Meccanismi di gastroprotezione di estratto metanolo di Melastoma malabathricum lascia

Meccanismi di gastroprotezione di estratto metanolo di Melastoma malabathricum
lascia
Abstract
sfondo
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) è un piccolo arbusto con i vari usi medicinali. Il presente studio è stato condotto per determinare i meccanismi gastroprotettori di estratto metanolo di M. malabathricum
foglie (MEMM) nei ratti.
Metodi
meccanismi del estratto di gastroprotezione (50, 250, 500 mg /kg) sono stati studiati utilizzando piloro-legatura in modello di ratto in cui il volume, pH, libera e acidità totale del succo gastrico, e il contenuto parete muco gastrico sono stati determinati. Il coinvolgimento dei composti endogeni ossido nitrico (NO) e sulfidrilici (SH) nell'effetto gastroprotettiva di MEMM sono stati misurati. MEMM è stato sottoposto alla antiossidanti, anti-infiammatori e fitochimica analisi e profiling HPLC
. Risultati
MEMM contenevano vari fito-costituenti con quercitrina essere identificato come parte di essi. MEMM e quercitrina: i) significativamente (p < 0,05) ha ridotto il volume e acidità del succo gastrico, aumentando il pH e il contenuto parete muco gastrico .; ii) in modo significativo (p < 0,05) ha aumentato il livello di SOD, GTP e GTR mentre significativamente (p < 0,05) ha ridotto il livello di CAT, MPO e TBARS attività .; iii) esercitata l'attività gastroprotettiva quando valutata con il saggio ulcera gastrica etanolo-indotta, che è stato invertito da N G-nitro-L-arginina esteri metilici (L-NAME, un inibitore della NO sintasi) e N
- etilmaleimmide (NEM, un sulfidrilici (SH) bloccante). MEMM inibito la lipossigenasi (LOX) e le attività xantina ossidasi (XO) con la più alta affinità per l'ex mentre quercitrina ha mostrato alta affinità per l'attività XO.
Conclusioni
MEMM mostrato un'attività gastroprotettiva dovuto in parte alla presenza di quercitrina, la sua attività antiossidante e anti-infiammatori, e tramite la modulazione di NO e SH gruppi.
Parole
Melastoma malabathricum
Melastomaceae Metanolo estratto meccanismi gastroprotettori l'ossido nitrico gruppo sulfhydryl antiossidante sfondo anti-infiammatori
le ulcere peptiche sono un disturbo comune di tutto il tratto gastrointestinale. Di circa 8 a 10% della popolazione mondiale colpita da ulcere peptiche, circa il 5% di loro soffre di ulcere gastriche [1]. Le ulcere che colpiscono il sistema gastrointestinale di solito sono aggravati da una sproporzione tra i fattori distruttivi e difensive nello stomaco [1]. Sebbene sia considerata come malattia multifattoriale, è generalmente riconosciuto che quasi tutte le ulcere peptiche sono legati alla infezione di Helicobacter pylori
e il principale obiettivo terapeutico è quello di sradicare il pylori
infezione da H.. Attualmente, il trattamento medico di prima linea di ulcera gastrica è mirata a sradicare H. pylori
infezione e di solito basato sulla procedura di trattamento tripla, che ha coinvolto l'uso di inibitori ulcera gastrica (Ie istamina H 2-antagonisti, protone pompa inibitori o sucralfato e bismuto) in combinazione con due tipi di antibiotici [2]. Tuttavia, il fatto che ci sono vari fattori diversi H. pylori
che possono innescare la formazione di ulcera gastrica non dovrebbe essere ignorato [3]. Vari approcci sono stati utilizzati nel trattamento dell'ulcera gastrica associata con quelli non-H. pylori
fattori -related come la riduzione della secrezione acida e l'aumento della produzione di muco, ma questi approcci sono stati considerati come il trattamento di seconda linea.
