Expression profilen til slimstoffer (MUC2, MUC5AC og MUC6) i Helicobacter pylori infiserte pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelige mage epithelium

uttrykk profilen til slimstoffer (MUC2, MUC5AC og MUC6) i Helicobacter pylori
smittet pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelig gastrisk epitel
Abstract
Bakgrunn
Helicobacter pylori product: (H. pylori
) forårsaker magekatarr og intestinal metaplasi (IM) som kan utvikle seg til magekreft. Målet med denne studien var å sammenligne profilen til slimstoffer i de progressive stadier av H. pylori
infisert pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelig gastrisk epitel. Vi brukte et panel av monoklonale antistoffer med veldefinerte særpreger MUC2, MUC5AC og MUC6 å karakterisere uttrykket mønster av slimstoffer ved immunhistokjemi.
Metoder
RUT og ELISA var nede for H. pylori
bekreftelse. Menneskelige mage biopsi seksjonene ble farget ved hjelp av immunhistokjemi med MUC2, MUC5AC og MUC6 antistoffer.
Resultater
MUC5AC ble uttrykt i overflateepitel og øvre del av mage groper. MUC6 ekspresjon ble påvist i den nedre del av mage kjertler. MUC2 ble uttrykt i intestinal metaplasi, for det meste i slimceller. Den slimstoffekspresjon profil i det progressive stadier av H. pylori
infisert human gastrisk epitelium tillater identifisering av intestinal metaplasi, som er kjennetegnet ved en redusert ekspresjon av mageslimstoffer (MUC5AC og MUC6) og de novo
ekspresjon av MUC2.
Konklusjon
som konklusjon våre resultater tyder på at det ikke er endret ekspresjon av MUC5AC og MUC6 sammen med den avvikende ekspresjon av MUC2 i intestinal metaplasi, under prosessen av magekreftutvikling. Denne studien viser at MUC2 mucin uttrykk mønster er en pålitelig markør for intestinal metaplasi, som vises i sammenheng med H. pylori
smittede personer.
Bakgrunn
Helicobacter pylori
koloniserer human mageslimhinne og forårsaker gastritt og intestinal metaplasi (IM), som kan utvikle seg mot gastrisk karsinom [1-3]. H. pylori
infeksjon ble etablert som en type jeg menneskelig karsinogen i IARC [4]; Det ble nylig vist at bakteriene er også i stand til å indusere gastritt, IM, og gastrisk karsinom i mongolske ørkenrotter [5-8]. Hos mennesker H. pylori
koloniserer også duodenal mucosa når det er gastrisk metaplasi [9]. H. pylori
-infeksjon hos mennesker er derfor avhengig av den gastriske mikromiljøet, som bestemmes i stor grad av den mucin og karbohydratsammensetningen av gastrisk mucin lag.
Slimstoffer sterkt glykosylerte glykoproteiner som er hovedkomponentene slimete viskøs gel som dekker overflaten epitelvev [10]. Til dags dato, ni forskjellige epiteliale slimstoffgener (MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 6, 7, og 8) er blitt identifisert [11-21]. In situ
hybridisering og immunhistokjemiske studier har vist at disse slimstoffer er forskjellig uttrykt i epithelia med celletype spesifisitet [21-24]. Den normale mageslimhinnen viser celletyper bestemt uttrykk for MUC1, MUC5AC, og MUC6, med to første slimstoffer som finnes i overflateepitel og MUC6 i de dype kjertler [22, 25, 26]. MUC6 er hovedsakelig uttrykt i mageslimhinnen. Den normale mageslimhinne ikke uttrykker MUC2 [25, 27].
Endringer i ekspresjonsnivåer og glykosyleringsmønstre av slimstoffer har vært forbundet med flere sykdommer, inkludert karsinomer [27-31]. I magekreft, har endringer i slimstoff polypeptid blitt rapportert: tap av ekspresjon av MUC5AC [23, 26, 32], øket slimstoff heterogenesity [23]. Disse observasjoner tyder på at mucin endringer kan betraktes som "molekylære" markører av malign transformasjon av mageslimhinnen. Videre, en nylig publisert undersøkelse sterkt antydet MUC5AC som en antatt H. pylari
reseptor [33, 34].
