Promijenjena ekspresija navodni predak stanica marker DCAMKL1 u želučane sluznice štakora u obnovi, metaplazije i displazije

Promijenjena ekspresija potencijalnog progenitor stanica marker DCAMKL1 u sluznicu želuca štakora u regeneraciju, metaplazijama i displaziju
apstraktna pregled pozadini
Doublecortin i kalcij /kalmodulin ovisna protein kinaze nalik-1 (DCAMKL1) je kandidat marker za progenitor stanica u mukozi gastrointestinalnog sustava. Lineage stanice sluznice želuca izvedeni iz ishodišnih stanica, ali taj proces se može mijenjati nakon ozljede. Stoga, istraživao se DCAMKL1 ekspresije pod patološkim uvjetima.
Methods
imunohistokemijskom Analiza je izvedena u želucu štakora sa akutnom površne ozljede, kronične ulkusa, intestinalne metaplazijama i displazija. Pregled Rezultati
DCAMKL1 isključivo je izražen u nezrele mirnim stanicama u prevlaci normalnih fundusnih žlijezda, gdje su mogući sljedeći ishodišne ​​stanice su mislili da žive. DCAMKL1-pozitivne stanice i proliferacija stanica bacaju u lumen, nakon površinski ozljede i ponovno pojavila u regenerativnog procesa, uglavnom u površinskom sluznici. U najnižoj sluznice oko aktivnog ulkusa, parijetalni i glavnih stanica smanjena, foveolar hiperplazija bila je očita, a trolist faktor obitelj 2 (TFF2) /spazmolitik polipeptid-izražavanje Metaplazija (SPEM) nastao na bazi žlijezda. DCAMKL1 stanice ponovno pojavila u duboko sluznici jedan pored drugog s SPEM i proliferacijom stanica. U ozdravljenja čira je TFF2 stanična populacija proširila i činilo se da redifferentiate na glavnim stanicama, dok proliferacija stanica i DCAMKL1 stanice se pojavila iznad i ispod TFF2 stanicama za promicanje liječenje. SPEM pojavio i PCNA stanice povećao u intestinalized sluznice, a DCAMKL1 je izražen u blizinu PCNA stanica u dubokoj sluznice. DCAMKL1, PCNA i TFF2 su izraženi u različitim displazije stanica sluznice dilatirane žlijezde blizu SPEM. Pregled Zaključak pregled ultrastrukturnoj pojave DCAMKL1-pozitivnih stanica i ekspresije uzorcima DCAMKL1 u normalnim i patološkim stanjima pokazuju da stanice pripadaju stanovništvo praotac stanica. DCAMKL1 izraz usko je povezana s TFF2 /SPEM stanice nakon ozljede. DCAMKL1 stanice repopulate blizu proliferacijom, hiperplastičnih, metaplastičnim i displazije stanica i rodonačelnika zona pomiče prema patološkim okolnostima. Pregled Pozadina pregled mišem i ljudskog želuca jedinice pokazuje monoklonskih pretvorbu, što ukazuje na prisutnost multipotentnih matičnih stanica [ ,,,0],1, 2]. Mikroskopske Autoradiografija u miša, podrazumijevale da granula bez stanice u prevlaci djeluju kao multipotentnih matičnih stanica [3]. Diferencijaciju i migracijskim procesima staničnih loza može mijenjati ozljede. Rodonačelnika stanica zona u prevlaci se lako mogu oštetiti intraluminalna etanol, nesteroidnim protuupalnim lijekovima ili Helicobacter pylori
(H. pylori pregled). Kronična upala želuca može dovesti do atrofije i specijalizirane gubitak stanica kao opipljivih učinaka ozljeda progenitor stanica tkivno specifični gubitka. Međutim, ponašanje nezrelih stanica nakon akutnog ili kroničnog sluznice oštećenja i mehanizma obnove tih stanica tijekom regeneracije sluznice nisu dobro razumjeli.
