Mekanismer av gastroprotection metanol ekstrakt av Melastoma malabathricum blader

Mekanismer av gastroprotection metanol ekstrakt av Melastoma malabathricum
later
Abstract
Bakgrunn
Melastoma malabathricum
L. (Melastomaceae) er en liten busk med ulike medisinske bruksområder. Denne studien ble gjennomført for å bestemme gastroprotective mekanismer metanol ekstrakt av M. malabathricum
blader (MEMM) hos rotter.
Metoder
ekstrakt mekanismer av gastroprotection (50, 250, 500 mg /kg) ble studert ved hjelp av pylorus-rings i rottemodellen, hvor volum, pH, gratis og total surhet av magesyren, og mageveggen slim innhold ble bestemt. Involvering av endogene nitrogenoksid (NO) og sulfhydryl (SH) forbindelser i den magesekkbeskyttende virkning av MEMM ble også målt. MEMM ble utsatt for antioksidant, anti-inflammatorisk og fytokjemikalier analyse og HPLC profilering.
Resultater
MEMM inneholdt ulike phyto-bestanddeler med Quercitrin blir identifisert som en del av dem. MEMM og Quercitrin: i) signifikant (p 0,05) reduserte volumet og surheten av magesyren, mens økning av pH og gastriske vegg slim innhold .; ii) signifikant (p 0,05) økt nivå av SOD, GTP og GTR mens signifikant (p 0,05) reduserte nivået av CAT, MPO og TBARS aktiviteter .; iii) utøves gastroprotective aktivitet når vurdert ved hjelp av etanol-indusert magesår analysen, som ble reversert av N G-nitro-L-arginin metyl estere (L-NAME, en hemmer av NO syntase) og N Anmeldelser - etylmaleimid (NEM, en sulfhydryl (SH) blokker). MEMM hemmet lipoksygenase (LOX) og xantinoxidase (XO) aktiviteter med høyest affinitet for det tidligere mens Quercitrin viste høy affinitet for XO aktivitet.
Konklusjoner
MEMM viste en gastroprotective aktivitet skyldes dels av tilstedeværelsen av Quercitrin, antioksidant og anti-inflammatorisk aktivitet, og via modulering av NO og SH-grupper.
nøkkelord
Melastoma malabathricum
Melastomaceae Metanol trekke magesekk mekanismer Nitrogenoksid sulfhydrylgruppe antioxidant anti-inflammatorisk Bakgrunn
magesår er en vanlig lidelse i hele mage-tarmkanalen. Av nesten 8 til 10% av verdens befolkning påvirket av magesår, ca 5% av dem lider av magesår [1]. De sår som påvirker den gastrointestinale system blir vanligvis forverret av et misforhold mellom destruktive og defensive faktorer i magen [1]. Selv om det anses som multifaktoriell sykdom, er det generelt anerkjent at nesten alle peptisk ulcus er knyttet til infeksjon av Helicobacter pylori
og den store terapeutiske målet er å utrydde H. pylori-infeksjon
. Foreløpig er den første linjen medisinsk behandling av magesår rettet mot å utrydde H. pylori
infeksjon og vanligvis basert på trippel behandling prosedyre, som involverte bruk av magesår hemmere (Dvs. histamin H 2-antagonister, proton pumpehemmere, eller sukralfat og vismut) i kombinasjon med to typer antibiotika [2]. Imidlertid, det faktum at det er ulike andre enn H. pylori
faktorer som kan utløse magesårdannelse bør ikke ignoreres [3]. Forskjellige tilnærminger er blitt benyttet i behandling av magesår i forbindelse med de ikke-H. pylori
-relaterte faktorer som reduserer magesyre og økt slimproduksjon, men disse metodene har vært ansett som andrelinjebehandling.
tross for sin effektivitet i å utrydde H. pylori
, er behandling kompleks og høye kostnader, som involverer bruk av minst to antibiotika i kombinasjon med magesyre-inhibitorer. Denne kombinasjonen fører ofte flere uønskede bivirkninger (dvs. antibiotikaresistens, gjentakelse, kvalme) [2,3]. Til tross for at H. pylori
infeksjoner har gradvis avtatt gjennom de fleste industrialiserte land, er en gradvis økning i fiasko for H. pylori
utrydding behandlinger observert andre steder [2]. Dette er ytterligere forverres av foreningen av disse standard antiulcusmidler med ulike uønskede bivirkninger. I betraktning av deres ulike skadevirkninger og forekomst av antibiotikaresistente H. pylori
stammer, søken etter nye og sikre ikke-antibiotiske gastroprotective agenter fra naturlige kilder, spesielt planter, fortsetter å øke over hele verden [2, 4].
