impatto prognostico di rilevare cellule tumorali vitali circolanti nei pazienti affetti da cancro gastrico con un agente virale specifici telomerasi: un potenziale study

impatto prognostico di rilevare cellule tumorali vitali circolanti nei pazienti affetti da cancro gastrico con un agente virale specifici telomerasi: uno studio prospettico
Abstract
Sfondo
L'identificazione delle cellule tumorali (CTC) circolanti nel sangue periferico è un approccio utile per stimare la prognosi, monitorare la progressione della malattia, e misurare gli effetti del trattamento in diversi tumori maligni. Tuttavia, la rilevanza clinica di CTC è controversa. Abbiamo tentato di rilevare CTC vitali nel sangue periferico di pazienti affetti da cancro gastrico con un agente virale specifica-telomerasi.
Metodi
Abbiamo preso un campione di sangue da 7,5 ml da 65 pazienti affetti da cancro gastrico trattamento negativo prima dell'intervento chirurgico e 10 in buona salute volontari. Abbiamo rilevato CTC vitali nei campioni di sangue dopo il loro incubazione con una replica selettiva, oncolytic agente adenovirale specifici telomerasi che porta il gene verde proteina fluorescente (GFP) (OBP-401). GFP-positive CTC sono stati definiti come avente un diametro di almeno 7,735 micron; tale soglia è stata determinata dal ricevitore analisi della curva caratteristica di funzionamento. cellule GFP-positive sono state contate al microscopio a fluorescenza.
Risultati
vi era una differenza significativa nella sopravvivenza generale tra i pazienti con 0-4 e quelli con ≥ 5 CTC GFP-positive nella fase I-IV gruppo malattia e lo stadio II-IV gruppo di malattia avanzata. Il numero di CTC GFP-positive non è dipesa da stadio del cancro. Tra i reperti patologici, il numero di CTC GFP-positive è stato solo significativamente correlata alla invasione venosa, anche se c'erano le tendenze verso una maggiore CTC GFP-positive con la progressione della malattia (la profondità del tumore, metastasi linfonodali, metastasi a distanza, invasione linfatica, e tipo istologico )
. Conclusioni
C'è stata una relazione significativa tra il numero di CTC GFP-positive e la sopravvivenza globale nei pazienti con cancro gastrico. Il rilevamento delle CTC utilizzando OBP-401 può essere utile per la valutazione prognostica.
Registrazione di prova
University Hospital Medical Information Network in Giappone, UMIN000002018.
Parole
circolanti cellule tumorali del cancro gastrico telomerasi Sfondo
metastasi a distanza di un tumore solido è un forte fattore prognostico [1-3]. L'esistenza di cellule tumorali (CTC) circolanti nel sangue periferico suggerisce che un paziente è in una fase di malattia sistemica [4]. L'identificazione di CTC nel sangue periferico è un approccio utile per stimare la prognosi, monitorare la progressione della malattia, e misurare gli effetti del trattamento in seno, della prostata, della pelle, del colon e tumori gastrointestinali. Pertanto, vari metodi sono stati sviluppati per rilevare CTC, e sono talvolta utilizzati in combinazione. tecniche comuni per l'arricchimento e il rilevamento di CTC sono gradiente di densità di separazione [5], l'arricchimento diretto per filtrazione [6, 7], la separazione immunomagnetica [8], citometria a flusso [9], in tempo reale della trascrittasi inversa reazione a catena della polimerasi (RT PCR) [10, 11], e microchip Technology [12].
cellulare arricchimento per separazione gradiente di densità viene eseguita utilizzando kit commerciali come OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Germania) [13] e Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Norvegia) [14]. Densità separazione gradiente si basa sulla teoria che diversi tipi di cellule possono essere separati in base alla loro densità. Pertanto, è difficile estrarre tutti CTC causa della migrazione cellulare. RT-PCR è uno dei metodi più comuni di rilevamento delle cellule tumorali a causa della sua elevata sensibilità e specificità, assumendo adeguato primer e la progettazione della sonda. Tuttavia, i risultati falsi positivi possono verificarsi a causa della sua delicatezza tecnica e di alta sensibilità [15, 16].