Nonostante la loro efficacia nello sradicamento di H. pylori
, il trattamento è complesso e di costo elevato, che coinvolge l'uso di almeno due antibiotici in combinazione con inibitori di acido gastrico. Questa combinazione è spesso causa di numerosi effetti collaterali indesiderati (cioè antibiotico resistenza, recidiva, nausea) [2,3]. Nonostante il fatto che H. pylori
infezioni sono gradualmente diminuita in tutta la maggior parte dei paesi industrializzati, un graduale aumento fallimento di H. pylori online trattamenti di eradicazione si osserva altrove [2]. Ciò è ulteriormente peggiorare dall'associazione di quegli agenti antiulcera standard con vari effetti collaterali indesiderati. In considerazione delle loro diverse effetti avversi e la presenza di H. pylori
ceppi resistenti agli antibiotici, la ricerca di nuovi e sicuri agenti gastroprotettori non antibiotico da fonti naturali, in particolare le piante, continuano ad aumentare in tutto il mondo [2, 4].
una delle piante che vengono utilizzati per il trattamento di ulcera gastrica in Malesia è Melastoma malabathricum
L. (famiglia Melastomaceae). Localmente noto al Malay come 'Senduduk
', M. malabathricum
si trova abbondantemente a Indian Ocean Island, in tutto il Sud e Sud-Est asiatico, Taiwan, Cina, Oceano Pacifico del Sud e Australia. Varie parti della pianta sono utilizzate nella medicina tradizionale Malay per trattare una varietà di disturbi con le foglie, in particolare, sono stati utilizzati per il trattamento di ulcere gastriche tra gli altri [5]. Scientificamente, il M. malabathricum Parts sono stati segnalati ad esporre le varie attività farmacologiche [5-7]. Oltre che per il suo uso tradizionale come antiulcera agente, M. malabathricum
è stato scelto nel presente studio sulla base del fatto che si tratta di uno dei famosi erbe nel folklore medicinale malese, ma ha ricevuto scarsa attenzione da parte della comunità. Inoltre, M. malabathricum
stato segnalato per contenere alto contenuto fenolico totale e di esercitare alto antiossidante e attività anti-infiammatori [5-7], che sono importanti nei meccanismi di antiulcera di eventuali composti /estratti. È ben noto che l'ulcera gastrica, particolarmente quelli inducono da etanolo, è associato con la generazione di ROS. Etanolo penetra rapidamente mucosa gastrica quanto è in grado di solubilizzare le mucose protettive e causa il rilascio di radicali liberi e idroperossidico-anione superossido. Questi radicali liberi causano un aumento dello stress ossidativo nei tessuti, che a sua volta, aumenta il livello di malondialdeide, un marker di aumentato perossidazione lipidica. Nel complesso, effetto deleterio etanolo-indotta può essere manifestata direttamente tramite generazione di metaboliti reattivi o indirettamente tramite attivazione altri meccanismi che scatenano finalmente danno ossidativo [7]. Quindi, estratti /composti con attività antiossidanti giocano un ruolo molto importante nei collettori quei radicali liberi e inibiscono la perossidazione lipidica. In luogo di questo, M. malabathricum
stato segnalato per esercitare una notevole attività antiossidante [7] e, di conseguenza, si ritiene di possedere antiulcera potenziale. La nostra prima proiezione di estratto di metanolo di M. malabathricum
(MEMM) per antiulcera potenziale contro i modelli ulcera gastrica di etanolo: e indometacina indotta stato segnalato altrove [8]. MEMM stato trovato per attenuare etanolo-indotta, ma aggravato indometacina indotta, formazione di ulcere gastriche. La capacità di MEMM di esercitare sia la gastroprotezione ed attività antinfiammatoria [5] è in contrasto con quella di indometacina, che esercita solo attività anti-infiammatoria. Questa osservazione sembra suggerire che l'estratto attiva gastroprotezione tramite un meccanismo che non è associata a quella anti-infiammatoria. Inoltre, l'attività anti-infiammatoria del MEMM potrebbe eventualmente differiva