Den karakteristiske magesaft proteom- i magekreft avslører en multi-biomarkør diagnostisk profile

Den karakteristiske magesaft proteom- i magekreft avslører en multi-biomarkør diagnostisk profil
Abstract
Bakgrunn
Totalt magekreft overlevelse er fortsatt dårlig hovedsakelig fordi det finnes ingen pålitelige metoder for å identifisere svært helbredelig tidlig stadium sykdommen. Multi-protein profilering av mage væsker, hentet fra anatomisk sted for patologi, kunne avsløre diagnostiske proteomikk fingeravtrykk.
Metoder
Protein profiler ble generert fra mage væskeprøver av 19 magekreft og 36 godartede gastritides pasienter som gjennomgår elektiv, klinisk er indikert gastroskopi bruker overflaten forbedret laser desorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri på flere ProteinChip arrays. Proteomikk funksjoner ble sammenlignet med betydningen analyse av microarray algoritme og to-veis hierarkisk clustering. En andre blindet prøvesett (24 mage kreft og 29 klinisk godartede gastritides) ble brukt for validering.
Resultater
Av betydning analysyis av microarray, 60 proteomikk funksjonene var oppregulert og 46 ble nedregulert i magekreftprøver (p
< 0,01). Multimarker clustering viste to karakteristiske proteomikk profiler uavhengig av alder og etnisitet. Atten av 19 kreftprøver gruppert sammen (sensitivitet 95%), mens 27/36 av ikke-kreftprøver samlet i en annen gruppe. Ni ikke-kreftprøver som klynger med kreftprøver inkludert fem pre-maligne lesjoner (1 adenomatøs polypp og 4 intestinal metaplasi). Validering ved hjelp av en andre prøvesett viste sensitivitet og spesifisitet til å være 88% og 93%, respektivt. Positiv prediktiv verdi av kombinerte data var 0,80. Valgt peptid-sekvensering identifisert pepsinogen C og pepsin A aktivering peptid som signifikant nedregulert og alpha-defensin som signifikant oppregulert.
Konklusjon
Denne enkle og reproduserbar multimarker proteomikk analysen kunne supplere klinisk gastroscopic evaluering av symptomatiske pasienter for å forbedre diagnostisk nøyaktighet for magekreft og pre-maligne lesjoner.
Bakgrunn
motsetning til andre vanlige kreftformer, er prognosen for de fleste mage kreftpasienter dårlig og har forbedret seg lite de siste tiårene. Fem års overlevelse for magekreft er betydelig lavere enn alle de store kreftformer unntatt kreft i lever, bukspyttkjertel og spiserør [1]. Gitt at tidlig magekreft har en mye bedre prognose (5-års overlevelse ca 90%) enn avansert magekreft (5-års overlevelse 3-10%) [2, 3], global dødelighet av magekreft bør reduseres vesentlig ved tiltak som gir downstaging av svulster på tidspunktet for første diagnose.
Selv gastroskopi er gullstandard for magekreft diagnose, er nøyaktigheten ikke så høyt som det er for snille mage sykdommer som magesår, særlig i geografiske områder av lav til middels utbredelse magekreft. Prosentandelen av tapte kreftdiagnose, rapportert som 4,6%, 14% og til og med 33% [4-6], er ikke ubetydelig. Selv i Japan, ble den feilaktig negative klassifiseringen rapportert å være 19% [7]. Disse dataene er konsistent med positiv prediktiv verdi på kun 0,4 til 0,7 for endoskopisk diagnose av magekreft i ulike sentre [8-10]. Selv om andelen tapte diagnoser vises liten, det absolutte antall pasienter nektet fordel for diagnose ved en herdbar trinn er ikke ubetydelig. Selv på et beskjedent lav falsk positiv diagnose rente på 5%, ville mer enn 47.000 mage kreft har vært savnet i en lav prevalens land alene (USA) i et enkelt år, 2000 [11]. Endoskopisk Vurderingen omfatter ofte slimhinnebiopsi, men det finnes ingen kliniske standarder for enten det optimale antallet biopsier eller anatomiske områder som bør prøves. En ofte sitert anbefaling er å ta minst sju biopsier til riktig diagnose magekreft [12]. I denne studien ble imidlertid fullt ut 17% av alle lesjoner i ettertid vist seg å være ondartet betraktet godartet på endoskopi. Dermed lider endoskopisk slimhinnene undersøkelse fra inter-observatør variasjon, suboptimal sammenheng med histopatologi, vanskeligheter med å oppdage submukøse kreft og uhindret visualisering av alle anatomiske sub-regioner f.eks . Etter foregående gastrisk kirurgi [13, 14]