Arricchimento immunomagnetica, come quella eseguita dal CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, USA) [ ,,,0],17], è attualmente la tecnica più comunemente usata per arricchire e rilevare CTC [18-21]. Il vantaggio della separazione immunomagnetica è che CTC possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza. Le cellule rilevate con anticorpi contro marcatori epiteliali (epiteliali molecole di adesione cellulare; EpCAMs) sono determinati ad essere CTC. Pertanto, questa tecnica può fornire risultati falsi positivi sulla base di normale espressione marcatore epiteliali da parte delle cellule non tumorali, e risultati falsi negativi possono verificarsi in mancanza di espressione marcatore selettivo sulle cellule tumorali. Come risultato delle limitazioni associate con approcci sopra, è necessaria una nuova tecnica per rilevare CTC vitali precisione.
Telomerasi svolge ruoli importanti nella carcinogenesi, cancro invasione e metastasi [22-24]. Abbiamo sviluppato una tecnica per sfruttare elevata attività della telomerasi nelle cellule. Questa tecnica utilizza una replica selettivo modificato agente virale specifici telomerasi (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokyo, Giappone) in cui la telomerasi umana trascrittasi inversa (TERT
) promotore del gene viene inserito nella regione E1 , e la proteina fluorescente (GFP) gene verde è posto sotto il controllo del promotore del citomegalovirus nella regione E3 come marker della replicazione virale [25]. E 'stato riportato che la OBP-401 può essere utilizzato per rilevare CTC vitali tra le cellule del sangue normali [26, 27].
Qui, abbiamo applicato il test di rilevare CTC vitali con il potenziale di metastasi nei pazienti affetti da cancro gastrico. Abbiamo rilevato CTC GFP-positive. Al contrario, è possibile che le cellule non tumorali emettono fluorescenza GFP dopo l'infezione OBP-401 [28]. Pertanto, abbiamo selezionato le celle più grandi di una soglia determinata dalla comparazione tra volontari sani e pazienti, perché CTC sono più grandi di cellule del sangue normali [7, 29, 30]. . Abbiamo studiato l'associazione di GFP-positive numero CTC con gli indici di sopravvivenza e patologici di progressione della malattia
Metodi
pazienti e volontari sani
I pazienti inclusi in questo studio preliminare sono quelli sottoposti a trattamento chirurgico programmato; pazienti che erano adatti per la resezione mucosa endoscopica o endoscopica della sottomucosa dissezione sono stati esclusi. I criteri di inclusione sono stati: (i) istologicamente provata adenocarcinoma dello stomaco dalla biopsia endoscopica; (Ii) clinico tumore solitario; (Iii) non prima endoscopico di resezione, la chemioterapia, la radioterapia o; (Iv) di età 20-80 anni; (V) performance status Eastern Cooperative Oncology Group [31] 0 o 1; (Vi) la funzione degli organi sufficienti; e (vii) il consenso informato scritto. I criteri di esclusione sono stati: (i) sincrona o malignità metacrona; (Ii) le donne in gravidanza o allattamento; (Iii) l'epatite virale attiva o cronica; (Iv) batterica attiva o infezione fungina; (V) diabete mellito; (Vi) la somministrazione sistemica di corticosteroidi; e (vii) ipertensione instabile. Lo stadio della malattia nei pazienti è stata caratterizzata patologicamente con la settima edizione della classificazione TNM della Unione internazionale contro il cancro [32]. La profondità del tumore in tre pazienti senza gastrectomia e lo stato dei linfonodi regionali di cinque pazienti senza linfoadenectomia sufficiente sono stati diagnosticati chirurgicamente.