da quello esercitato da indometacina. Essendo un inibitore di COX entrambi (cioè COX-1 e COX-2), indometacina è più selettivo per COX-1, che è richiesto per mantenere lo strato protettivo della mucosa gastrica [9]. La capacità di MEMM intensificare formazione dell'ulcera gastrica indometacina indotta suggerisce che MEMM potrebbe anche inibito COX-1 azione e interferire con la formazione di costitutiva PG che aiutano a proteggere la mucosa gastrica, tra gli altri. D'altro canto, la capacità di MEMM di esercitare attività anti-infiammatoria potrebbe essere dovuta alla sua capacità di inibire la risposta COX-2-dipendente associata con il test della zampa edema del ratto carragenina-indotta [5, 9]. Oltre a questo, MEMM potrebbe anche funzionare contrario attivando COX-2, che porta ad aumentare PGE 2 sintesi, che è stato segnalato per esercitare attività anti-infiammatoria legandosi ad uno dei suoi recettori, il recettore PGE 4 (EP 4) [10]. Inoltre, PGE 2 è stato conosciuto per essere il precursore per la formazione di ciclopentenone (cyPG) che esercita antinfiammatoria [11]. Inoltre, la capacità di attivare la PGE 2 sintesi, che a sua volta aumenta la produzione di muco gastrico, può avvenire attraverso l'attivazione del PE 3 recettori [10]. Questo potrebbe ancora spiegare la capacità di MEMM di dimostrare attività anti-infiammatoria, mentre, allo stesso tempo, esercitare antiulcera attività contro l'etanolo, ma non modello indometacina-indotta. Nonostante questi suggerimenti, nessun tentativo è stato fatto per determinare i possibili meccanismi di gastroprotezione di MEMM, che potrebbero essere utilizzati per spiegare l'osservato antiulcera attività.
Tenuto conto della relazione di cui sopra [8] e un altro report realizzati da Hussain et al. [6], che ha valutato il potenziale antiulcera di estratto acquoso di M. malabathricum
utilizzando un solo modello di ulcera gastrica (vale a dire il modello etanolo-indotta), l'inchiesta sono stati i disegni. Sebbene M. malabathricum
è mai stato utilizzato nel trattamento di H. pylori
infezione, che è supportato dalla sua scarsa attività antibatterica [12,13], l'uso tradizionale dell'impianto per il trattamento dell'ulcera gastrica giustificata la ricerca di presenza con la speranza di trovare un farmaco alternativo /naturale gastroprotettivi in ​​sostituzione ai farmaci ad effetto-nudo laterali attualmente disponibili utilizzati nel trattamento di seconda linea. Prendendo conto di questo fatto, il presente studio ha lo scopo di indagare sui possibili meccanismi di gastroprotezione di MEMM utilizzando modelli diversi ratti.
Metodi
chimiche
I prodotti chimici utilizzati in questo studio sono di tipi di analisi ed erano stati preparati immediatamente prima dell'uso. I seguenti farmaci sono stati utilizzati: ranitidina (Sigma Aldrich, Stati Uniti d'America), quercitrina (Sigma Aldrich, Stati Uniti d'America), etanolo assoluto (Fischer Scientific, Stati Uniti d'America), N-etilmaleimmide (NEM) (Sigma-Aldrich, Stati Uniti d'America), N G nitro-L-arginina esteri metilici (L-NAME) (Sigma-Aldrich, Stati Uniti d'America), carbenoxolone (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) ed etere etilico (Fischer Scientific, USA).
materiali impianto di raccolta e preparazione di MEMM
le foglie di M. malabathricum
sono stati raccolti tra agosto e settembre, 2010 da Serdang, Selangor, Malesia, e identificato da un botanico presso l'Institute of Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, Malesia. Un campione di voucher, ACP-0017, è stata depositata presso l'Erbario del IBS, UPM, Malesia. Le foglie secche a terra (40 g) sono stati immersi per tre volte a temperatura ambiente per 24 h con metanolo in rapporto 1:20 (w /v) e il supernatante metanolo è stato evaporato (40 ° C) sotto pressione ridotta a secchezza conseguente una resa di 12,8 g essiccato ed appiccicoso estratto metanolico (percentuale prodotto è stato ≈ 32%).