magevæske består av en blanding av utskilte løselige og skrubbet cellulære proteiner fra hele den gastriske slimhinne - inklusive områder som ikke kan være tilstrekkelig vurderes av fiberoptisk gastroskopi. Vi har derfor begrunnet at proteomikk profilen til magevæske, vanligvis betraktet som et avfalls biprodukt under gastroscopic undersøkelse, kunne med fordel supplere konvensjonell klinisk evaluering ved å tilby en "molekylær biopsi 'som effektivt prøver hele mageslimhinnen, særlig ettersom protein påvisningsteknikker slike som massespektrometri kan være svært følsom. Hvis det utføres i løpet av klinisk indisert gastroskopi, tillater oppnåelse magevæske ikke øke invasivitet av prosedyren. I motsetning til plasma proteome, er fluid gastrisk proteome sannsynlig å være mindre komplisert, men anriket med sykdomsspesifikke biomarkører, blir generert direkte ved sykdomsstedet. De samme biomarkører, selv hvis det finnes i plasma, kan fortynnes utover grensene for deteksjon og blandes med andre mer rikelig systemiske proteiner som reflekterer samtidige pathophysiologic forhold (for eksempel komorbide sykdommer), heller enn anatomisk sted-spesifikk sykdom.
Vi har undersøkt en ny tilnærming til utviklings biomarkører for magekreft ved å profilere løselige utskilte peptider til stede i endoskopisk aspirert magevæske og proteiner hentet fra ekspandert epitelceller, også utvinnes under endoskopi av overflaten forbedret laser desorpsjon-ionisering time-of-flight (SELDI TOF) massespektrometri. Våre resultater tyder på at flere protein biomarkører fra en organspesifikk kilde dvs. magesaft, generere en særegen magekreft signatur som fortjener videre utvikling som et verktøy for å bedre diagnostisk nøyaktighet av gastroskopi og har potensial for å påvise tidlig magekreft og premaligne lesjoner (intestinal metaplasi og dysplasi).
Metoder
kliniske prøver
Gastric væsker ble oppnådd under gastroskopi av natten fastet pasienter sett på Singapore General Hospital. Studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen i Singapore General Hospital. og likedannet til bestemmelsene i Helsinkideklarasjonen 1995. Indikasjoner for gastroskopi var utelukkende klinisk og var uavhengig av studien. Innledende analyse ble utført på et treningssett av 19 prøver fra histologisk verifisert mage-adenokarsinomer (13 intestinal type, 4 diffus typen, en blandet type, en ubestemt) [15] og 36 prøver fra pasienter med klinisk godartet gastrisk betingelser. Gjennomsnittsalderen på 19 mage kreftpasienter (13 mannlige, 6 kvinnelige, 17 kinesere, to indiske) var 68 år. Fordeling av amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) klinisk staging var stadium 0 (1 pasient), stadium I (4 pasienter), stadium II (2 pasienter), stadium III (2 pasienter) og stadium IV (10 pasienter). Gjennomsnittsalderen på 36 pasienter med godartet mage forhold (19 mannlige og 17 kvinnelige, 33 kinesiske, 2 Malay, en indisk) var 57 år. Kliniske diagnoser etter endoskopi av ikke-kreft pasienter var i normal (9), antral gastritt (9), gastritt (6), sår (4), hiatushernie (3), hyperplastiske polypper (2), Barretts øsofagus (1), fundisk arr (1) og adenomatøs polypp (1).
