2 h durchgeführt und wurde durch drei Waschungen in eiskalter PBS. Die Schnitte wurden mit 0,5% H 2 O 2 in Methanol für 30 min, gefolgt von 20 Minuten Inkubation mit Kaninchen nicht-Immunserum behandelt. Schnitte wurden mit primärem Antikörper (Tabelle 1) abgespült und inkubiert über Nacht bei 4 ° C. Die Schnitte wurden gespült und inkubiert mit HRP Kaninchen conjucated anti-Maus-Sekundärantikörper (1: 100 Verdünnung) für 1 h, gefolgt von Spülen mit PBS und Entwicklung mit 0,05% 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) (SRL, Mumbai, Indien ) frisch in PBS, das 0,1% H 2 O 2 hergestellt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert und montiert. Alle Serien einschließlich positiver und negativer Kontrollen wurden durch Substitution der primären mAb mit Immunglobulinen der gleichen Klasse und bei der gleichen Konzentration durchgeführt.
Scoring von Mucinen Expression in H. pylori infiziert
präneoplastischen und neoplastischen menschlichen Magengewebe
Eine semi-quantitative Ansatz wurde verwendet, um die Immunfärbung von menschlichen Magengewebe zu punkten. Die Objektträger wurden unter dem Lichtmikroskop untersucht, alle 100-Zellen wurden in fünf unterschiedlichen Bereichen erzielt, und die Ergebnisse wurden als Mittelwert Prozentsatz ausgedrückt. (-), Negativ; +, Wenige positive Zellen (< 25%); ++ Gut definierte Bereiche mit positiven Zellen (25-50%); +++, Ausgedehnte Bereiche mit positiven Zellen (50-75%); ++++, Die meisten Zellen gefärbt (> 75%). Statistik
Datenanalyse wurde durchgeführt mit Hilfe von statistischen Softwarepaket SPSS 10.0 für Windows. Der Chi-Quadrat-Test oder der exakte Test nach Fisher wurde verwendet, um Unterschiede in den Frequenzen zu analysieren. Spearman-Korrelationstest wurde verwendet, Korrelation zwischen den Parametern zu analysieren. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet
Abkürzungen
DAB - 3:.
3'-Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid
ELISA:
Enzyme-Linked Immuno Test
HRP:
Meerrettichperoxidase
IARC:
Internationale Agentur für Krebsforschung

IM:
intestinale Metaplasie
mAbs:
monoklonale Antikörper
PBS:
Phosphatgepufferte Saline
WHO:
Weltgesundheitsorganisation
RUT.
Schnelle Harnstoff-Test

Erklärungen
Danksagung
die Autoren die Lady Tata Memorial Trust, Mumbai, Indien für die finanzielle Unterstützung zu einer der Autoren S. Durai Babu danken. Wir danken Herrn Dr. Narasimhan, Professor und Leiter der Abteilung für Pathologie, Sri Ramachandra Medical College and Hospital, Indien, für die histologischen und immunhistochemischen Ergebnisse der Überprüfung und Dr. R. Ravanan, Reader, Institut für Statistik, Presidemcy College, Indien für die Unterstützung in der statistischen Analyse. Wir möchten Dr. Celso A. Reis für die Bereitstellung der Anti-MUC2, anti-MUC5AC und anti-MUC6 monoklonalen Antikörpern.
Autoren Original vorgelegt Dateien für Bilder Was sind unten, um die Links zu den Autoren danken Original vorgelegt Dateien für Bilder. 12943_2005_142_MOESM1_ESM.doc Autoren Originaldatei für Abbildung 1 12943_2005_142_MOESM2_ESM.doc Autoren Originaldatei für Abbildung 2 12943_2005_142_MOESM3_ESM.doc Autoren Originaldatei für Abbildung 3 12943_2005_142_MOESM4_ESM.doc Autoren Originaldatei für 4 12943_2005_142_MOESM5_ESM.doc Autoren Originaldatei für Abbildung 5

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