di screening fitochimico ed analisi HPLC di MEMM
lo screening fitochimico e l'analisi HPLC del MEMM è stata eseguita secondo il metodo riportato in precedenza [ ,,,0],7]. lo screening Fitochimico di MEMM è stata effettuata per determinare la presenza di flavonoidi, triterpeni, tannini, alcaloidi e saponine secondo i protocolli convenzionali come descritto below.i) flavonoidi
Circa 10,0 g di MEMM stato bollito a parte da 2 a 3 min a 100 ml di acqua in un bagnomaria. Per 3 ml del filtrato e 3 ml di acido-alcool (etanolo: acqua: acido cloridrico concentrato in rapporto 1: 1: 1), magnesio solido (1 cm) e 1 ml di t-amil-alcool stati aggiunti. Le miscele sono state poi osservati per una rosa-arancio o violare change.ii colore) Triterpeni
circa 1,0 g di MEMM è stato estratto separatamente per 24 ore in etere. 1 ml di filtrato viene evaporato a secchezza ed il residuo ridisciolto in diverse gocce di anidride acetica e poi alcune gocce di acido solforico sono stati aggiunti alla soluzione. Le miscele sono state poi osservate per un change.iii colore verde) Tannini
circa 0,2 g di MEMM stato bollito separatamente in 5 ml di acqua. Le miscele sono stati raffreddati e filtrati. Poche gocce (3 gocce) di 5% soluzione di cloruro ferrico sono stati aggiunti al filtrato e osservati per un blu-nero precipitato formation.iv) alcaloidi
circa 0,5 g di MEMM stato separatamente bollito con 10 ml di acido cloridrico diluito (alcolica) in una provetta per 5 min. Le miscele sono stati raffreddati e le macerie è stato permesso di stabilirsi. Ciascuno dei liquidi surnatante è stato filtrato in un'altra provetta e 1 ml di ciascuna filtrato è stato preso in cui è stato aggiunto, scosse e osservati per la comparsa di una macchia arancione-rosso e un precipitato tre gocce di reagente di Dragendorff (potassio bismuto soluzione di ioduro) formation.v) saponine
circa 0,2 g di MEMM fu scossa con l'acqua e la miscela è stata osservata per una schiuma persistente.
l'analisi HPLC di MEMM è stata eseguita in base alla relazione precedente [4 ] ma con lievi modifiche. In breve, MEMM (10 mg) è stato sospeso in 1 ml di metanolo. La soluzione è stata fatta passare attraverso una cartuccia filtrante (dimensione dei pori di 0,45 micron) prima dell'analisi. Il campione filtrato è stato analizzato utilizzando il sistema HPLC costituito dal Delta Waters 600 con 600 Controller, rivelatore di fotodiodi (Waters 996). colonna e un Phenomenex Luna (5 micron) (Torrance, CA, USA) (4,6 millimetri di diametro interno × 250 mm). Due solventi denotati come A e B sono stati usati per eluizione dei componenti. Una è stata dello 0,1% acido formico acquoso e B era acetonitrile. Condizioni iniziali erano il 95% A e 5% B con un gradiente lineare di raggiungere il 25% B al tempo t = 12 min
e questa condizione è stata mantenuta per 8 min. B è stato ridotto torna al 15% di t
= 22 min e mantenuta a questa condizione per un altro 8 min (t
= 30 min). A t =
35 min, il programma restituito alla composizione del solvente iniziale. La portata usato era 1,0 ml /min e il volume di iniezione era di 10 microlitri. Il forno colonna è stata fissata a 27 ° C e l'eluente è stato monitorato a 210, 254, 280, 300, 330 e 366 nm. I tempi di ritenzione, le aree dei picchi e UV spettri dei maggiori picchi sono stati analizzati. L'analisi HPLC è stata condotta presso il Laboratorio di fitomedicina, piante medicinali Division, Forest Research Institute della Malaysia (FRIM), Kepong, Malesia animali
sperimentali
ratti maschi Sprague Dawley (180-200 g;. 8-10 settimane) sono stati ottenuti dalla Unità veterinaria degli animali, Facoltà di Medicina veterinaria, Universiti Putra Malaysia (UPM), Malaysia e tenuti sotto della temperatura ambiente (27 ± 2 ° C; 70-80% di umidità; 12 h luce /buio ciclo) in holding Unità animali, Facoltà di Medicina e Scienze della Salute, UPM. Essi sono stati forniti con cibo e acqua ad libitum
dall'inizio degli esperimenti. Il protocollo di studio del presente studio è stato approvato dalla Camera animali e del Comitato Usa, Facoltà di Medicina e Scienze della Salute, UPM (approvazione etica no: UPM /FPSK /pad /BR-UUH /00449). I ratti sono stati trattati in conformità con le linee guida attuali UPM per la cura degli animali da laboratorio e le linee guida etiche per le indagini di dolore sperimentale in animali coscienti [14]. Tutti gli esperimenti sono stati condotti tra il 09.30 e il 18.30 h per ridurre al minimo gli effetti dei cambiamenti ambientali. Il digiuno è stata applicata per 48 h prima tutti i saggi in cui i ratti hanno potuto accedere solo acqua.