Tutti i pazienti hanno partecipato nostro ospedale regolarmente dopo l'intervento chirurgico, e sono stati controllati ogni 3 mesi. I pazienti sono stati sottoposti a endoscopia e la tomografia computerizzata, almeno una volta l'anno, in base al loro stadio della malattia e naturalmente.
Abbiamo inoltre reclutati volontari sani di agire come controlli. Tutti i volontari sani sono stati dipendenti di Sysmex Corporation e inclusi sette uomini (età media 31,4 anni, range 24-39 anni) e tre donne (età media 33,7 anni, range 26-48 anni). Tutti i volontari sono stati sottoposti a controlli medici su occupazione e ogni anno; check-up incluso interviste mediche, l'auscultazione, radiografie del torace, e sangue e analisi delle urine. Inoltre, abbiamo effettuato colloqui individuali prima di raccolta dei campioni; ogni volontario che è stato al momento del trattamento medico, in stato di gravidanza o in allattamento, o che aveva donato il sangue entro il mese passato è stato escluso.
Virus
OBP-401, una replica selettivo agente adenovirale specifiche telomerasi in cui il TERT
elemento promotore guida l'espressione della
VIA e della BEI
geni, e in cui il gene GFP è integrato, è stato utilizzato in questo studio. La sensibilità e la specificità del test utilizzando OBP-401 sono stati studiati in precedenza da Kim et al. [27]. La prova è stata ripetuta cinque volte prova nel campione compreso 1 MDA-MB-468 (carcinoma mammario) cellule e 7,5 ml di sangue, e il numero di cellule GFP-positive erano 1, 1, 1, 2 e 3; nel campione di cui 20 MDA-MB-468 (carcinoma mammario), le cellule, il numero di cellule GFP-positivi sono stati 15, 17, 19, 22 e 24. campioni virali sono stati conservati a -80 ° C.
linee cellulari e cultura
l'A549 (carcinoma del polmone), HepG2 (carcinoma epatocellulare), HEC-1 (adenocarcinoma dell'endometrio), KATO-III (carcinoma gastrico) e SBC-3 (carcinoma polmonare a piccole cellule) linee di cellule sono stati ottenuti dalla sanità Science Research Resources Bank (Osaka, Giappone). Il LNCaP (adenocarcinoma prostatico) e OVCAR-3 (carcinoma ovarico) linee cellulari sono stati ottenuti dal Riken Cell Bank (Tokyo, Giappone). Le cellule sono state coltivate secondo le specifiche del fornitore. MDA-MB-468 cellule sono state coltivate come precedentemente descritto [27]
. Preparazione dei campioni e delle cellule contando
Un campione di sangue vena periferica da 7,5 ml è stato ottenuto da ciascun paziente prima dell'intervento chirurgico e da ogni volontario. I campioni sono stati prelevati in provette contenenti acido citrico, acido fosforico, e destrosio e conservati a 4 ° C. Il dosaggio è stato iniziato entro 48 ore.
I campioni sono stati centrifugati per 5 min a 540 g ed è stata rimossa la fase di plasma. Le cellule sono state quindi lavate quattro volte con tampone fosfato salino (PBS) e due volte con mezzo Roswell Park Memorial Institute. I campioni sono stati infettati con 4 × 10 8 unità formanti placca (PFU) di OBP-401 virus mediante incubazione nel mezzo per 24 ore a 37 ° C.
Dopo la colorazione di cellule morte dal rosso fluorescente reattiva dye L23102 (life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA), OBP-401 virus sono stati inattivati ​​e le cellule sono stati fissati con il 2% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente.