I denne studien har vi preget mønster av slimstoffer uttrykk i de progressive stadier av H. pylori
infisert menneskelig magekreft. Vi har brukt en omfattende panel av monoklonale antistoffer, med godt karakteriserte særegenheter rettet mot MUC2, MUC5AC og MUC6 slimstoffer.
Resultater
Expression mønster av MUC2, MUC5AC og MUC6 slimstoffer i normal mageslimhinnen
MUC5AC var svært uttrykt i foveolar epitel og slimete hals celler av antrum (>. 75%, figur 1b fig. 3b, tabell 2). Ekspresjon av MUC6 ble påvist i kjertlene i antrum (mer enn 75%, fig 1c Fig. 3c;. Tabell 3) og MUC2 ble ikke detektert i normal gastrisk mucosa (figur 1a;. Fig. 3a, tabell 2). Figur 1 Immunhistokjemisk farging av MUC2, MUC5AC og MUC6 slimstoffer i H. pylori infiserte pasienter. en. MUC2 farging av normal mageslimhinnen (Original forstørrelse x 100). b. MUC5AC farging av normal mageslimhinnen (Original forstørrelse × 100). c. MUC6 farging av normal mageslimhinnen (Original forstørrelse x 100). d. MUC2 farging av atrofisk gastritt (Original forstørrelse x 100). e. MUC5AC farging av atrofisk gastritt (Original forstørrelse x 100). f. MUC6 farging av atrofisk gastritt (Original forstørrelse x 100). g. MUC2 farging av Intestinal metaplasi (Original forstørrelse x 100). h. MUC5AC farging av Intestinal metaplasi (Original forstørrelse x 100).
Figur 2 Immunhistokjemisk farging av MUC2, MUC5AC og MUC6 slimstoffer i H. pylori infiserte pasienter. en. MUC6 farging av Intestinal metaplasi (Original forstørrelse x 100). b. MUC2 farging av dysplasi (Original forstørrelse x 100). c. MUC5AC farging av dysplasi (Original forstørrelse × 100). d. MUC6 farging av dysplasi (Original forstørrelse x 100). e. MUC2 farging av karsinom (Original forstørrelse x 100). f. MUC5AC farging av karsinom (Original forstørrelse × 100). g. MUC6 farging av karsinom (Original forstørrelse x 100).
Figur 3 Expression mønster av slimstoffer (MUC2, MUC5AC og MUC6) i H. pylori infiserte pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelig gastrisk epitel. en. MUC2 uttrykk i H. pylori
smittet pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelig gastrisk epitel. b. MUC5AC uttrykk i H. pylori
infisert pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelig gastrisk epitel. c. MUC6 uttrykk i H. pylori
smittet pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelige mage epitel.
Tabell 1 Spesialitet, opprinnelse og fortynninger av monoklonale antistoffer.
monoklonalt antistoff
spesifisitet
Reference
fortynning
PMH1
MUC2
Reis et al product: [11]
Ufortynnet
CLH2
MUC5AC
Reis et al product: [12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al product: [10]
1: 2
Tabell 2 uttrykk av slimstoffer (MUC2, MUCSAC og MUC6) i H. pylori
infisert pre-neoplastiske og neoplastiske menneskelig gastrisk epitel
Stages

H. pylori
MUC2 Expression
MUC5AC Expression
MUC6 Expression
N
P -
+
++
+++
++++ -
+
++
+++
++++ -
+
+ +
+++
++++
Normal (n = 7)
7 -
n = 7 (100%) -
-
- -
-
- -
n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%) -
-
-
1 (14,3%)
6 (85,7%)
atrofisk gastritt (n = 26) -
26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%) -
- -
- -
1 (38%)
13 (50%)
12 (46,2%)
- -
1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
Intestinal metaplasi (n = 21) -
21
- -
n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) ** -
-
1 (4,8%)
16 ( 76,2%) **
fire (19%) -
-
5 (23,8%)
14 (66,7%) **
2 (9,5%)
-
dysplasi (n = 17) -
17 -
n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5,9 %) -
-
3 (17,6%)
10 (58,8%)
4 (23,5%) -
-
3 (17.6%)
11 (64,7%)
3 (17,3%) -
karsinom (n = 36) -
36 -
22 (61,1%)
14 (38,9%) -
- -
28 (77,8%)
8 (22,2%) -
-
12 (33,3% )
17 (47,2%)
7 (19,4%) -
-
N - negativ - (> 5%) negative
P - positive + (5-25%) få positive celler
n - Antall tilfeller ++ (25-50%) veldefinerte område
+++ (50- 75%) omfattende område farget
++++ (75-100%) de fleste av celler farget
** p < 0,00, * p < 0.05 (signifikant forskjell i uttrykk)
immundeteksjon av slimstoffer i atrofisk gastritt
Det var uttrykk for MUC5AC i alle tilfeller av søyle celler (fig 1e;. Fig. 3b, tabell 2). Prosentandelen av fargede celler varierte fra tilfelle til tilfelle, i de fleste tilfeller, det var en trend for høyere antall celler som uttrykker MUC5AC (mer enn 75%) i den overfladiske delen av metaplastiske kjertler enn i dype delen. MUC6 ble oppdaget i kolonneceller (> 50%, Fig. 1 f Fig. 3c, tabell 2) og MUC2 ble ikke påvist i atrofisk gastritt (fig 1d.)