Determinazione dei possibili meccanismi di gastroprotezione di MEMM
piloro ulcerazione legatura indotta
Pylorus ligasi è stata effettuata secondo il metodo con Shay et al. [15] con lievi modifiche. Trenta ratti sono stati divisi casualmente in 5 gruppi (n = 6). Group-I (controllo) è stato trattato con veicolo (10% DMSO), Gruppo-II (controllo positivo, ranitidina) è stato somministrato a 100 mg /kg (po), Gruppo-III, -IV e-V, i ratti sono stati trattati con MEMM (50, 250 e 500 mg /kg, rispettivamente). Piloro legatura è stata eseguita 1 ora dopo la somministrazione dei composti in esame su 48 h ratti a digiuno. Ketamina HCl (100 mg /kg, intramuscolare) e xilazina HCl (16 mg /kg, intramuscolare) sono stati usati per anestetizzare i topi prima legatura del piloro. Una lunga incisione 2 cm è stata fatta nell'addome appena sotto lo sterno sui ratti anestetizzati. Lo stomaco è stato esposto, e un filo è stato passato in giro per lo sfintere piloro e legato in un nodo stretto. Cura è stata presa mentre sposarsi per evitare di coinvolgere i vasi sanguigni nel nodo. L'addome è stata suturata, e la pelle è stata pulita di eventuali macchie di sangue o emorragie. Gli animali sono stati sacrificati 6 ore dopo la legatura da dislocazione cervicale.
Determinazione dei volumi, pH, acidità libera e totale del contenuto gastrico
Gli stomaci sono stati rimossi, e il contenuto sono stati drenati fuori, raccolti e centrifugati a 2500 rpm per 10 min. Il volume e pH del succo gastrico è stato misurato ed è stato sottoposto alla stima acidità libera e totale secondo il metodo descritto da Srivastava et al. [16]. L'acidità libera è stato determinato mediante titolazione con 0,01 N di idrossido di sodio (NaOH) con il reagente metilarancio finché il colore della soluzione divenne giallastra. La quantità di alcali aggiunto è stato osservato. Poi, due o tre gocce di fenolftaleina è stato aggiunto e la soluzione è stata titolata fino a quando appare una colorazione rosa definitiva. Il volume totale di NaOH aggiunto è stato osservato e ciò corrisponde ad acidità totale. L'acidità è stato calcolato con la seguente formula: $$ \\ mathrm {Acidità} = \\ frac {\\ mathrm {volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {} di \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {} normalità \\ kern0.5em \\ mathrm {} di \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Stima del contenuto muro di muco gastrico
contenuto muro di muco gastrico è stata determinata con il metodo descritto da Corne et al. [17] con lievi modifiche. Lo stomaco è stato aperto lungo la grande curvatura, pesato, ed immerso in 10 ml di 0,1% Alcian Blu di 0,16 M di saccarosio /0,05 M acetato di sodio, pH 5,8 per 2 h. Il colorante eccessiva stato poi rimosso mediante due lavaggi successivi 0,25 M soluzione di saccarosio (15 min ciascuna). Il colorante rimanente complessato con il muco gastrico sono stati estratti con 0,5 M MgCl 2 per 2 ore e agitata intermittenza per 1 min in ogni intervallo di 30 min. L'estratto blu è stato poi agitato energicamente con un volume uguale di etere etilico e l'emulsione ottenuta è stata centrifugata a 3600 rpm per 10 min. L'assorbanza (OD) di Alcian blu nello strato acquoso è stata letta a 580 nm utilizzando uno spettrofotometro. La quantità di Alcian blu estratto per grammo stomaco bagnato è stato poi calcolato da una curva standard.