klassifiseringen algoritme utviklet fra treningssettet ble testet ved blindet analyse av et valideringssett bestående av en annen 24 histologisk bekreftet gastriske adenokarsinomer (10 intestinal type, 7 diffus typen, en blandet type, 5 ubestemmelig, en nevroendokrin) og 29 klinisk godartet mageprøver. Gjennomsnittsalderen for disse 24 mage kreftpasienter (18 hanner, 6 kvinner, 21 kinesiske, 3 Malay) var 70 år. Fordeling av AJCC klinisk staging var stadium I (5 pasienter), stadium II (4 pasienter), stadium III (2 pasienter) og stadium IV (12 pasienter). En pasient i valideringssettet falt videre undersøkelser og kunne ikke bli avholdt. Gjennomsnittsalderen av 29 ikke-kreftpasienter (11 mannlige, 18 kvinnelige, 26 kinesiske, to indiske, en malayisk) var 47 år. Kliniske diagnoser etter gastroskopi av ikke-kreft pasienter var i gastritt (14), fundisk kjertel polypper (2), akutt magesår (2), duodenitt (2), hiatushernie (1) og normale (8). Ingen av
mage kreftpasienter som hadde fått noen form for kreftbehandling ved gastroskopi.
Tar trening og validerings tilfeller sammen, 19% (8/43) og 29% (19/65) av pasientene med magekreft og godartet gastrisk forhold, henholdsvis var positive for H. pylori
, en forskjell som ikke var signifikante ved Fishers eksakte test (2-sidig p
verdi = 0,4508).
Prøvetaking og behandling
Gastric væske ble aspirert inn i en steril beholder ved begynnelsen av endoskopi, tildelt en anonymi- kode og umiddelbart plassert på is. Blod- eller galle-farget prøvene ble avvist. Kun klinisk mistenkelige slimhinnere ble vevsprøve ved skjønn av endoscopist. Magevæskene ble sentrifugert ved 180 g i 6 minutter ved 4 ° C, hvorfra den overliggende væsken ble sentrifugert igjen ved 16 100 g i 30 minutter ved 4 ° C. Pellets fra begge sentrifugeringer ble kombinert. Den høye hastighet supernatanter ble lagret separat fra pelletene ved -80 ° C. Protein
profilering
Etter tining, ble 10 mL av hver magefluidprøven påføres på forskjellige kjemiske overflater av ProteinChip arrays (Ciphergen Biosystems Inc, California , USA): (a) kobber (II) immobilisert Metal Affinity Capture (IMAC3) i nærvær av 100 ul av 1 mol /l urea, 1 g /l 3 - [(3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat ( CHAPS), 0,3 mol /L KCl, proteasehemmer cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), 50 mol /L TrisHCl, pH 7,5; (B) svak kationbytter (WCX2 og CM10) i nærvær av 100 ul 50 mmol /l natrium-acetat, 1 g /l oktyl glukopyranosid, protease inhibitor cocktail, pH 5; (C) Sterk anionbytter (SAX2) i nærvær av 100 ul 50 mmol /L Tris-HCl, 1 g /L CHAPS, protease inhibitor cocktail, pH 8; og (d) Hydrofob interaksjonskromatografi (H50) i nærvær av 100 ul av 5 ml /l trifluoreddiksyre. Etter vasking med 100 ul av de samme respektive buffere, ble sinapinic syre tilsettes for å lette desorpsjon og ionisering. Sjetongene ble analysert ved SELDI-TOF-MS (PBSII, Ciphergen Biosystems Inc). Kreft og kontroller ble blandet og kjørt samtidig på den samme brikke og på flere brikker for å minimalisere chip-til-chip variasjon.