I campioni sono stati trattati con un tensioattivo agente (Emalgen 2025 G, Kao chimiche, Tokyo, Giappone) per 10 minuti a 40 ° C per degradare i globuli rossi. Infine, 7,5 ml di sangue è stato utilizzato per creare due campioni vetrino per l'analisi microscopica. Tutte le cellule GFP-positive sui due vetrini sono stati contati, utilizzando un microscopio a fluorescenza controllati dal computer (IX71, Olympus, Tokyo, Giappone) e un esaminatore in cieco per i dettagli del campione. Il tempo totale di test era 27,5 h (Figura 1). Figura 1 Protocollo e la procedura della "GFP-CTC Assay". Ogni campione di sangue vena periferica 7,5 ml è stato ottenuto da pazienti prima dell'intervento e da volontari. I campioni sono stati prelevati in provette contenenti acido citrico, acido fosforico e destrosio. I campioni sono stati centrifugati e la fase di plasma è stato rimosso. Dopo il lavaggio delle cellule con PBS e Roswell Park Memorial Institute media, i campioni sono stati infettati con 4 × 108 PFU di OBP-401 virus. virus OBP-401 è stato inattivato e le cellule sono stati fissati con il 2% paraformaldeide (PFA). I campioni sono stati trattati con un agente tensioattivo per degradare globuli rossi e bianchi. Due campioni di diapositive in vetro da 7,5 ml di sangue sono stati preparati per l'analisi microscopica. Tutte le cellule GFP-positive sui due slitte sono state contate utilizzando un microscopio a fluorescenza controllato dal computer.
Determinazione della soglia di intensità di fluorescenza GFP
La soglia per l'intensità di fluorescenza GFP è stato determinato come segue. Circa 30.000 cellule in coltura sono stati aggiunti in 7,5 ml campioni di sangue di volontari sani, che sono state aggiunte varie linee cellulari tumorali: A549, HepG2, HEC-1, KATO-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 e OVCAR -3. I campioni di sangue sono stati sottoposti a test di rilevazione CTC, e quindi le cellule rilevabili sono state contate al microscopio a fluorescenza. Più di 100 cellule sono state analizzate in ciascun campione. Abbiamo determinato 2.85 × 10 7 significare fluorocromo equivalente essere la soglia per l'intensità del segnale GFP dal livello di intensità GFP minimo osservato nel sangue campioni diluiti con linee cellulari (Figura 2). I dati sono riportati come il numero di CTC GFP-positive per campione di sangue periferico da 7,5 ml. Figura 2 GFP intensità di segnale provenienti da diverse linee di cellule tumorali. La parte inferiore e superiore della scatola sono i quartili inferiori e superiori, e la banda della scatola è la mediana. Le linee sulla fine delle basette sono minimo e massimo. L'asse y rappresenta intensità del segnale GFP su una scala logaritmica
Immunocolorazione
Ficoeritrina marcato anticorpi CD45 anti-umano (BioLegend, San Diego, CA, USA) è stato diluito 1:. 5 e Pacific Blue-etichettato anti-umano CD326 (EpCAM) anticorpo (BioLegend) è stato diluito 1:10 in PBS contenente 2% di siero fetale bovino. Le cellule sono state incubate con anticorpi diluiti per 30 minuti a 25 ° C. Dopo lavaggio con PBS contenente 2% di siero fetale bovino, le cellule sono state montate su vetrini e analizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza. (IX71, Olympus)
Analisi statistica
analisi statistica è stata effettuata utilizzando JMP statistica Discovery 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Per determinare la soglia del diametro delle cellule, i CTC GFP-positive rilevati sono stati analizzati utilizzando una curva ROC (ROC) tra i campioni di pazienti affetti da cancro gastrico e quelli da volontari. Per confronti multipli di gruppo, l'omogeneità della varianza è stata valutata mediante il test di Levene. Per i confronti parametrici abbiamo usato analisi della varianza e per confronto non parametriche abbiamo usato il Wilcoxon e il test di Kruskal-Wallis. Abbiamo usato di Fisher esatto e χ
2 test con 2 × 2 e un tavolo 4 × 2, rispettivamente, di confrontare i caratteri clinicopatologici nel gruppo di pazienti. Le curve di Kaplan-Meier di sopravvivenza libera da malattia e la sopravvivenza globale stimata sono stati generati, e il confronto tra i gruppi sono state eseguite utilizzando un log-rank test su due lati. P
Valori ≤0.05 sono stati considerati statisticamente significativi.
Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università Showa, Northern Yokohama Hospital. Abbiamo spiegato il protocollo di studio ai pazienti e ai volontari prima che ha dato il consenso informato scritto. Questo studio è stato registrato con l'Ospedale Universitario Medical Information Network in Giappone, il numero 000002018.
Risultati
caratteristiche Partecipante
Sessantacinque pazienti con adenocarcinoma gastrico (46 uomini e 19 donne, età media 58,8 anni, range 33 -76 anni) che hanno subito un intervento chirurgico alla Digestive Disease center della Northern Yokohama ospedale Showa Università tra il settembre 2009 e maggio 2011 sono stati inclusi in questo studio. Ventinove avuto gastrectomia distale, 32 avevano gastrectomia totale, e quattro avevano laparotomia esplorativa. caratteristiche dei pazienti sono riassunte nella Tabella 1. Ventotto dei 65 pazienti hanno ricevuto chemioterapia dopo l'intervento chirurgico. Il gruppo di controllo composto da 10 sani volunteers.Table 1 Le caratteristiche dei pazienti e patologici
Parametri
Numero di pazienti
sesso maschile

46
femminile
19
Age (media, gamma)
58,8, 33-76
gastrectomia distale

29
totale
32
Nessuno 4
chirurgica approccio
Laparoscopia
54
Aperto laparotomia
11
Curability
R0
57
R1
0
R2
8
TNM fase
I
40
II
6
III 10
IV
9
profondità del tumore dell'invasione
T1
36
T2
8
T3
9
T4
12
metastasi linfonodali
N0
39
N1
5
N2
6
N3
15
metastasi a distanza
M0
56
M1
9
principale tipo istologico †
differenziata
25
indifferenziato
40
linfatico invasione
LX 4
L0
35
L1
26
venosa invasione
VX 4
V0
35
V1-2
26
† Bene o moderatamente differenziato adenocarcinoma e adenocarcinoma papillare sono stati classificati come tipo differenziato. carcinoma a cellule ad anello con castone, adenocarcinoma scarsamente differenziato e adenocarcinoma mucinoso sono stati classificati come tipo indifferenziato. CTC
GFP-positive nel sangue periferico
Utilizzando un microscopio a fluorescenza, le cellule con emissioni fluorescenti ≥2.85 × 10 7 significano equivalente fluorocromo sono stati contati come cellule GFP-positive
per una varietà di cellule GFP-positive sono state osservate in ogni campione.; Pertanto, è stato difficile identificare una cellula rappresentante tra le cellule GFP-positive per il confronto tra pazienti e volontari sani. Pertanto, per evitare di utilizzare un valore arbitrario, abbiamo deciso di utilizzare la soglia ottimale derivata dall'analisi ROC base alla dimensione della cella, cioè 7,735 micron, come soglia per definire CTC GFP-positive (figura 3). Figura 3 Confronto di diametro cellulare tra i pazienti e volontari. Per determinare la soglia, abbiamo confrontato i diametri delle cellule da pazienti affetti da cancro gastrico e controlli mediante analisi ROC. C'è stata una differenza significativa tra i pazienti affetti da cancro gastrico ed i controlli (p
< 0,001; area sotto la curva = 0.57; 95% intervallo di confidenza = 0,54-0,60)
da colorazione immunoistochimica utilizzando anti-EpCAM e. anticorpi anti-CD45, abbiamo confermato che CTC GFP-positive erano EpCAM-positivi e CD45-negativi (Figura 4). Figura 4 Esempi di immagini microscopiche. Immagini rappresentative da due campioni di cancro gastrico di CTC GFP-positive e analisi immunocitochimica di anti-EpCAM- e le cellule anti-CD45-positive. Le cellule sono state contate utilizzando un computer controllato microscopio a fluorescenza da un esaminatore in cieco per lo stato del campione. barra della scala, 10 micron.
