Perfil de expressão de mucinas (MUC2, MUC5AC e MUC6) em Helicobacter pylori infectadas pré-neoplásicas e neoplásicas epitélio gástrico humano

perfil de expressão de mucinas (MUC2, MUC5AC e MUC6) em Helicobacter pylori
infectado pré-neoplásicas e epitélio gástrico humano neoplásica da arte abstracta
Fundo
Helicobacter pylori
(H. pylori
) provoca gastrite e metaplasia intestinal (IM), que pode evoluir para carcinoma gástrico. O objetivo deste estudo foi comparar o perfil de mucinas nos estágios progressivos de H. pylori
epitélio gástrico humano pré-neoplásicas e neoplásicas infectado. Foi utilizado um painel de anticorpos monoclonais com especificidades bem definidas de MUC2, MUC5AC e MUC6 caracterizar o padrão de mucinas expressão por imuno-histoquímica.
Métodos
RUT e ELISA foram para H. pylori
confirmação. seções de biópsia gástrica humanos foram coradas por imuno-histoquímica com MUC2, MUC5AC e anticorpos MUC6.
Resultados
MUC5AC foi expressa no epitélio superficial e na parte superior dos poços gástricos. MUC6 expressão foi detectada na parte inferior das glândulas gástricas. MUC2 foi expressa em metaplasia intestinal, principalmente nas células caliciformes. epitélio gástrico humano O perfil de expressão de mucina nas etapas progressivas de H. pylori
infectadas permite a identificação de metaplasia intestinal, que é caracterizada por uma diminuição da expressão das mucinas gástricas (MUC5AC e MUC6) e de novo
de expressão MUC2.
conclusão
em conclusão, os nossos resultados sugerem que não é alterada expressão de MUC5AC e MUC6 juntamente com a expressão aberrante de MUC2 na metaplasia intestinal, durante o processo de carcinogênese gástrica. O presente estudo indica que o padrão de expressão de mucina MUC2 é um marcador confiável de metaplasia intestinal, que aparece no contexto de H. pylori indivíduos infectados
.
Fundo
Helicobacter pylori
coloniza mucosa gástrica humana e provoca gastrite e metaplasia intestinal (IM), que pode evoluir para carcinoma gástrico [1-3]. A infecção por H. pylori
foi estabelecido como um tipo I carcinógeno humano em IARC [4]; Recentemente, foi demonstrado que as bactérias são também capazes de induzir gastrite, IM, e carcinoma gástrico em gerbilos mongóis [5-8]. Nos seres humanos, H. pylori coloniza
também a mucosa duodenal sempre que houver metaplasia gástrica [9]. H. pylori
infecção em seres humanos é, por conseguinte, dependente do microambiente gástrico, o qual é determinado em grande parte pela composição de mucina e de hidratos de carbono da camada de mucina gástrica.
As mucinas são glicoproteínas altamente glicosiladas que são os principais componentes de o gel viscoso mucosa que cobre os tecidos epiteliais superficiais [10]. Até à data, nove genes de mucina epitelial MUC1 (distintos, 2, 3, 4, 5AC, 5b, 6, 7, e 8) foram identificados [11-21]. In situ
hibridação e estudos de imuno-histoquímica têm demonstrado que estes mucinas são diferencialmente expressos em epitélios com tipo de célula especificidade [21-24]. A mucosa gástrica normal de tipos de células mostra a expressão específica de MUC-1, MUC5AC, e MUC6, com duas primeiras mucinas encontrada no epitélio superficial e MUC6 nas glândulas profundas [22, 25, 26]. MUC6 é expressa principalmente na mucosa gástrica. A mucosa gástrica normal não expressem MUC2 [25, 27].
Mudanças nos níveis de expressão e padrões de glicosilação de mucinas têm sido associadas com várias doenças, incluindo carcinomas [27-31]. No cancro gástrico, alterações no polipéptido de mucina foram relatados: perda de expressão de MUC5AC [23, 26, 32], aumentou mucina heterogenesity [23]. Estas observações sugerem que as alterações de mucina pode ser considerado como "marcadores" moleculares de transformação maligna da mucosa gástrica. Ainda mais, uma investigação publicada recentemente sugeriu fortemente MUC5AC como receptor de um putativo H. pylari
[33, 34].