Etanolo-indotta gastrica lesione della mucosa in L-NAME ratti pre-trattati
Il coinvolgimento di NO endogeno nella modulazione gastroprotettivi etanolo-indotta l'attività è stata determinata secondo il metodo di Andreo et al. [18], ma con lievi modifiche. ratti maschi sono stati divisi casualmente in dodici gruppi (n = 6) e digiunato per 24 ore, ma ha permesso il libero accesso all'acqua. Sono stati poi pre-trattato con soluzione salina o L-NAME (70 mg /kg; un inibitore di NO sintasi) per via intraperitoneale (ip) 30 minuti più tardi, gli animali hanno ricevuto veicolo (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positivo gruppo di controllo) o 500 mg /kg MEMM (po). Un'ora dopo la somministrazione di soluzioni di test, ulcera gastrica è stata indotta utilizzando 5 mL /kg di etanolo assoluto in tutti i gruppi. D'altra parte, L-arginina (200 mg /kg) è stato somministrato, 30 minuti dopo salina o L-NAME e il trattamento, seguita 30 minuti dopo dalla somministrazione di etanolo. Tutti i ratti sono stati sacrificati 1 ora seguito da esposizione a etere etilico. Lo stomaco è stato aperto lungo la grande curvatura per determinare l'area dell'ulcera (UA) come descritto da Balan et al. [19]. La protezione percentuale è stata calcolata utilizzando la seguente formula: $$ \\ mathrm {Protezione} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {} controllo \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {trattati} \\ \\ mathrm {gruppo} \\ right)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {a} \\ \\ mathrm {controllo} \\ right)} ratti \\ volte al 100 \\% $$ etanolo-indotta gastrica lesione della mucosa in NEM pre-trattati
Per studiare il coinvolgimento di sulfidrilici (SH) gruppo nella modulazione dell'attività gastroprotettiva etanolo-indotta, le procedure descritte da Andreo et al. [18] sono stati adottati con lievi modifiche. I ratti sono stati divisi casualmente in 12 gruppi (n = 6) e digiunato per 24 ore, ma ha permesso il libero accesso all'acqua. L'esperimento è iniziato con pre-trattamento (i.p.) di soluzione salina o NEM (10 mg /kg), un sulfidrilici (SH-) blocker. Trenta minuti dopo il reggimento pre-trattamento, i ratti sono stati somministrati (po) con veicolo (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (gruppo di controllo positivo) o 500 mg /kg MEMM seguita dalla somministrazione di 5 mL /etanolo kg un'ora dopo per indurre ulcere gastriche. Tutti gli animali sono stati sacrificati 1 h dopo la ricezione etanolo mediante esposizione a etere etilico. Lo stomaco è stato rimosso e danno gastrico è stato determinato come sopra descritto
. Le analisi biochimiche dei tessuti dello stomaco
A seguito delle analisi macroscopiche, superossido dismutasi (SOD) [20], catalasi (CAT) [21], la mieloperossidasi (MPO) [22], il glutatione perossidasi (GTP) [23], il glutatione reduttasi (GTR) [24] e di acido tiobarbiturico sostanze reattive (TBARS) sono stati misurati [25] attività enzimatiche nei tessuti dello stomaco del ratto. La mucosa gastrica è stata raschiata dalla porzione antrale dello stomaco utilizzando un scrapper e conservato a 4 ° C per la stima biochimico. La mucosa gastrica rottamato è stato sottoposto a preparare l'omogeneizzato mucosa (pH 7,2). L'omogenato è stato centrifugato a 3000 rpm per 10 min e il supernatante ottenuto è stato utilizzato per l'analisi di tipo antiossidante etanolo indotta danno della mucosa gastrica. In tutti i saggi di difesa antiossidante, ranitidina (100 mg /kg) gruppo -pretreated era considerato come il gruppo di controllo positivo.