En av plantene som brukes til å behandle magesår i Malaysia er Melastoma malabathricum
L. (familie Melastomaceae). Lokalt kjent til den malayiske som "Senduduk
", er M. malabathricum
finnes rikelig i Indian Ocean Island, i hele Sør- og Sørøst-Asia, Taiwan, Kina, Sør-Stillehavet og Australia. Forskjellige deler av planten brukes i malayiske tradisjonelle medisiner for å behandle en rekke sykdommer med bladene, spesielt, har vært brukt til å behandle magesår bl.a. [5]. Vitenskapelig, M. malabathricum
deler har blitt rapportert å vise ulike farmakologiske aktiviteter [5-7]. Annet enn for sin tradisjonelle bruk som antiulcer agent, ble M. malabathricum
valgt i denne studien basert på det faktum at det er en av de berømte urter i Malay medisinsk folklore, men fikk mangel på oppmerksomhet blant samfunnet. Videre har M. malabathricum
er blitt rapportert å inneholde høy total fenolisk innhold, og til å utøve høye antioksidant og anti-inflammatorisk aktivitet [5-7], som er viktige mekanismene for antiulcer av eventuelle forbindelser /ekstrakter. Det er vel kjent at magesår, spesielt de som induserer med etanol, er forbundet med ROS generasjon. Etanol raskt trenger inn i mageslimhinnen som det er i stand til å oppløseliggjøre de beskyttende slimete og forårsaker frigjøring av hydroperoksy-frie radikaler og superoksid anion. Disse frie radikaler føre til en økning i oksidativt stress i vev, som i sin tur øker nivået av malondialdehyd, en markør for øket lipid peroksydasjon. Generelt kan etanol-indusert skadelig effekt manifesteres direkte via generasjon av reaktive metabolitter eller indirekte via aktiverings andre mekanismer som til slutt utløser oksidativ skade [7]. Derfor ekstraktene /forbindelser med antioksidanter aktivitet spiller en meget viktig rolle i scavenging de frie radikaler og hemme lipidperoksydasjon. I stedet for denne, og M. malabathricum
blitt rapportert å utøve en bemerkelsesverdig antioksidantaktivitet [7], og derfor antas å ha antiulcer potensial. Vår tidligere screening av metanol ekstrakt av M. malabathricum plakater (MEMM) for antiulcer potensial mot etanol- og indometacin-indusert ulcus ventriculi modeller har blitt rapportert andre steder [8]. MEMM ble funnet å dempe etanol-indusert, men forverret indometacin-indusert gastrisk sårdannelse. Evnen til MEMM til å utøve både gastroprotection og anti-inflammatorisk aktivitet [5] er i motsetning til den av indometacin, hvor kun utøves anti-inflammatorisk aktivitet. Denne iakttagelse synes å antyde at ekstraktet aktiverer gastroprotection via en mekanisme som ikke er knyttet til det anti-inflammasjon. Dessuten kan den antiinflammatoriske aktivitet av MEMM muligens var forskjellig fra den som utøves av indometacin. Som en hemmer av både Coxs (dvs. COX-1 og COX-2), er indometacin mer selektiv for COX-1, som er nødvendig for å opprettholde den beskyttende gastriske slimhinnen [9]. Evnen til MEMM å intensivere indometacin-indusert gastrisk sårdannelse antyder at MEMM kan også inhiberes COX-1-virkning, og interfererer med dannelsen av konstitutive PG som bidrar til å beskytte den gastriske mucosa blant andre. På den annen side kan evne MEMM til å utøve anti-inflammatorisk aktivitet være på grunn av sin evne til å hemme COX-2-avhengig respons forbundet med karragenan-indusert rottepoteødemtest [5, 9]. Annet enn det, kan MEMM også fungere ordreantallene ved aktivering av COX-2, fører til økning PGE 2 syntese, som er blitt rapportert å utøve anti-inflammatorisk aktivitet ved binding til en av dens reseptorer, er PGE-reseptor 4 (EP 4) [10]. Videre PGE 2 er kjent for å være forløperen for dannelse av prostaglandiner cyklopentenon (cyPG) som utøver antiinflammatorisk [11]. Videre er evnen til å aktivere PGE 2 syntese, som i sin tur øker slim mage produksjon, kan skje via aktivering av EP 3-reseptorer [10]. Dette kan igjen bidra til å forklare evnen til MEMM for å demonstrere anti-inflammatorisk aktivitet mens, på samme tid, utøver antiulcer aktivitet mot etanol-, men ikke indometacin-induserte modell. Til tross for disse forslagene, er det ikke gjort forsøk på å finne mulige mekanismer for gastroprotection av MEMM, som kunne brukes til å forklare den observerte antiulcer aktivitet.