No presente estudo, caracterizamos o padrão de expressão mucinas nos estágios progressivos de H. pylori
infectados carcinoma gástrico humano. Temos usado um amplo painel de anticorpos monoclonais, com especificidades bem caracterizadas voltadas para MUC2, MUC5AC e MUC6 mucinas.
Resultados
Padrão de expressão de MUC2, MUC5AC e MUC6 mucinas na mucosa gástrica normal,
MUC5AC foi altamente expresso no epitélio foveolar e células mucosas do colo do antro (>.% 75, Fig 1B; Fig. 3b; Tabela 2). Expressão de MUC6 foi detectada nas glândulas do antro (> 75%, Figura 1c; A Fig. 3C;. Tabela 3) e MUC2 não foi detectada na mucosa gástrica normal (figura 1a;. A Fig. 3a; Tabela 2). A Figura 1 coloração imuno-histoquímica de mucinas MUC2, MUC5AC e MUC6 em H. pylori pacientes infectados. uma. MUC2 coloração da mucosa gástrica normal (Ampliação original x 100). b. MUC5AC coloração da mucosa gástrica normal (ampliação original × 100). c. MUC6 coloração da mucosa gástrica normal (Ampliação original x 100). d. coloração de MUC2 Gastrite atrófica (Ampliação original x 100). e. coloração de MUC5AC de gastrite atrófica (Ampliação original x 100). f. coloração MUC6 de gastrite atrófica (Ampliação original x 100). g. coloração de MUC2 metaplasia intestinal (Ampliação original x 100). h. MUC5AC coloração intestinal metaplasia (ampliação original × 100).
Figura 2 imuno-coloração de MUC2, MUC5AC e MUC6 mucinas em H. pylori pacientes infectados. uma. coloração MUC6 de metaplasia intestinal (Ampliação original x 100). b. coloração MUC2 de displasia (Ampliação original x 100). c. coloração de MUC5AC de displasia (ampliação original × 100). d. coloração MUC6 de displasia (Ampliação original x 100). e. coloração MUC2 de carcinoma (Ampliação original x 100). f. coloração de MUC5AC de carcinoma (ampliação original × 100). g. coloração MUC6 de carcinoma (Ampliação original x 100).
Figura 3 Padrão de expressão de mucinas (MUC2, MUC5AC e MUC6) em H. pylori infectadas pré-neoplásicas e neoplásicas epitélio gástrico humano. uma. MUC2 expressão em H. pylori
infectadas pré-neoplásicas e neoplásicas epitélio gástrico humano. b. expressão de MUC5AC em H. pylori
epitélio gástrico humano pré-neoplásicas e neoplásicas infectadas. c. expressão MUC6 em H. pylori
infectado pré-neoplásicas e epitélio gástrico humano neoplásica.
Tabela 1 Especificidades, origens e diluições dos anticorpos monoclonais.