Immundeteksjon av slimstoffer i tarm metaplasi
There. ble redusert nivå ekspresjon av MUC5AC og MUC6 i alle tilfeller (> 50%), som begge i beger og i søyle celler (fig 1 H, fig 2a;... fig. 3b, 3c fig, tabell 2). Prosentandelen av fargede celler varierte fra tilfelle til tilfelle, ble de novo
ekspresjon av intestinal mucin MUC2 observert (mer enn 75%), og dets ekspresjon vist en diffus cytoplasmatisk mønster i slimceller (figur 1 g;. Fig. 3a; . tabell 2)
immundeteksjon av slimstoffer i dysplasi
Det ble redusert nivå ekspresjon av MUC5AC og MUC6, enn intestinal metaplasi (mer enn 50%). MUC5AC og MUC6 vist en diffus cytoplasmatisk ekspresjon mønster i søyle celler (Fig 2c Fig. 2d Fig. 3d;. Fig. 3, tabell 2). MUC2 uttrykk vises en diffus cytoplasmatiske mønster i kopper celler (> 50%, figur 2b, Fig. 3a, tabell 2)
immundeteksjon av slimstoffer i carcinoma
MUC5AC og MUC6 uttrykk ble hyppig observert i begynnelsen av karsinom (>.; 50%) enn avanserte karsinom (> 25%). I avanserte karsinomer, observerte vi en trend for redusert immunoreaktivitets i dype områder enn i de overfladiske områder. MUC5AC og MUC6 uttrykk ble redusert i avanserte karsinomer (mer enn 25%, fig 3a Fig. 3b;. Fig. 3c Fig. 2e, figur 2f, Figur 2g;.. Tabell 2).
Diskusjon
i denne studien har vi vist at mønsteret av slimstoffer uttrykk i de progressive stadier av H. pylori
infisert menneskelig gastrisk epitel. Slimstoffer uttrykkes med en celle- og vevs-spesifikke mønster i normalt vev. Endringer i ekspresjon mønster av slimstoffer er blitt beskrevet i karsinomer, så vel som i deres forstadier; i de sistnevnte, endrede slimstoffkarbohydrat og peptid-grupper kan utgjøre molekylære markører for øket risiko for malign transformasjon [27, 35, 36, 38-40].
I overensstemmelse med tidligere undersøkelser rapporterer fordelingen av slimstoffer i normal mage, vi funnet MUC5AC er sterkt uttrykt i foveolar celler i antrum, som rapportert [26, 27, 32, 37-39]. Vi fant også at MUC6 er uttrykt i mukøse celler i halssonen i pyloriske kjertler i antrum med tilsvarende mønster som er beskrevet tidligere [22, 23, 47]. Ekspresjon av MUC2 ble vanligvis ikke detektert i normal gastrisk mucosa som beskrevet i de tidligere rapporter [25, 27, 40].