Hensyntatt ovennevnte rapport [8] og ytterligere rapporter fra Hussain et al. [6], som vurderte antiulcer potensialet i vandig ekstrakt av M. malabathricum
kun ved hjelp av en modell av magesår (dvs. etanol-indusert modell), den pågående etterforskningen var design. Selv M. malabathricum
har aldri vært brukt i behandling av H. pylori-infeksjon
, som er støttet av dets dårlige antibakteriell aktivitet [12,13], er den tradisjonelle bruk av anlegget for behandling av magesår berettiget tilstedeværelsen forskning med håp om å finne en alternativ /naturlig gastroprotective middel som en erstatning til de tilgjengelige bivirkning-baring legemidler som brukes i andrelinjebehandling. Tar hensyn til dette, denne studien forsøkte å undersøke om de mulige mekanismer for gastroprotection av MEMM ved hjelp av ulike rotter modeller.
Metoder
Kjemikalier
Kjemikaliene som brukes i denne studien er av analytiske karakterer og hadde blitt forberedt umiddelbart før bruk. De følgende stoffer ble anvendt: ranitidin (Sigma Aldrich, USA), Quercitrin (Sigma Aldrich, USA), absolutt etanol (Fischer Scientific, USA), N-etylmaleimid (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G -nitro-L-arginin-estere (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), carbenoxolone (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) og dietyleter (Fischer Scientific, USA).
plantematerialer innsamling og forberedelse av MEMM
bladene av M. malabathricum
ble samlet mellom august og september 2010 fra Serdang, Selangor, Malaysia, og identifisert av en botaniker fra institutt for Biovitenskap (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor, Malaysia. En kupong prøven, ACP-0017, er deponert på Herbarium av IBS, UPM, Malaysia. Bakken tørkede blader (40 g) ble dyppet tre ganger ved romtemperatur i 24 timer med metanol i et forhold på 1:20 (w /v) og metanol supernatanten ble inndampet (40 ° C) under redusert trykk til tørrhet noe som resulterer i et utbytte på 12,8 g tørket og klebrig metanolekstrakt (prosentandel gitt ble ≈ 32%).