Monoclonal anticorpo
Especificidade
Referência
diluição
PMH1
MUC2
Reis et al
[11]
Undiluted
CLH2
MUC5AC
Reis et al
[12]
1: 2
CLH5
MUC6
Reis et al
[10]
1: 2
Tabela 2 Expressão de mucinas (MUC2, MUCSAC e MUC6) em H. pylori
infectado pré-neoplásicas e neoplásicas humanas epitélio gástrico
Stages

H. pylori
MUC2 Expressão
MUC5AC Expressão
Expressão MUC6
N
P
- +
++
+++
++++
- +
++
+++
++++
- +
+ +
+++
++++
normal (n = 7)
7
- n = 7 (100%)
- -
- Restaurant -
- -
- n = 2 (28,6%)
n = 5 (71,4%) Restaurant -
- -
1 (14,3%)
6 (85,7%)
gastrite atrófica (n = 26)
- 26
n = 22 (84,6%)
n = 4 (15,4%)
- -
- -
- 1 (38%)
13 (50%)
12 (46,2%)
-
- 1 (3,8%)
15 (57,7%)
10 (38,5%)
metaplasia intestinal (n = 21)
- 21
-
- n = 9 (42,9%)
n = 12 (57,1%) ** Restaurant -
- 1 (4,8%)
16 ( 76,2%) ** página 4 (19%) Restaurant -
- 5 (23,8%)
14 (66,7%) ** Página 2 (9,5%)
-
displasia (n = 17)
- 17
- n = 5 (29,4%)
n = 11 (64,7%)
n = 1 (5,9 %) Restaurant -
- 3 (17,6%)
10 (58,8%) página 4 (23,5%) Restaurant -
- 3 (17,6%)
11 (64,7%) Sims 3 (17,3%)
- Carcinoma (n = 36)
- 36
- 22 (61,1%)
14 (38,9%)
- -
- 28 (77,8%)
8 (22,2%) Restaurant -
- 12 (33,3% )
17 (47,2%)
7 (19,4%) Restaurant -
- N - negativa - (> 5%)
negativo P - positiva + (5-25%) poucas células positivas
n - Número de casos ++ (25-50%) bem definidos área
+++ (50- 75%) extensa área manchada
++++ (75-100%) a maior parte das células coradas
** p < 0,00, * p < 0,05 (diferença significativa da expressão)
imunodetecção de mucinas em gastrite atrófica
Houve expressão de MUC5AC em todos os casos de células colunares (Fig 1E;. A Fig. 3b; Tabela 2). A percentagem de células coradas variaram de caso para caso, na maioria dos casos, houve uma tendência para o aumento do número de células que expressam de MUC5AC (> 75%) na parte superficial das glândulas metaplásicas que na parte profunda. MUC6 foi detectada em células colunares (> 50%; Fig. 1f, Fig. 3C; Tabela 2) e MUC2 não foi detectada em gastrite atrófica (Figura 1D).
Imunodetecção de mucinas em metaplasia intestinal
Há. foi a diminuição da expressão de nível de MUC5AC e MUC6 em todos os casos (> 50%), ambos na taça e nas células colunares (Fig 1H, Figura 2a;... a Fig. 3b, Fig 3c; Tabela 2). A percentagem de células coradas variaram de caso para caso, foi observada de novo
expressão de mucina intestinal MUC2 (> 75%), e sua expressão mostrou um padrão citoplasmático difuso nas células caliciformes (Fig 1g;. A Fig. 3a; . tabela 2)
imunodetecção de mucinas em displasia
houve diminuição da expressão de nível de MUC5AC e MUC6, do que a metaplasia intestinal (> 50%). MUC5AC e MUC6 apresentado um padrão de expressão citoplasmática difusa em células colunares (Figura 2c; A Fig. 2d, Fig. 3d;. A Fig. 3, Tabela 2). expressão MUC2 exibido um padrão citoplasmático difuso em células cálices (> 50%, Fig 2b; A Fig. 3a; Tabela 2)
imunodetecção de mucinas no carcinoma
MUC5AC e expressão MUC6 foram frequentemente observados em carcinoma precoce (>.; 50%) de carcinomas avançados (> 25%). Em carcinomas avançados, observou-se uma tendência para a diminuição da imunorreactividade em áreas profundamente do que nas áreas superficiais. expressões MUC5AC e MUC6 foram reduzidos em carcinomas avançados (> 25%; figura 3a; A Fig. 3-B;. A Fig. 3C; A Fig. 2e, Fig 2f, 2g fig;.. Tabela 2). Discussão
no presente estudo, demonstrámos que o padrão de expressão de mucinas nos estágios progressivos da H. pylori
epitélio gástrico humano infectado. As mucinas são expressos com um padrão de células e específicos de tecido no tecido normal. Alterações do padrão de expressão de mucinas têm sido descritas em carcinomas, bem como nas suas lesões precursoras; no segundo, alterados mucina carboidratos e peptídeos porções podem constituir marcadores moleculares de aumento do risco de transformação maligna [27, 35, 36, 38-40].