Determinazione dell'attività SOD
L'attività di SOD è stato determinato in base alla inibizione della formazione di adenina nicotinamide dinucleotide, fenazina metosolfato e amino blu tetrazolio formazan [20]. Approssimativamente 0,5 ml di omogenato di tessuto sono stati mescolati con 0,4 ml di etanolo e la miscela di cloroformio e centrifugato. Per il surnatante, miscela di saggio (tampone pirofosfato di sodio (0,025 M, pH 8,3), nitroblu tetrazolio, fenazina metosolfato e nicotinammide adenin dinucleotide (NADH)) è stato aggiunto e incubato a 30 ° C per 90 s. La reazione è stata arrestata mediante aggiunta di acido acetico glaciale e miscelato con n
-butanol. L'intensità del colore sviluppato in butanolo è stata misurata a 560 nm. L'attività SOD è stata misurata dal grado di inibizione di questa reazione e viene espresso in millimoli /min /mg di proteina.
Determinazione dell'attività CAT
L'attività CAT è stata determinata colorimetricamente a 620 nm come descritto dal metodo di Sinha [21]. La miscela di reazione di 1,5 ml contenente 1,0 ml di tampone fosfato (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml di 2,0 M H 2O 2 e 1,0 ml di tessuto omogenato. La reazione è stata bloccata con l'aggiunta di 2,0 ml di reagente di acido bicromato-acetico (bicromato di potassio 5% e la miscela di acido acetico glaciale in rapporto di 1: 3). I risultati sono espressi come millimoli /min /mg di proteina.
Determinazione dell'attività MPO
L'attività di MPO è stata misurata secondo il metodo descritto da Bradley et al. [22], ma con lievi modifiche. I campioni sono stati omogeneizzati congelati e scongelati per tre volte e centrifugati a 1500 g per 10 min a 40 ° C. Circa 100 ml di surnatante omogeneizzato è stato aggiunto 1,9 ml di 10 /cuscinetto mmol L fosfato (pH 6,0) e 1,0 ml di 1,5 mmol /cloridrato LO-dianisidina contenente 0,0005% (w /v) H 2O 2. L'assorbanza è stata valutata a 450 nm con uno spettrofotometro UV e l'attività MPO nei tessuti gastrici è stata espressa come umoli /min /mg di proteina.
Determinazione dell'attività GTP
L'attività di GTP è stata misurata mediante il metodo descritto da Rotruck et al. [23] con lievi modifiche. La miscela di reazione, contenente 0,2 ml di 0,4 M, Tris - HCl, pH 7,0, 0,1 ml di 10 mM sodio azide, 0,2 ml di omogenato tissutale (omogeneizzato il tessuto in 0.4 tampone M Tris-HCl, pH 7,0), 0,2 ml glutatione e 0,1 ml di perossido di idrogeno 0,2 mM è stato poi incubate a temperatura ambiente per 10 min. La reazione è stata arrestata mediante aggiunta di 0,4 ml di 10% TCA e assoggettamento al processo di centrifugazione. Il supernatante è stato analizzato per contenuto di glutatione utilizzando Ellmans reagente (19,8 mg 5, acido benzoico 5'-dithiobisnitro (DTNB) in 100 ml di nitrato di sodio 0,1%). Un coefficiente di estinzione molare di 6,22 × 103 mmol stata utilizzata per determinare l'attività di GTP. L'attività enzimatica è stata espressa in unità internazionali di attività enzimatica /g di proteine. unità internazionali sono espressi come umoli di idroperossidi trasformate /min /ml di enzima.
Determinazione dell'attività GTR
Il livello di GTR è stato determinato con il metodo di Ellman [24]. Approximately1.0 ml di surnatante è stata trattata con 0,5 ml di Ellmans reattivo (19,8 mg 5, acido benzoico 5'-dithiobisnitro (DTNB) in 100 ml di nitrato di sodio 0,1%) e 3,0 ml di tampone fosfato (0,2 M, pH 8,0 ). L'assorbanza è stata letta a 412 nm e l'attività GTR è stata espressa come umoli /min /mg di tessuto.
Determinazione del contenuto di TBARS
Il grado di LPO stata misurata analizzando i livelli di TBARS nella mucosa gastrica secondo il metodo precedente [25], ma con lievi modifiche. Per 0,5 ml di omogenato tissutale, 1,5 ml di acido acetico al 20%, 0,2 ml di SDS e 1,5 ml di TBA sono stati aggiunti. La miscela è stata portata a 4 ml con acqua distillata e riscaldata per 1 ora a 95 ° C. Dopo raffreddamento, 4,0 ml di miscela butanolo-piridina è stato aggiunto e agitate bene. Questa miscela è stata quindi centrifugata a 4000 rpm per 10 min. Lo strato organico è stato preso e la sua assorbanza è stata letta a 532 nm ei risultati sono stati espressi come n moli /g di proteine.