phytochemical screening og HPLC-analyse av MEMM
fytokjemikalier screening og HPLC-analyse av MEMM ble utført i henhold til den tidligere rapporterte metoden [ ,,,0],7]. Phytochemical screening av MEMM ble utført for å bestemme tilstedeværelsen av flavonoider, triterpenes, tanniner, alkaloider og saponiner i henhold til de vanlige protokollene som beskrevet nedenfor.Jeg) Flavonoider
Omtrent 10,0 g MEMM ble separat kokt 2 til 3 minutter i 100 ml vann i et vann-bad. Til 3 ml av filtratet, 3 ml av syre-alkohol (etanol: vann: konsentrert saltsyre i et forhold på 1: 1: 1), fast magnesium (1 cm) og 1 ml t-amyl-alkohol ble tilsatt. Blandingene ble deretter observert for en rose-oransje eller krenke farge change.ii) Triterpenes
Omtrent 1,0 g MEMM ble separat hentet for 24 timer i eter. 1 ml av filtratet ble inndampet til tørrhet, og residuet ble oppløst på nytt i flere dråper eddiksyreanhydrid og deretter flere dråper svovelsyre ble tilsatt til løsningen. Blandingene ble deretter observert for en grønn farge change.iii) tanniner
Omtrent 0,2 g av MEMM ble separat kokt i 5 ml vann. Blandingene ble avkjølt og filtrert. Noen få dråper (3 dråper) av 5% jern-III-klorid-oppløsning ble tilsatt til filtratet og observert for et blåsvart bunnfall formation.iv) Alkaloider
Omtrent 0,5 g av MEMM ble separat kokt med 10 ml fortynnet saltsyre (alkoholisk) i et prøverør i 5 minutter. Blandingene ble avkjølt og rusk ble tillatt å bunnfelle. Hver av de overliggende væske ble filtrert over i et annet prøverør og 1 ml av hvert filtrat ble tatt inn i hvilket tre dråper Dragendorff reagens (kalium-vismut-jodid-oppløsning) ble tilsatt, ristet og observert for utseendet av en orange-rød flekk og et bunnfall formation.v) Saponiner
Omtrent 0,2 g av MEMM ble ristet med vann, og blandingen ble observert for en vedvarende skum.
HPLC-analyse av MEMM ble utført i henhold til den tidligere rapport [4 ] men med små modifikasjoner. I korte trekk, ble MEMM (10 mg) ble suspendert i 1 ml metanol. Oppløsningen ble ført gjennom en filterpatron (porestørrelse 0,45 um) før analyse. Den filtrerte prøve ble analysert ved anvendelse av HPLC-system bestående av den Waters Delta 600 med 600 Controller, fotodiode array detektor (Waters 996). Og en Phenomenex Luna (5 um) (Torrance, CA, USA) kolonne (4,6 mm I.D. x 250 mm). To oppløsningsmidler betegnet som A og B ble anvendt for eluering av bestanddelene. A var 0,1% vandig maursyre og B var acetonitril. Startbetingelsene var 95% A, 5% B med en lineær gradient opp til 25% B ved t
= 12 min, og denne tilstanden ble opprettholdt i 8 min. B ble redusert igjen til 15% ved t
= 22 min, og holdes ved denne tilstand i ytterligere 8 minutter (t
= 30 min). Ved t = 35 min
, returneres programmet til det opprinnelige løsningsmiddel blandingen. Strømningshastigheten som ble anvendt var 1,0 ml /minutt og injeksjonsvolumet var 10 ul. kolonne ovn den ble innstilt på 27 ° C, og elueringsmidlet ble overvåket ved 210, 254, 280, 300, 330 og 366 nm. Den retensjonstider, topparealene og UV-spektrene av de store topper ble analysert. HPLC-analysen ble utført i laboratoriet for Phytomedicine, medisinplanter Division, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Malaysia
forsøksdyr
Sprague Dawley rotter (180-200 g, 8-10. uker gamle) ble innhentet fra Veterinæravdelingen, fakultet for veterinærmedisin, Universiti Putra Malaysia (UPM), Malaysia og holdt under romtemperatur (27 ± 2 ° C, 70-80% luftfuktighet, 12 timer lys /mørke syklus) i Animal Holding Unit, Avdeling for medisin og helsefag, UPM. De ble levert sammen med mat og vann ad libitum
fra begynnelsen av forsøkene. Studieprotokollen med denne studien ble godkjent av Gjengen og bruk komité, Avdeling for medisin og helsefag, UPM (Etisk godkjenning no: UPM /FPSK /PUTER /BR-uuh /00449). Rottene ble håndtert i samsvar med gjeldende UPM retningslinjer for omsorg for forsøksdyr og de etiske retningslinjene for undersøkelser av eksperimentell smerte i bevisste dyr [14]. Alle forsøkene ble utført mellom 09.30 og 18.30 h å minimalisere virkningene av miljøendringer. Fasting ble påtrykt i 48 timer før alle analyser, karakterisert ved at rotter fikk adgang til kun vann.