De acordo com estudos anteriores relatando a distribuição de mucinas no estômago normal, encontrado MUC5AC é altamente expresso em células de foveolares antro, como relatado [26, 27, 32, 37-39]. Nós também descobrimos que MUC6 é expresso em células mucosas da zona do pescoço em glândulas pilórica do antro com um padrão semelhante ao descrito anteriormente [22, 23, 47]. A expressão de MUC2 geralmente não foi detectada na mucosa gástrica normal, tal como descrito nos relatórios anteriores [25, 27, 40].
Metaplasia intestinal é uma das lesões identificadas na cascata de eventos que precede o desenvolvimento de carcinoma gástrico [ ,,,0],41]. A metaplasia intestinal compreende a substituição da mucosa gástrica por um epitélio que se assemelha histologicamente a mucosa intestinal. padrões de expressão de mucina alterados foram observados em H. pylori
metaplasia intestinal infectada, incluindo sob a expressão de MUC5AC e MUC6 e de novo
expressão de MUC2 principalmente em células caliciformes [30, 48]. Estes resultados suportam a hipótese de que o metaplasia intestinal não representa uma diferenciação da mucosa em direção a um fenótipo intestinal [42, 43].
A expressão diminuída de MUC5AC e MUC6 mucina em carcinomas gástricos foram confirmados no presente estudo. A expressão de MUC5AC no carcinoma gástrico precoce da presente série, independentemente do tipo histológico dos tumores, contrasta com a expressão de diminuição do nível de MUC5AC imunorreactividade em quase metade dos carcinomas avançados que sugerem que todos os carcinomas gástricos reter pelo menos algumas células com um fenótipo gástrica durante os primeiros passos do desenvolvimento neoplásico (26). Esta suposição é ainda apoiada pela imunorreactividade diminuída nas zonas profundas em comparação com as áreas superficiais dos carcinomas avançados. Estes resultados estão de acordo com resultados anteriores que mostram que a progressão do cancro gástrico é acompanhada por alterações da expressão de vários genes de mucina [14]. Finalmente, observamos que o intestinal mucina MUC2 é expressa em todos os metaplasia intestinal, que é uma lesão que aparece durante o processo de carcinogênese gástrica no contexto da H. pylori indivíduos infectados
.
Conclusão
Embora H . pylori
foi classificado como classe I carcinogéneo pela IARC [4], o mecanismo de carcinogênese gástrica permanece mal compreendido. Na mucosa gástrica pré-neoplásicas, a expressão de todos os três antigénios de mucina não pareceu correlacionar-se com a gravidade da inflamação e H. pylori
estado. Os resultados do presente estudo sugerem que pode H. pylori
infecção actua como um iniciador da carcinogénese esta cascata através da indução de inflamação e, em alguns casos, a mudança subsequente metaplásico. A metaplasia intestinal é acompanhada pela indução da expressão de MUC2 e a diminuição da expressão de MUC5AC e MUC6. Estas alterações podem favorecer o desenvolvimento de carcinoma gástrico. O presente estudo sugere que MUC2 é um marcador de metaplasia intestinal e pode ser utilizado para a detecção precoce da lesão em H. pylori
infectado epitélio gástrico humano pré-neoplásico.
Materiais e métodos
amostras de tecidos
Cinquenta e nove amostras de biópsia gástrica e 3 ml de sangue foram obtidas a partir de Stanley Medical College e Hospital, Chennai. Todas as amostras de tecido de biópsia foram coletados após consentimento informado. Este estudo foi realizado após a obtenção de autorização do conselho de ética do hospital. Todas as amostras de biópsia foram fixadas em formalina a 10% tamponada e rotineiramente embebido em cera de parafina. 4 uM secções em série foram cortadas finas e utilizado para imuno-histoquímica. A infecção por H. pylori
foi confirmada por RUT e ELISA [43]. Hematoxilina e eosina seções foram usados ​​para classificar gastrite classificados de acordo com a classificação Sydney revisto [44], tumores gástricos de acordo com a classificação de Lauren [45] e classificação OMS [46]. Foram estudados 7 casos de epitélio gástrico humano normal (7 biópsias), 26 casos de Gastrite atrófica (26 biópsias), 21 casos de Intestinal metaplasia (21 biópsias), 17 casos de displasia (17 biópsias) e 36 casos de carcinoma in quais 21 casos de carcinoma precoce e 15 casos avançados de carcinoma (16 biópsias e 20 espécimes cirúrgicos). os anticorpos monoclonais
Um painel de três anticorpos monoclonais foi utilizado para determinar a expressão de mucinas (MUC2, MUC5AC e MUC6). As especificidades, referências e diluições dos anticorpos estão listadas na Tabela 1.