Il numero di CTC GFP-positive nei campioni di sangue periferico sono mostrati in Figura 5. Non c'era alcuna differenza significativa tra i tassi di rilevamento delle CTC GFP-positive nei campioni che rappresentano ogni fase del cancro. Figura 5 Numero di cellule GFP-positive. I punti sono i numeri di CTC GFP-positive nei campioni dei pazienti. La parte inferiore e superiore della scatola rappresentano i quartili inferiori e superiori, e la band attraverso il dialogo mostra la mediana. Le barre inferiori e superiori alle estremità dei baffi mostrano il punto più basso di dati a 1,5 interquartile gamme di quartile inferiore, e il più alto punto di dati all'interno di 1.5 interquartile range del quartile superiore, rispettivamente. Le barre verdi indicano valore medio.
Associazione CTC GFP-positive con la sopravvivenza
Il numero medio di CTC GFP-positive nei campioni provenienti da 10 volontari sani è stato 4,8. Abbiamo diviso i pazienti in due gruppi in base al numero di CTC GFP-positive: 0-4 e ≥5. Le caratteristiche clinico-patologici dei due gruppi sono riassunti nella Tabella 2. Non vi era alcuna differenza significativa tra i due gruppi, tranne che c'era solo una categoria di linfatici metastasis.Table 2 caratteri clinico-patologiche dei due gruppi di pazienti in base al numero di CTC
Numero di CTC
0-4
5 ≤
P
valore
Numero di soggetti
41

24
TNM: fase
0,1586
fase I
29
11
fase II Pagina 4 2
Stadio III
4
6
stadio IV 4
5
TNM: T categoria
0,2753
T1
26 10
T2
5 3
T3
5 4
T4
5 7
TNM: categoria N
0,0257 *
N0
27
12
N1
5
0
N2 4
2
N3
5 10
TNM: M categoria
0,2121
M0
37
19
M1 4
5
principale tipo istologico
0,6844 tipo
differenziata
15 10
tipo indifferenziato
26
14
linfatico invasione
0,3177
Lx
2 2
L0
25 10
L1
14
12
invasione venosa
0,1293
Vx
2 2
V0
26
9
V1-2
13
13
Chirurgia
0,2124
resezione curativa
38
19
non curativo resezione
1 3
No resezione 2
2
postoperatoria chemioterapia
0,1672
Presenza
15
13
Assenza
26
11
* * differenza significativa.
figura 6a mostra la Kaplan curve -Meier per la sopravvivenza totale nei due gruppi: i pazienti con 0-4 CTC e quelli con ≥5. C'è stata una differenza significativa tra i due gruppi (p = 0,0021
). Inoltre, nei pazienti di cancro gastrico avanzato con malattia in stadio II-IV, vi era una differenza significativa tra i due gruppi (p = 0,0126
) (figura 6b). Figura 6 La sopravvivenza globale. (A) La sopravvivenza globale di tutti i pazienti. (B) la sopravvivenza complessiva dei pazienti con malattia in stadio II-IV. La sopravvivenza è stata confrontata in base al numero di CTC utilizzando l'analisi di Kaplan-Meier e le statistiche log-rank. ** P
< 0,01, p *
< 0.05.