Bestemmelse av de mulige mekanismer for gastroprotection av MEMM
pylorus rings-indusert ulcerasjon
pylorus ligering ble utført i henhold til metoden av Shay et al. [15] med små modifikasjoner. Tredve rotter ble tilfeldig fordelt i 5 grupper (n = 6). Gruppe-I (kontroll) ble behandlet med bærer (10% DMSO), ble gruppe-II (positiv kontroll, ranitidin), gitt ved 100 mg /kg (po), gruppe-III-IV og V-, rotter ble behandlet med MEMM (50, 250 og 500 mg /kg, henholdsvis). Pylorus ligering ble utført 1 time etter administrering av testforbindelsene i 48 timer fastende rotter. Ketamin-HCl (100 mg /kg, intramuskulært) og xylazin HCI (16 mg /kg, intramuskulært) ble anvendt for å bedøve rottene før ligering av pylorus. En 2 cm lang innsnitt ble gjort i magen rett under brystbenet på bedøvede rotter. Magen ble utsatt, og en tråd ble sendt rundt i pyloric sphincter og bundet i en stram knute. Care ble tatt mens gifte for å unngå å involvere blodårene i knuten. Buken ble sydd, og huden var renset for eventuelle blodflekker eller blødning. Dyrene ble avlivet 6 timer etter ligering ved cervikal dislokasjon.
Bestemmelse av volum, pH, fri og total surhet av mageinnholdet
Magesekkene ble tatt ut, og innholdet ble tømt ut, oppsamlet og sentrifugert ved 2500 rpm i 10 min. Volumet og pH i mavesaft ble målt og ble utsatt for fri og total surhet estimering i henhold til metoden beskrevet av Srivastava et al. [16]. Fri surhet ble bestemt ved titrering med 0,01 N natriumhydroksyd (NaOH) med metyl- orange reagens inntil fargen på oppløsningen ble gulaktig. Volumet av tilsatt alkali ble notert. Deretter ble to til tre dråper fenolftalein tilsatt, og løsningen ble titrert til en klar rosa farge vises. Det totale volumet av tilsatt NaOH ble notert, og dette tilsvarer total surhet. Surhet ble beregnet ved hjelp av følgende formel: $$ \\ mathrm {surhet} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ kern0.5em \\ mathrm {av} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ ganger \\ mathrm {normalitet} \\ kern0.5em \\ mathrm {av} \\ kern0.5em \\ mathrm {NaOH} \\ ganger 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /1 $$ Estimering av mageveggen slim innhold
Gastrisk slim vegg innholdet~~POS=HEADCOMP ble bestemt ved hjelp av metoden beskrevet av Corne et al. [17] med små modifikasjoner. Magen ble åpnet langs den store kurvatur, veid, og neddykket i 10 ml 0,1% Alcian blå i 0,16 M sukrose /0,05 M natriumacetat, pH 5,8 i 2 timer. Den overdreven fargestoff ble deretter fjernet ved to suksessive skyllinger i 0,25 M sukrose-løsning (15 min hver). De resterende fargestoff kompleksdannet med den gastriske slimet ble ekstrahert med 0,5 M MgCl 2 i 2 timer og rystet periodisk i 1 min i hvert 30 min intervaller. Den blå ekstraktet ble deretter rystet kraftig med et like stort volum av dietyleter og den resulterende emulsjon ble sentrifugert ved 3600 rpm i 10 min. Absorbans (OD) av Alcian blå i det vandige laget ble avlest ved 580 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Mengden av Alcian blå pakke per gram våt magen ble deretter beregnet ut fra en standardkurve.