Imuno-histoquímica
secções de tecidos gástricos normais, pré-neoplásicas e neoplásicas foram imuno manchado de acordo com Reis et al
[47] com ligeiras modificações . Secções concebidos para tratamento com neuraminidase foram lavadas duas vezes em tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4 e incubadas com neuraminidase do Clostridium perfringens Tipo VI
(Sigma; St Louis, MO) diluído em tampão 0,1 M Na-acetato, pH 5,5 a uma concentração final de 0,1 U /ml. A incubação foi realizada durante 2 h a 37 ° C e foi seguido por três lavagens em PBS arrefecido com gelo. As secções foram tratadas com 0,5% H 2O 2 em metanol durante 30 min, seguido por 20 min de incubação com o soro de coelho não-imune. As secções foram lavadas e incubadas com anticorpo primário (Tabela 1), durante a noite a 4 ° C. As secções foram lavadas e incubadas com HRP conjucated coelho anti-rato de anticorpo secundário (diluição 1: 100) durante 1 h, seguido de lavagem com PBS e desenvolvimento com 0,05% de 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) (SRL, Mumbai, índia ), recentemente preparada em PBS contendo 0,1% de H 2O 2. As secções foram contra-coradas com hematoxilina, desidratadas, e montado. Todas as séries incluindo os controlos positivos e negativos foram realizados por substituição dos mAbs primários com imunoglobulinas da mesma classe e na mesma concentração.
Pontuação da expressão mucinas em H. pylori
infectado tecidos gástricos humanos pré-neoplásicas e neoplásicas
a abordagem quantitativa semi foi usado para marcar o imunocoloração dos tecidos gástricos humanos. As lâminas foram examinadas em microscópio de luz, a cada 100 células foram marcados em cinco campos diferentes e os resultados foram expressos em porcentagem média. (-), Negativo; +, poucas células positivas (< 25%); ++ Áreas bem definidas com células positivas (25-50%); +++, áreas extensas com células positivas (50-75%); ++++, a maioria das células coradas (> 75%). estatísticas
A análise dos dados foi realizada utilizando software estatístico SPSS 10.0 para Windows. O teste Qui-quadrado ou teste exato de Fisher foi utilizado para analisar as diferenças de frequências. teste de correlação de Spearman foi utilizado para analisar correlação entre parâmetros. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
abreviações
DAB - 3:.
Cloridrato de tetra 3'-diaminobenzidina
ELISA:
imunoenzimático ensaio
HRP:
Horseradish peroxidase
IARC:
Agência Internacional de Investigação do Cancro

IM:
metaplasia intestinal
mAbs:
anticorpos monoclonais
PBS:
fosfato tamponada salina
QUEM:
Organização Mundial de Saúde
RUT:.
rápida Urea Teste

Declarações
Agradecimentos
os autores agradecem a Senhora Tata Memorial Trust, Mumbai, Índia para o apoio financeiro a um dos autores S. Durai Babu. Nós grato ao Dr. Narasimhan, Professor e Chefe do Departamento de Patologia, Sri Ramachandra Medical College and Hospital, na Índia, para analisar os resultados histológicos e imuno-histoquímico e Dr. R. Ravanan, leitor, do Departamento de Estatística, Presidemcy College, na Índia para ajudar na análise estatística. Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Celso A. Reis para a prestação do anti-MUC2, anti-MUC5AC e anticorpos monoclonais anti-MUC6. 'Arquivos enviados originais para imagens
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