Praotac stanica populacije je važno u održavanju i regeneraciji želučanog epitela, ali long živjeli ishodišne ​​stanice su u opasnosti od gomilanja mutacija koje dovode do raka. [4] Neoplazija mogu pratiti mobilne metaplazije zbog kronične upale i popravak. Međutim, precizna analiza uloge i promjenama nezrelih stanica u slijedu gastritis-metaplazije-displazije karcinoma nije provedena, uglavnom zbog nedostatka diskretnih praotac stanica markera u želucu. Pregled Musashi-1, markera prekurzorskih stanica u tankom crijevu miša, nije izražen u pretpostavljenim ishodišnih stanica, ali se nalazi u parietalnim stanicama u fundusa prevlake štakora [5]. Villin-1 promotor /pojačivač fragment je marker mogućih želučanih nezrelih stanica u prevlaci od pilorusa žlijezda [6]. Loze Studija je pokazala da je crijevna praotac stanica marker Lgr5 je izražena na bazi potencijalnih fundusnih i pilorusa žlijezda u neonatalnoj želucu, dok izraz u odrasloj uglavnom bila ograničena na osnovu pilorusa žlijezde [7]. Prema tome, postoji čvrsti markeri za progenitora u odraslih fundusnih žlijezda.
DCAMKL1 jedan od produkata Gene ontogeneza obogaćen transkripata nalaze u usporedbi s mišjim želuca i tankog crijeva prekurzorskih skupova podataka. [8] Imunohistokemijska analiza pomoću DCAMKL1 antitijela pokazala jedna stanica bojanje u crijevnih isječaka kripti na ili u blizini poziciji 4 i na prevlaci stanicama želuca [8]. Nakon prvog izvješća, specifična lokalizacija DCAMKL1-izražavanje stanice u matičnih stanica niša je prikazan u tankom crijevu miševa [9, 10] te u debelom crijevu miševa i ljudi [11, 12], dok DCAMKL1 je coexpressed s Musashi -1 u parijetalni stanice u želucu miševa [13].
prvi cilj ovog istraživanja bio je utvrditi da li DCAMKL1 je marker za nezrelih stanica u želucu štakora. Drugi cilj je bio da se objasne vremenske i prostorne uzorke izgledu stanica specifično izražavaju DCAMKL1 u nekoliko želučane patoloških stanja.
Metode pregled Priprema životinja
Svi protokoli životinja su odobreni od strane Animal Research odbora Keio sveučilištu. Mužjaci Wistar štakora težine 200 g su izgladnjivani 24 sati, uz slobodan pristup vodi. Do produkcije akutnog površne ozljede u fundusa sluznice, apsolutnim etanolom (1 ml) se ubaci u želudac, želuca uvlačenja. Za proizvodnju kronične dubokih čireva, 20% octene kiseline (50 ul) se injicira u fundusa submukozu od prednjeg zida pomoću microsyringe. Štakori su eutanazirani 3 dana i 1, 2 i 3 tjedna nakon injekcije octene kiseline.
Metodu za induciranje crijevnu metaplazije u sluznici želuca štakora opisano na drugom mjestu [14, 15]. Ukratko, štakori su primili dvije doze X-zraka 10 Gy svaki i se žrtvuje 6 mjeseci nakon ozračivanja. Postupak za induciranje displazija u sluznici želuca štakora također je opisano na drugom mjestu [14]. Ukratko, 50 ug /ml N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) je dan štakorima ad libitum
4 mjeseca. Pregled antitijela
zec anti-DCAMKL1 imunoglobulina (Ig) G (Abcam, Cambridge, Velika Britanija, završno razrjeđenje 1: 100), miš anti-razmnožavanje stanica nuklearni antigen (PCNA) IgG (DAKO, Carpinteria, CA, spreman za korištenje), zečji anti -PCNA IgG (Abcam 1: 200), miš anti-H + /K + - adenozin trifosfataze (ATPaze) a podjedinica IgG (Research Diagnostics Inc. Flanders, NJ, 1: 200), ovčji anti -pepsinogen II IgG (United States Biological, Swampscott, MA; 1: 100), mišjim anti-MUC6 IgM (Kanto Kagaku, Tokyo, 1: 100), mišjim anti-IgG MUC5AC (Abcam; 1: 100), mišji anti TFF2 IgM (Abcam; 1: 200), zamorac anti-histidin dekarboksilaze (HDC) IgG (ARP, Belmont, MA; 1: 100), kozjim anti-grelin IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1: 100 ) i mišjim anti-IgG somatostatin (Biomeda, Foster City, CA; 1,25) su korišteni kao primarnim antitijelima
Histološka analiza
želuca tkivo je fiksirano u 10% neutralno puferiranom formalinu tijekom noći, a zatim. uronjeni u parafin i reže (4 m). Sekcije su označene s hematoksilinom i eozinom (H &E) primjenom standardnih tehnika. Perjodna kiselina-Schiff (PAS) -Alcian Blue bojanjem kako bi se otkrio mukoznih staničnih loza.