Etanol-indusert mage mucosal lesjon i L-NAME pre-behandlede rotter
involvering av endogent NO i moduler etanol-indusert gastroprotective -aktivitet ble bestemt i henhold til metoden til Andreo et al. [18], men med små modifikasjoner. Hannrotter ble tilfeldig inndelt i tolv grupper (n = 6), og fastet i 24 timer men tillates fri adgang til vann. De ble så forhåndsbehandlet med saltvannsoppløsning eller L-NAME (70 mg /kg, en hemmer av NO-syntase) intraperitonealt (ip) og 30 minutter senere mottok dyrene kjøretøy (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positiv kontrollgruppe) eller 500 mg /kg MEMM (po). En time etter administrering av testløsninger ble magesår indusert ved hjelp av 5 ml /kg absolutt etanol i alle grupper. På den annen side, ble L-arginin (200 mg /kg) administrert 30 minutter etter at saltløsning eller L-NAME behandling og etterfulgt 30 min senere av etanol administrering. Alle rottene ble avlivet en time senere av eksponering for dietyleter. Magen ble åpnet langs den store kurvatur for å bestemme sårområdet (UA) som beskrevet av Balan et al. [19]. Den prosentvise beskyttelse ble beregnet ved hjelp av følgende formel: $$ \\ mathrm {Protection} \\ venstre (\\% \\ right) = \\ frac {\\ venstre (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontroll} \\ hbox {-} \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {behandlet} \\ \\ mathrm {gruppe} \\ right)} {\\ venstre (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontroll} \\ right)} \\ ganger 100 \\% $$ etanol-indusert mage mucosal lesjon i NEM pre-behandlede rotter
å undersøke involvering av sulfhydryl (SH) gruppe i moduleringen av etanolinduserte magesekkbeskyttende aktivitet, fremgangsmåtene beskrevet av Andreo et al. [18] ble vedtatt med små modifikasjoner. Rottene ble tilfeldig inndelt i 12 grupper (n = 6), og fastet i 24 timer men tillates fri adgang til vann. Forsøket startet med forbehandling (i.p.) av saltvann eller NEM (10 mg /kg), en sulfhydryl (SH-) blokkering. Tretti minutter etter forbehandlingen regiment ble rottene administrert (po) med bærer (10% DMSO), 100 mg /kg CBX (positiv kontrollgruppe) eller 500 mg /kg MEMM etterfulgt av administrering av 5 ml /kg etanol en time senere for å indusere magesår. Alle dyr ble avlivet 1 time etter å ha mottatt etanol ved eksponering til dietyleter. Magen ble fjernet og gastrisk skade ble bestemt som beskrevet ovenfor.
Biokjemisk analyse av magevevet
Etter de makroskopiske analysene, superoksid dismutase (SOD) [20], katalase (CAT) [21], myeloperoksidase (MPO) [22], glutation peroksidase (GTP) [23], glutation reduktase (GTR) [24] og tiobarbitursyrereaktive stoffer (TBARS) [25] enzymaktivitet i rotte mage vev ble målt. Gastrisk mucosa ble skrapt fra antrum-delen av magen ved hjelp av et scrapper og lagret ved 4 ° C for biokjemisk estimering. Den kasserte gastrisk mukosa ble underkastet for å fremstille det mukosale homogenatet (pH 7,2). Homogenatet ble deretter sentrifugert ved 3000 rpm i 10 minutter og den oppnådde supernatant ble benyttet for analyse av antioksydant typen på etanol-indusert gastrisk mucosal skade. I alle antioksidantforsvar-analyser, ble ranitidin (100 mg /kg) -pretreated gruppe betraktet som den positive kontrollgruppe.
Bestemmelse av SOD-aktivitet
Aktiviteten av SOD ble bestemt basert på inhiberingen av dannelsen av nikotinamid-adenin- dinukleotid, fenazin metosulfat og amino blå tetrazolium formazan [20]. Omtrent 0,5 ml vev homogenat ble blandet med 0,4 ml etanol og kloroform blanding og sentrifugert. Til supernatanten, analyseblandingen (natriumpyrofosfat-buffer (0,025 M, pH 8,3), nitro tetrazolium, fenazinmetosulfat og redusert nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH)) ble tilsatt og inkubert ved 30 ° C i 90 s. Reaksjonen ble avbrutt ved tilsetning av iseddik og blandes med n-butanol
. Intensiteten av fargen utviklet i butanol ble målt ved 560 nm. SOD-aktivitet ble målt ved graden av hemming av denne reaksjon, og er uttrykt som mmol /min /mg protein.