Associazione CTC GFP-positive con indici patologici
Non c'era alcuna relazione significativa tra il numero di CTC GFP-positive e stadio del cancro (p = 0,2313
) (Figura 5). Anche se è stata osservata alcuna significatività statistica, il numero di CTC GFP-positive tendeva ad aumentare con la progressione del tumore primario (p = 0,1521
) (Figura 7a). Il numero di CTC nei campioni dei pazienti con linfonodi positivi era superiore a quella nelle pazienti con linfonodi negativi (p = 0,1752
) (Figura 7b). Rispetto ai pazienti senza metastasi a distanza, quelli con metastasi a distanza avevano un numero simile di CTC GFP-positive (p = 0,5655
) (Figura 7c). Non c'era una differenza significativa tra il tipo differenziato e indifferenziato (p = 0,8387
) (Figura 7d). Il numero di CTC erano simili nei campioni di pazienti con e senza invasione linfatica (p = 0,2054
) (Figura 7e). Per l'invasione venosa, il numero di CTC nei campioni provenienti dai pazienti con invasione era significativamente più alta rispetto ai pazienti senza invasione (p = 0,0351
) (Figura 7f). Figura 7 Rapporto tra il numero di CTC GFP-positive in un campione di sangue da 7,5 ml da pazienti affetti da cancro gastrico e reperti patologici nei pazienti. I punti sono i numeri di CTC GFP-positive nei campioni dei pazienti. La parte inferiore e superiore della scatola rappresentano i quartili inferiori e superiori, e la band attraverso il dialogo mostra la mediana. Le barre inferiori e superiori alle estremità dei baffi mostrano il punto più basso di dati a 1,5 interquartile gamme di quartile inferiore, e il più alto punto di dati all'interno di 1.5 interquartile range del quartile superiore, rispettivamente. un tumore profondità di invasione (T1-T4 indicare aumento della profondità). b, linfatico metastasi (N0 = negativo, N1-3 = positivo). c, Metastasi a distanza (M0 = negativo, M1 = positivo). d, tipo istologico (tipo differenziato e tipo indifferenziata). e, linfatico invasione (L0 = negativo, L1 = positivo). f, l'invasione venosa (V0 = negativo, V1 = positivo), * p
< 0.05. Anche se solo l'invasione venosa visualizzata una differenza statisticamente significativa, c'erano alcune tendenze verso un aumento nel numero di CTC con la progressione della malattia in aumento.
Discussione
Questo documento riporta la correlazione tra CTC e il cancro gastrico, che è la seconda causa di correlate al cancro morte nel mondo. L'utilità del rilevamento delle CTC nella diagnosi, la stima della prognosi, e la valutazione degli effetti del trattamento è già stato segnalato per il seno [27, 33], della prostata [34], del polmone [35] e del tratto digestivo [11, 36, 37 ] tumori. Questo studio indica che è utile anche per il cancro gastrico.
Uno dei principali risultati del nostro studio è stato un rapporto significativo tra il numero di CTC e la prognosi. Anche se abbiamo usato un breve periodo di follow-up, la prognosi dei pazienti che avevano ≥ 5 CTC nei loro 7,5 ml campioni di sangue periferico era povera. I pazienti con malattia in stadio precoce in genere hanno un tasso di recidiva inferiore [38], e quelli con malattia in stadio I in realtà non ha avuto recidive nel nostro studio. Abbiamo inoltre calcolato il tasso di sopravvivenza nei pazienti affetti da cancro gastrico avanzato con stadio di malattia II-IV, e ha mostrato che questi pazienti avevano un modello di sopravvivenza simili a quelli con malattia in stadio I-IV. Questi risultati suggeriscono che la chemioterapia preoperatoria o trattamento completo è appropriato per i pazienti malattia avanzata che hanno molti CTC in campioni pre-trattamento a causa della loro cattiva prognosi. Con gli nostri risultati patologici, solo l'invasione venosa aveva una relazione significativa con il numero di CTC. Questo suggerisce accordo tra la patologia tradizionale e tecnologia molecolare moderna. Noi crediamo che la mancanza di una differenza significativa tra il numero di CTC rilevati dal nostro test e gli altri indici patologici può essere spiegato da problemi metodologici quali la dimensione piccolo campione. La nostra tecnica ha funzionato bene come uno strumento di valutazione prognostica - di fornire informazioni circa la necessità di una terapia adiuvante post-operatoria - e può fornire uno strumento ausiliario utile per la classificazione patologia a base di
Non è chiaro se tutti i CTC rilevate hanno un potenziale metastatico.. CTC vitali sono stati rilevati nei campioni di pazienti affetti da cancro in fase iniziale nel presente studio, ma quasi tutti i pazienti del gruppo di fase I sopravvissuti senza recidive [38]. Abbiamo intenzione di confermare se le cellule tumorali resistenti, come le cellule staminali del cancro, erano presenti nelle cellule GFP-positive rilevate. Inoltre, analizzeremo le funzioni del CTC vitali singolarmente dopo l'ordinamento delle cellule, e di identificare CTC con un potenziale metastatico utilizzando strumenti aggiuntivi come l'analisi ploidia del DNA [39, 40]. Inoltre, profili di espressione genica tra CTC vitali, le cellule morte, tumori primari, e tumori metastatici rivelerà informazioni importanti relative ai meccanismi di metastasi del cancro.