Intestinal metaplasi er en av de lesjoner som er identifisert i den kaskade av hendelsen som går forut for utviklingen av gastrisk karsinom [ ,,,0],41]. Intestinal metaplasi omfatter erstatning av den gastriske mucosa av et epitel som ligner histologisk tarmslimhinnen. Endrede slimstoffekspresjon mønstre er observert hos H. pylori
infisert intestinal metaplasi, også under uttrykk for MUC5AC og MUC6 og de novo
uttrykk for MUC2 meste i slimceller [30, 48]. Disse resultatene støtter antagelsen om at tarm metaplasi gjør representerer en differensiering av slimhinnen mot en tarm fenotype [42, 43].
Redusert uttrykk for MUC5AC og MUC6 mucin i mage karsinom ble bekreftet i denne studien. Ekspresjonen av MUC5AC tidlig magekreft av foreliggende serie, uavhengig av histologisk type tumorene, i kontrast til redusert nivå ekspresjon av MUC5AC immunreaktivitet i nesten halvparten av de avanserte karsinomer som tyder på at alle gastriske karsinomer beholde i det minste noen celler med en mage fenotype i løpet av de første trinnene av neoplastisk utvikling (26). Denne antakelsen er videre støttet av den reduserte immunoreaktivitets i dype områder sammenlignet med overfladiske områder av de avanserte karsinomer. Disse resultatene er i overensstemmelse med tidligere resultater som viser at magekreft progresjon ledsages av endring av ekspresjon av flere slimstoffgener [14]. Til slutt, observerte vi at tarm mucin MUC2 er uttrykt i hvert intestinal metaplasi, som er en lesjon som vises under prosessen av gastrisk karsinogenese i sammenheng med H. pylori
infiserte individer.
Konklusjon
Selv H . pylori
har blitt klassifisert som et klasse i karsinogen av IARC [4] mekanismen av magekreft fortsatt dårlig forstått. I pre-neoplastisk gastrisk mucosa, ble ekspresjonen av alle de tre slimstoffantigenene ikke synes å korrelere med graden av betennelse og H. pylori
status. Resultater fra denne studien kan tyde på at H. pylori
infeksjon fungerer som en initiativtaker til denne kreft kaskade ved å fremkalle betennelse og, i noen tilfeller, den påfølgende metaplastiske endringer. Intestinal metaplasi følges av induksjon av ekspresjon MUC2 og redusert ekspresjon av MUC5AC og MUC6. Disse endringene kan favorisere utviklingen av gastrisk karsinom. Den foreliggende undersøkelse viser at MUC2 er en markør for intestinal metaplasi og kan anvendes for tidlig påvisning av denne lesjon i H. pylori
infiserte pre-neoplastisk human gastrisk epitelium.
Materialer og metoder
vevsprøver
Femti ni mage biopsiprøver og 3 ml blod ble hentet fra Stanley medisinske universitet og sykehus, Chennai. Alle biopsi vevsprøver ble samlet etter informert samtykke. Denne studien ble gjennomført etter å ha fått klarering fra den etiske styret i sykehuset. Alle biopsiprøver ble fiksert i 10% bufret formalin, og rutinemessig innstøpt i parafin voks. 4 um tynne seriesnitt ble kuttet og anvendt for immunhistokjemi. H. pylori
infeksjon ble bekreftet av RUT og ELISA [43]. Hematoxylin og eosin farget snitt ble brukt til å klassifisere gastritt gradert i henhold til revidert Sydney klassifisering [44], mage svulster i henhold til klassifiseringen av Lauren [45] og WHO klassifisering [46]. Vi studerte 7 tilfeller av normal menneskelig gastrisk epitel (7 biopsier), 26 tilfeller av atrofisk gastritt (26 biopsier), 21 tilfeller av intestinal metaplasi (21 biopsier), 17 tilfeller av dysplasi (17 biopsier) og 36 tilfeller av carcinoma der 21 tilfeller tidlig karsinom og 15 tilfeller avansert karsinom (16 biopsier og 20 kirurgiske prøver).
monoklonale antistoffer, En panel av tre monoklonale antistoffer ble anvendt for å bestemme ekspresjon av slimstoffer (MUC2, MUC5AC og MUC6). Særegenheter, referanser og fortynninger av antistoffer er oppført i tabell 1.