Bestemmelse av CAT-aktivitet
aktiviteten av CAT ble analysert kolorimetrisk ved 620 nm, som beskrevet ved fremgangsmåten ifølge Sinha [21]. Reaksjonsblandingen på 1,5 ml inneholdende 1,0 ml fosfatbuffer (0,01 M, pH 7,0), 0,4 ml av 2,0 M H 2o 2 og 1.0 ml vev homogenat. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 2,0 ml av dikromat-eddiksyre-reagens (5% kaliumdikromat og iseddik blanding i forholdet 1: 3). Resultatene er uttrykt som mmol /min /mg protein.
Bestemmelse av MPO aktivitet
aktiviteten av MPO ble målt i henhold til metoden beskrevet av Bradley et al. [22], men med små modifikasjoner. De homogeniserte prøvene ble frosset og tint tre ganger og sentrifugert ved 1500 g i 10 min ved 40 ° C. Omtrent 100 ul av den homogeniserte supernatant ble tilsatt til 1,9 ml 10 mmol /l fosfatbuffer (pH 6,0) og 1,0 ml 1,5 mmol /LO-dianisidin-hydroklorid inneholdende 0,0005% (vekt /volum) H 2o 2. Absorbansen ble bestemt ved 450 nm i et UV-spektrofotometer, og den MPO aktivitet i mage-vev ble uttrykt som pmol /min /mg protein.
Bestemmelse av GTP aktivitet
aktiviteten av GTP ble målt ved metoden beskrevet av Rotruck et al. [23] med små modifikasjoner. Reaksjonsblandingen, som inneholdt 0,2 ml 0,4 M Tris - HCl-buffer, pH 7,0, 0,1 ml av 10 mM natriumazid, 0,2 ml vev homogenat (homogenisert vev i 0,4 M Tris-HCl-buffer, pH 7,0), 0,2 ml glutation og 0,1 ml av 0,2 mM hydrogenperoksyd ble deretter inkubert ved romtemperatur i 10 min. Reaksjonen ble avbrutt ved tilsetning av 0,4 ml 10% TCA og underordne den sentrifugering prosessen. Supernatanten ble analysert med hensyn på glutation-innhold ved hjelp av Ellmans reagens (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro benzosyre (DTNB) i 100 ml 0,1% natriumnitrat). En molar ekstinksjonskoeffisient på 6,22 x 103 umol ble anvendt for å bestemme aktiviteten av GTP. Enzymaktiviteten ble uttrykt som internasjonale enheter av enzymatisk aktivitet /g protein. Internasjonale enheter er uttrykt som umol hydroperoksyder transform /min /ml enzym.
Bestemmelse av GTR aktivitet
nivået av GTR ble bestemt ved metoden til Ellman [24]. Approximately1.0 ml supernatant ble behandlet med 0,5 ml av Ellmans reagens (19,8 mg 5, 5'-dithiobisnitro benzosyre (DTNB) i 100 ml 0,1% natriumnitrat) og 3,0 ml fosfatbuffer (0,2 M, pH 8,0 ). Absorbansen ble avlest ved 412 nm og den GTR aktiviteten ble uttrykt som pmol /min /mg vev.
Bestemmelse av TBARS innhold
Graden av LPO ble målt ved å analysere nivåene av TBARS i den gastriske slimhinne ifølge forrige metoden [25], men med mindre endring. 0,5 ml vevhomogenat, 1,5 ml 20% eddiksyre, 0,2 ml SDS og 1,5 ml av TBA ble tilsatt. Blandingen ble fylt opp til 4 ml med destillert vann og oppvarmet i en time ved 95 ° C. Etter avkjøling ble 4,0 ml butanol-pyridin-blanding tilsatt og ristet godt. Denne blandingen ble deretter sentrifugert ved 4000 rpm i 10 min. Det organiske lag ble tatt ut og dens absorbans ble avlest ved 532 nm, og resultatene ble uttrykt som n mol /g protein.