Stima di proteine ​​
Il contenuto proteico nel tessuto gastrico è stata stimata secondo il metodo di Lowry et al. [26], ma con lievi modifiche. Il campione di tessuto e gli standard (1,0 mg /ml di albumina di siero bovino in acqua bidistillata) in diverse provette sono stati trattati con 5,0 ml di miscela di reagenti (tartrato di sodio e di potassio 48%, 2% di solfato di rame e 3% di carbonato di sodio in 01:48 (v /v)). Poi Folin fenolo reagente (1: 2) è stato aggiunto alla miscela di reazione e lasciata riposare per 30 minuti a temperatura ambiente. La densità ottica è stata letta a 710 nm utilizzando acqua come reagente vuoto.
In vitro l'attività anti-infiammatoria del MEMM
in vitro effetto di MEMM sull'ossido nitrico
coltura cellulare e la stimolazione
Il RAW 264.7 linea cellulare (murine macrofagi monociti) (European Collection di colture cellulari, Porton Down, UK) è stata sostenuta in DMEM supplementato con 10% FBS, 4,5 g /L di glucosio, L-glutammina (2 mm), piruvato di sodio (1 mm), penicillina (50 U /ml) e streptomicina (50 mg /ml) e 5% di CO 2 a 37 ° C. Le cellule (4 × 10 5 cellule /pozzetto) sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti e incubate per 2 ore a 37 ° C in un CO 2 incubatore per consentire il collegamento di celle e quindi innescato con stimoli (100 U /ml di IFN-g e 5 ug /ml di LPS) con o senza la presenza di MEMM in concentrazione compresa tra 12,5-100 mg /ml. DMSO (veicolo) è stato usato per sciogliere il MEMM. La concentrazione finale di DMSO è stato assicurato di essere 0,1% in tutte le culture. Le cellule sono state poi incubate per 17-20 ore a 37 ° C in un CO 2 incubatore. Il NO determinazione è stata effettuata sottoponendo il surnatante colta contro il test di Griess e le cellule rimanenti nel pozzo sono stati testati per test di vitalità cellulare
determinazione Nitrito
La concentrazione di nitriti (NO 2 . - ), un metabolita stabile di NO nel terreno di coltura, è stata determinata utilizzando il test di Griess [27]. Un volume uguale di Griess reagenti è stato miscelato con il supernatante di coltura e lo sviluppo del colore è stata misurata a 550 nm. La quantità di nitriti nel supernatante di coltura è stata determinata sulla base della curva standard di una nitrito di sodio (0-100 pM) appena preparato in acqua deionizzata. Percentuale del NO di inibizione è stato calcolato utilizzando la seguente formula: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ dove;
* di controllo è il livello di nitriti di IFN-γ /LPS-indotta gruppo
vitalità cellulare
La citotossicità della MEMM sulle cellule in coltura è stata determinata esaminando la riduzione di 3. - (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro (MTT) [27]. I reagenti MTT (0,05 mg /ml) sono state sospese in PBS sterile, pH 7,0 e quindi aggiunti in ogni pozzetto successivamente alla rimozione del supernatante. Questa è seguita l'incubazione delle cellule rimanenti a 37 ° C per 4 h, seguiti dall'aggiunta di 100 ml di 100% DMSO nei pozzetti per sciogliere i sali formatisi formazano. L'assorbanza è stata misurata a 570 nm. La percentuale di vitalità cellulare è stata calcolata secondo la seguente formula: $$ \\ mathrm {cellulare} \\ \\ mathrm {vitalità} \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {controllo}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {campione}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

• Un nuovo metodo, la scansione del genoma digitale rileva l'amplificazione del gene KRAS nel cancro gastrico: il coinvolgimento di sovraespresso KRAS wild-type nella segnalazione a valle e delle cellul…
• Genomica analisi del profilo di diffusa di tipo gastrico cancers