I nostri risultati devono essere interpretati con una certa cautela, considerando i limiti di questo studio. In primo luogo, il numero di CTC variava notevolmente tra gli individui, compresi i pazienti e volontari sani. Inoltre, non è stata influenzata dalla fase del tumore o la presenza di metastasi clinicamente rilevabili. Allo stesso modo, non vi era alcuna associazione tra la presenza di metastasi (linfonodi o distanti) o l'invasione e il numero di CTC, che mette in discussione l'uso di CTC per prevedere il potenziale metastatico. Tuttavia, è possibile che la dimensione del campione relativamente piccolo limita il potenziale per rilevare differenze reali tra questi gruppi di pazienti. Infine, si deve riconoscere che i nostri risultati sono applicabili solo a preoperatoria, cancro gastrico naïve al trattamento e non devono essere generalizzati ad altri tipi di cancro.
Chiaramente, più studi in un numero maggiore di pazienti, e con diversi tipi di cancro , sono necessari per chiarire l'applicabilità clinica di rilevazione CTC. Ora stiamo preparando uno studio per analizzare gli effetti del trattamento del cancro gastrico sul numero di CTC, che dovrebbe aiutare a stabilire il loro rapporto con la progressione della malattia futuro e se conteggio CTC può aiutare scelta guidetherapy.
Conclusioni
C'era un differenza significativa nella sopravvivenza tra i pazienti con 0-4 CTC e quelli con ≥5. Tuttavia, non è chiaro se tutti i CTC hanno vero potenziale metastatico, e sono necessari ulteriori studi
. Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta in parte da un Grant-in-Aid per impugnare la ricerca esplorativa (23.659.308) dalla Società giapponese per la promozione della Scienza (JSP). L'organismo di finanziamento non ha svolto alcun ruolo nel disegno dello studio; nella raccolta, analisi, o l'interpretazione dei dati; nella scrittura del manoscritto; o nella decisione di inviare il manoscritto per la pubblicazione. Siamo grati a tutti i pazienti e volontari che hanno donato il sangue a questo studio. Vorremmo ringraziare il professor Toshiyoshi Fujiwara (Okayama University Graduate School of Medicine, Okayama, Giappone) per la fornitura di utili commenti e suggerimenti; Mr Yasuo Urata (Oncolys BioPharma, Tokyo, Giappone) per la fornitura di OBP-401; Dr Yukio Tsujino, il dottor Toshiyuki Ozawa e il dottor Akinori Masago (Sysmex Corporation, Kobe, in Giappone) per il loro utile sostegno; e il dottor Rebecca Devon (Genetica e Università di Edimburgo, Edimburgo, Regno Unito) per la revisione critica e l'editing del manoscritto. Siamo anche molto grati al personale clinico.
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