Estimering av protein
proteininnholdet i den gastriske vev ble beregnet i henhold til metoden ifølge Lowry et al. [26], men med små modifikasjoner. Vevet prøven og standardene (1,0 mg /ml bovint serumalbumin i dobbelt destillert vann) i forskjellige rør ble behandlet med 5,0 ml av reagens-blanding (48% natrium-kalium-tartrat, 2% kobbersulfat og 3% natriumkarbonat i 01:48 (v /v)). Deretter Folin phenol reagent (1: 2) ble tilsatt til reaksjonsblandingen og fikk stå i 30 minutter ved romtemperatur. Den optiske tettheten ble avlest ved 710 nm ved anvendelse av vann som reagens blank.
In vitro antiinflammatoriske aktivitet av MEMM
In-vitro-virkning av MEMM på nitrogenoksid
Cellekultur og stimulering
RAW 264.7 cellelinje (murine monocyttiske makrofager) (European Collection of Cell Cultures, Porton Down, UK) ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% FBS, 4,5 g /l glukose, L-glutamin (2 mM), natriumpyruvat (1 mM), penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 ug /ml) og 5% CO 2 ved 37 ° C. Cellene (4 x 10 5-celler /brønn) ble sådd på en 96-brønns plate og inkubert i 2 timer ved 37 ° C i en CO 2 inkubator for å tillate festing av celler, og deretter utløses med stimuli (100 U /ml av IFN-g og 5 ug /ml LPS) med eller uten tilstedeværelse av MEMM i den konsentrasjon i området mellom 12,5 til 100 ug /ml. DMSO (kjøretøy) ble anvendt for å oppløse MEMM. Den endelige konsentrasjonen av DMSO er sikret å være 0,1% i alle kulturer. Cellene ble deretter inkubert i 17-20 timer ved 37 ° C i en CO 2 inkubator. NO-bestemmelse ble utført ved å underkaste den dyrkede supernatant mot Griess-analyse og cellene gjenværende i brønnen ble testet for cellenes levedyktighet assay
Nitritt bestemmelse
Konsentrasjonen av nitritt (NO 2 . - ), en stabil metabolitt av NO i kulturmedium, ble bestemt ved anvendelse av Griess-analyse [27]. Et like stort volum av Griess-reagens ble blandet med kultursupernatanten og fargeutviklingen ble målt ved 550 nm. Mengden av nitritt i kultursupernatanten ble bestemt basert på standardkurven for et natriumnitritt (0-100 pM) ferskt fremstilt i avionisert vann. Andel av NO hemming ble beregnet ved hjelp av formelen under: $$ \\ mathrm {NO} \\ \\mathrm{inhibitory}\\left(\\%\ ight)=\\frac{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*\\hbox{--} {\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{sample}}}{{\\left[\\mathrm{N}{{\\mathrm{O}}_2}^{\\hbox{-}}\ ight]}_{\\mathrm{control}}*}\\times 100 \\% $$ hvor; product: * kontroll er nitrittet nivået av IFN-γ /LPS-indusert gruppe
Celleviabilitet
cytotoksisiteten av MEMM på de dyrkede celler ble bestemt ved analysering av reduksjon av tre. - (4,5-dimetyl-2-tiazolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid (MTT) [27]. De MTT-reagenser (0,05 mg /ml) ble suspendert i steril PBS, pH 7,0 og deretter tilsatt til hver brønn etterfølgende for å fjerne supernatanten. Dette ble etterfulgt av inkubasjon av de gjenværende cellene ved 37 ° C i 4 timer fulgt av tilsetning av 100 pl 100% DMSO i brønnene for å oppløse de formazanfremstilling saltene som dannes. Absorbansen ble målt ved 570 nm. Prosentandelen av celle levedyktighet ble beregnet etter følgende formel: $$ \\ mathrm {Cell} \\ \\ mathrm {levedyktighet} \\ venstre (\\% \\ right) = \\ frac {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {kontroll}} * \\ hbox {-} \\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ {\\ mathrm {sample}}} {\\ mathrm {O} {\\ mathrm {D}} _ Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• En ny metode, oppdager digital genomet skanning KRAS genet forsterkning i mage kreft: involvering av overexpressed villtype KRAS i nedstrøms signalering og kreftcelle growth
• Genomisk profilanalyse av diffus-type mage cancers