Den magevæske Pelletene ble resuspendert i 25 ul av 6 mol /l guanidintiocyanat, 5 g /l oktyl- glukopyranosid, 0,1 mol /liter Hepes pH 7, og 100 til 200 ul av 9 mol /l urea, 2 g /l CHAPS, 50 mmol /l Tris-HCl, pH 7,5 ved å virvle i 45 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering ved 20 000 g i 5 minutter, ble 10 ul av ekstraktet anvendt for å ProteinChip matriser som beskrevet ovenfor., En retentat kart ble generert på hvilken de enkelte proteiner ble vist som separate topper på grunnlag av deres masse for å lade forholdet . Data om proteomikk spektra ble analysert ved Ciphergen Express Data Manager-programvare med mønster Track og to-veis hierarkisk clustering algoritmen. Fluktende topper med signal til støyforhold over 3 ble normalisert ved total ionestrøm. Proteomikk funksjoner ble analysert videre med betydningen analyse av mikromatriser (SAM) programvare fra Stanford University. Pakken er designet for å løse problemer som er spesifikke for microarray dataanalyse (signal til støyforhold varians forskjellig fra gen til gen, stort antall datapunkter fra et lite antall prøver), men vi fant det å være gjeldende for proteomikk dataanalyse i tillegg. Algoritmen av programvaren ble beskrevet av Tusher et al
. [16]. I korte trekk defineres det en beregning som kalles den relative forskjellen for å måle forskjellen mellom to eller flere grupper av data i stedet for p
verdi. Det anvendes en variasjon av bootstrapping fremgangsmåte og gjentatte ganger deles en gitt datasett (spektra inneholdende de proteomic funksjonene i denne studien) tilfeldig i to grupper for å beregne den relative forskjell for hver av kombinasjonsmuligheter. Antall permutasjoner ble satt til å være 1000 i denne studien, og programvaren beregnet 1000 relativ differanseverdier for hver proteomikk funksjon. Den relative forskjellen i bestemt gruppering av interesse (observerte relative forskjell) ble sammenlignet med den gjennomsnittlige relative forskjell fra alle permutasjoner (forventede relative forskjell) for hver funksjon og funksjonen ble bedømt til å være opp- eller ned-regulert i henhold til om dens observerte relative forskjellen var større eller mindre enn dens forventede relative forskjell av noen terskel. Programvaren beregnet en falsk funnrate (også definert i referanse [16]) for hver terskelverdi som ga en indirekte måte å sette cutoff. Markørene er identifisert ved denne metode var statistisk signifikante. Den falske funnraten ble satt til å være mindre enn 0,05 i denne studien.
Til validere markører identifisert av SAM, ble en annen gruppe med 53 blindet prøver lagt til datasettet for hierarkisk clustering bruker Ciphergen Express Data Manager programvare. Mens de kjente prøvene brukes av SAM å velge markørene var forventet å gjøre det bra i clustering ble blindet prøvene tatt med for å teste hvor godt markørene generalisere til ukjente prøver. Resultatene av clustering ble rett og slett sammenlignet mot den sanne identiteten til prøvene og ingen avansert klassifisering metode eller annen programvare ble brukt i valideringen.
Biomarker identifikasjon
magesaft proteiner ble fraksjonert ved anionbytterkromatografi (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), ved hjelp av trinnvise endringer i pH for eluering. Proteiner i 50 mmol /L Tris-HCl, 1 g /l oktyl glukopyranosid, pH 8 elueringsmidler ble ytterligere renset på en kationebytter array (LWCX30) ved anvendelse av 50 mmol /l natrium-acetat, 1 g /l oktyl glukopyranosid, pH 5 som binding og vaskebuffer. Etter tilsetning av a-cyano-4-hydroxycinnamic syre energiabsorberende molekyler (Ciphergen Biosystems Inc.), ble de tilbakeholdte proteiner analysert ved PBSII og Q-TOF (Waters /Micromass) er utstyrt med en ProteinChip grensesnitt (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc) . Proteiner ble preget av MS /MS fragmentering og identifikasjon ble gjort av databasesøk med Mascot (Matrix Science Ltd., London, UK).
Biomarker validering
Dette ble utført i et tredje sett med mage væskeprøver tatt fra godartet mage og magekreftpasienter. Hver friskt oppsamlet prøve ble behandlet for å fjerne fast avfall og for å konsentrere proteininnholdet som følger. Etter tilsetning fenylmetansulfonylfluorid til en sluttkonsentrasjon på 0,2 mM, ble prøven sentrifugert i 15 minutter ved 500 g og 4 ° C. Proteasehemmere (Komplett Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) ble tilsatt til supernatanten fulgt av sentrifugal membranfiltrering ved 2 900 g og 15 ° C (Amicon Ultra-4 sentrifugale filter enhet, 5 000 nominell molekylvektgrense; Millipore, Billerica, MA, USA) inntil prøven ble redusert til 10 - 20% av sitt opprinnelige volum. Total proteinkonsentrasjon ble bestemt ved 2-D-Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogen C og alfa-defensin 1-3 konsentrasjoner ble bestemt av enzymbundet immunoassay (ELISA) med kits fra Alpco Diagnostics (Salem, NH, USA) og Hycult bioteknologi B.V. (Uden, Nederland), respektivt. Hver behandlede prøven ble analysert i duplikat for pepsinogen C og defensin nivåer med leverandørenes protokoller. Prøver for pepsinogen C-analysen ble pre-fortynnet 120 ganger. Konsentrasjoner av pepsinogen C og alfa-defensin 1-3 ble avledet med henvisning til sine respektive standardkurver og uttrykt som ng (pepsinogen C) eller pg (defensin) per mikrogram av total magevæske protein.