immunhistokjemi
§§ fra normal, pre-neoplastiske og neoplastiske mage vev ble immun farget ifølge Reis et al product: [47] med små modifikasjoner . Seksjoner utformet for neuraminidase behandling ble vasket to ganger i fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4 og inkubert med neuraminidase fra Clostridium perfringens Type VI plakater (Sigma; St. Louis, MO) fortynnet i 0,1 M Na-acetat-buffer, pH 5,5 til en endelig konsentrasjon på 0,1 U /ml. Inkuberingen ble utført i 2 timer ved 37 ° C og ble etterfulgt av tre vaskinger i iskald PBS. Snittene ble behandlet med 0,5% H 2o 2 i metanol i 30 minutter, fulgt av 20 minutters inkubasjon med kanin-non-immunserum. Snittene ble skylt og inkubert med primært antistoff (tabell 1), over natten ved 4 ° C. Seksjonene ble skylt og inkubert med HRP conjucated kanin-anti-muse-sekundært antistoff (1: 100 fortynning) i 1 time, etterfulgt av skylling med PBS og utviklet med 0,05% 3,3'-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) (SRL, Mumbai, India ) nylaget i PBS som inneholder 0,1% H 2o 2. Seksjoner ble teller farget med hematoxylin, dehydrert, og montert. Alle serier som positive og negative kontroller ble utført ved substitusjon av de primære mAb med immunoglobuliner av samme klasse og ved samme konsentrasjon.
Skårer for slimstoffer ekspresjon i H. pylori
infisert pre-neoplastiske og neoplastiske humane gastriske vev
En semi kvantitativ tilnærming ble brukt til å score det farging av menneskelige mage vev. Platene ble undersøkt under lysmikroskop, ble hver 100 celler mottok fem ulike felt, og resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlig prosent. (-), Negativ; +, få positive celler (< 25%); ++ Veldefinerte områder med positive celler (25-50%); +++, store områder med positive celler (50-75%); ++++, de fleste celler farget (> 75%).
statistikker og dataanalyse ble utført ved hjelp av statistisk programvare SPSS 10.0 for Windows. The Chi-Square test eller Fishers eksakte test ble brukt til å analysere forskjeller i frekvenser. Spearmans korrelasjon test ble brukt til å analysere korrelasjon mellom parametrene. P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Forkortelser
DAB - 3:.
3'-diaminobenzidin tetra hydrochloride
ELISA:
Enzyme-linked immunosorbent analysen
HRP:
Pepperrotperoksidase
IARC:
International Agency for Research on Cancer

IM:
Intestinal metaplasi
mAbs:
Monoklonale antistoffer
PBS:
Fosfatbufret saltvann
WHO:
World Health Organization
RUT.
Rapid Urea Test

Erklæringer
Takk
forfatterne takke Lady Tata Memorial Trust, Mumbai, India for økonomisk støtte til en av forfatterne S. Durai Babu. Vi takknemlig til Dr. Narasimhan, professor og leder, Avdeling for patologi, Sri Ramachandra medisinske universitet og sykehus, India, for gjennomgang av histologiske og immunhistokjemiske resultater og Dr. R. Ravanan, Leser, Department of Statistics, Presidemcy College, India for å hjelpe i statistisk analyse. Vi ønsker å takke dr Celso A. Reis for bestemmelse av anti-MUC2, anti-MUC5AC og anti-MUC6 monoklonale antistoffer.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatterne ' opprinnelige innsendt filer for bilder. 12943_2005_142_MOESM1_ESM.doc Forfatteroriginalfilen for figur 1 12943_2005_142_MOESM2_ESM.doc Forfatteroriginalfilen for figur 2 12943_2005_142_MOESM3_ESM.doc Forfatteroriginalfilen for figur 3 12943_2005_142_MOESM4_ESM.doc Forfatteroriginalfilen for figur 4 12943_2005_142_MOESM5_ESM.doc Forfatteroriginalfilen for figur 5

• Forskjeller i mage kreft genekspresjonssignaturer avledet fra laser capture mikrodisseksjon versushistologic macrodissection
• Airway cellularity, lipid laden makrofager og mikrobiologi av magesyren og luftveiene hos barn med refluksøsofagitt