Za imunohistokemijsku analizu, sekcije parafin uklopljenih su deparafmizirani i obrađen s odgovarajućim postupkom pohrane za svaki antigen. Rezovi su inkubirani u 0,3% H <2O sub> 2 u metanolu tijekom 10 minuta da se inaktivira endogene peroksidaze, a zatim ispere s fosfatnim puferom u fiziološkoj otopini (PBS) koja sadrži 0,1% Tween 20 (PBST). Nakon inkubacije s otopinom za blokiranje (blok Ace, Dainippon Seivaku, Tokyo, Japan), 10 minuta, sekcije su inkubirane s primarnim protutijelom tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, svaki korak, uslijedilo je ispiranje 3 puta s PBST 3 minute. Sekcije su inkubirane s HP-konjugiranim IgG ili IgM za 40 minuta. Obilježene stanice su smeđe boje s 3,3'-diaminobenzidin hidroklorida (DAB), koristeći set DAB reagensa (Dako), a zatim Mayerovim hematoksilinom.
Za dvostruko imunološkim bojanjem, posredni metoda immunoalkaline fosfataza je korištena sljedeća postupak posredni imunoperoksidaznog gore opisano. Nakon reakcije s DAB, sekcije su inkubirane s drugim primarnim protutijelom tijekom 1 sata, nakon čega slijedi inkubacija sa ALP-konjugirano IgG ili IgM za 40 minuta. Obilježene stanice su obojene plavo s ALP supstrata kit III (Vector Blue, Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Za pronalaženje antigena od pepsinogen II i MUC6, proteinaza K (DAKO) se topički nanosi na deparafmizirani sekcije za 6 min. Za dohvat antigena od PCNA (IgG-om), sekcije su grije se u destiliranoj vodi u autoklavu 10 minuta. Za dohvat antigen MUC5AC, sekcije se griju u citratnom puferu u autoklavu 10 minuta. Ne postupak dohvat antigen koristi za DCAMKL1, H + /K + -. ATPaze, PCNA (zečje IgG), TFF2, HDC, grelin ili somatostatin bojenje pregled bodovanje DCAMKL1 stanica i PCNA stanicama
Sekcije koje su pretrpjele imunobojanje dvostruko boja pomoću DCAMKL1 i PCNA su analizirani kako bi se odredio broj imunobojenih stanica. Sekcije su korišteni od 5 štakora, a 10 dobro orijentirani želučani jedinice analizirani su u svakom dijelu. Pregled, elektronska mikroskopija pregled Pre-ugradnja imunoperoksidaznog elektronskim mikroskopom provedeno je kako slijedi. Male komadiće svježih uzoraka iz želuca korpus netretiranih štakora su fiksirane u 4% paraformaldehidu tokom 24 sata, nakon čega slijedi fiksacija u 0.1% glutaraldehidu i 4% paraformaldehid kroz 1 sat. Kriostatske sekcije (6 um) su pripremljeni i inkubirane s anti-antitijelo DCAMKL1 48 sati, nakon čega slijedi inkubacija sa HP-konjugiranim anti-zečjim IgG tijekom 24 sata. Sekcije su zatim fiksirane s 0.5% glutaraldehidom kroz 5 minuta, reagira s DAB, post-fiksirane s 2% osmijevu tetroksidu, dehidriraju kroz serijama gradiranog etanola i ugrađen u epoksidne smole. Veoma tanki rezovi su s ultramikrotom i obojeni u uranyl acetata i dovesti citrata rješenje. Uzorci su ispitani pomoću prijenosnog elektronskim mikroskopom (JEM-1200EX, Joel, Tokyo, Japan).

• Gen smanjenje posljedica kromosomskih gubitaka otkrivenih u želučanom cancers
• Serološki procjena želučane sluznice atrofije u želučanom cancer