Helicobacter pylori
tilstedeværelsen av H. pylori i mage
vev ble identifisert ved visualisering av spiralmikroorganismer i histologiske seksjoner og /eller ved immunhistokjemi. Fire-micron vevssnitt ble de-vokset i xylen og minkende kvaliteter av etanol. Antigen gjenfinning var ved oppvarming i citratbuffer, pH 6,0. Det primære antistoff mot H. pylori plakater (1:50 fortynning; DAKO A /S, Glostrup, Danmark) ble etterfulgt av det sekundære antistoff polymeren kobling (Envision Chem Mate, DAKO) og visualisert ved anvendelse av diaminobenzidin som kromogen
. resultater
flere opp- eller nedregulert protein biomarkører i magekreft ble oppdaget i magevæske. En representativ proteomikk kart over mavesaft er vist i figur 1. Det er en gel riss av et massespektrum som viser magevæske proteinene selektivt bundet til immobilisert kobber (II) metall-ion i molekylvektområdet på 1500 Da 6000 Da. Betydelige proteinmarkører ble funnet å være nedregulert i kreft magevæske (p
< 0,01) er angitt med piler. Figur 1 Expression forskjell kartet magevæske på kobber (II) immobilisert metall affinitet fangst ProteinChip array (IMAC3). Piler indikerer protein biomarkører signifikant forskjellige i uttrykket nivå mellom de to grupper av prøver., En representativ proteomikk kart over magevæske pellet ekstrakt er vist i figur 2. Proteiner ble selektivt bundet til en kationbytter-matrise overflate. Betydelige proteinmarkører ble funnet å være opp- eller ned-reguleres i magekreft fluid pellet (p
< 0,01) er angitt med piler. Figur 2 Expression forskjell kartet magevæske pellet ekstrakt på kationerbytter ProteinChip array (WCX2). Pilene viser protein biomarkører vesentlig forskjellige i uttrykk nivå mellom de to gruppene av prøvene
Gjennomsnittlig CV. (Variasjonskoeffisient, kumulativ i 10-15 store magesaft topper per spekteret, n = 8) for immobilisert kobber (II) ProteinChip matrise (IMAC3) var 12,8%, for kationbytter array (WCX2) var 15%, for anionbytter-array (SAX2) var 17,3%, og for hydrofob interaksjon brikke (H50) var 13,6%. Disse CV verdier er i tråd med reproduserbarhet vurdering i SELDI litteraturen [17, 18].
Av Sam analyse av alle proteomikk funksjoner (totalt antall funksjoner 41 800, gjennomsnittlig antall per retentat kartet 314) i magevæske og pellet ekstrakt , 46 proteomikk funksjoner ble funnet å være signifikant nedregulert i magekreft og 60 proteomikk funksjonene var signifikant oppregulert i magekreft. (Data fra ulike forhold, for eksempel, væske og pellet samt ulike overflater, ble bare samlet sammen som forskjellige funksjoner for SAM. Markers rapportert av SAM i både pellets og overliggende fraksjoner ble manuelt identifisert og representerte bare én gang på listen etter at de var anses biologisk signifikant). Betydelig nedregulert markører inkludert 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; signifikant oppregulert markører inkludert 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (De fleste av de store merkene ble oppdaget på WCX2 og IMAC-kobber (II), etterfulgt av SAX2). Basert på 106 vesentlig forskjellige proteomikk funksjoner (Tilleggs fil 1), ble to-veis hierarkisk clustering analyse (todimensjonal komplett kobling) utføres. De fleste av de magekrefttilfeller var gruppert sammen for å danne en særegen gruppe (figur 3 og tilleggsfiler 2). Prinsipal komponent analyse av de samme dataene avslørte også at kreft og godartede prøvene kunne godt adskilt i to grupper, med 2 falske negativer (som representerer duplikat analyse av det samme tilfelle) og 9 falske positive, henholdsvis (figur 4). En magekreft væskeprøve (fra et tilfelle av stadium I dårlig differensiert adenokarsinom i ventrikkel) gruppert blant ikke-kreft prøver; alle de andre fire tidlig stadium (trinn 0 og jeg) pasienter riktig gruppert med prøver fra 14 pasienter med stadium II - IV magekreft, noe som gir en samlet diagnostisk sensitivitet på 95% (18/19 magekreftpasienter) på treningssettet. Figur 3 Expression forskjell kartet magevæske og pellets ekstrakt proteiner av opplærings sett prøver på fire ProteinChip arrays, som vises i to-veis hierarkisk clustering. Vesentlige proteomikk funksjonene vises vertikalt. Intensiteten av gråtoner angir graden av relativ proteinnivå, høyere eller lavere enn medianverdien. Pasient tilfeller presenteres horisontalt; de fleste mage kreftpasienter er tett gruppert sammen. Denne figuren viser den øvre kvartil av hele bildet (se Tilleggs fil 2 for hele bildet).
Figur 4 Prinsipal komponent analyse tomt på proteomikk funksjoner i trening sett prøver. En enkelt plan (merket med svart linje) deler prøvene inn i to grupper med en falsk negativ (vist i dupliserte flekker) og 9 falske positiver.
Ni av 36 ikke-kreftprøver i treningssettet gruppert med kreftprøver (spesifisitet 75%). Av disse er 1 hadde en dysplastic adenomatøs polypp - en forstadier lesjon [19]. Blant de andre 8 pasientene hadde 6 klinisk rettet biopsier som avslørte intestinal metaplasi hos 4 pasienter (67%). Åtte ikke-kreft pasienter med gastrisk fluid proteinprofiler gruppert i normalgruppen også hadde klinisk rettet slimhinne biopsier som viste intestinal metaplasi i bare 2 pasienter (25%). En gjennomgang av 1000 påfølgende mage biopsi utføres for alle indikasjoner viste en samlet forekomst av tarm metaplasi i Singapore General Hospital i løpet av studieperioden på 30%. Dette står i kontrast til utbredelsen av minst 67% av intestinal metaplasi blant klinisk godartede tilfeller som proteomikk profiler gruppert tettere med magekrefttilfeller enn med andre normaler, i samsvar med intestinal metaplasi å være en mellomtilstand i overgangen fra normal gastrisk epitel til adenokarsinom i ventrikkel . Nøyaktig identifikasjon av intestinal metaplasi ved endoskopi er kjent for å være unøyaktig [20]. Således er en mage kreft-type proteomikk fingeravtrykk muligens en følsom indikator for tilstedeværelsen av denne pre-maligne lesjoner hos pasienter med klinisk diagnostisert med benigne mage lidelser.
Gastriske kreftpasienter i treningssettet var signifikant eldre (gjennomsnittsalder 67,7 år) enn pasienter med godartet mage forhold (gjennomsnittsalder 56,6) (p
= 0,0062). For å møte muligheten for at proteinprofiler var relatert til alder eller etnisitet, vi re-analysert data fra undergruppe av kinesiske pasienter over 55 år. Dette resulterte i 1/17 kreft feilsorterte (samme tumor som ble feilklassifisert når alle 19 krefttilfeller ble analysert, sensitivitet 94%) og 4/17 kontroller feilsorterte (de samme 4 kontrollene som var blant de 9 feilsorterte godartet tilfeller, spesifisitet 76,5%) .
Vi neste testet den faktiske ytelsen av proteomikk profiler i sært kreft fra godartede prøver i en annen serie av 53 blindet magevæske og pelletsavtrekksprøver (24 mage kreft og 29 godartede mage lidelser) (tilleggsfiler 3). Tjueen av 24 mage kreft ble korrekt identifisert (sensitivitet 88%) og 2 av 29 godartede prøvene ble feilaktig klassifisert (spesifisitet 93%) (figur 5). Figur 5 Expression forskjell kartet magevæske og pellet ekstrakt proteiner av validerings sett prøver på fire ProteinChip arrays, som vises i to-veis hierarkisk clustering. Vesentlige proteomikk funksjonene vises horisontalt. Intensiteten på de røde og grønne farger angir graden av relativ proteinnivå, høyere eller lavere enn medianverdien. Pasient tilfeller presenteres vertikalt; de fleste mage kreftpasienter er tett gruppert sammen.
valgt proteomic markører (basert på betydningen Resultatet bestemmes av SAM) var semi-renset på ProteinChip matriser og identifisert direkte på flekker av kollisjons-indusert dissosiasjon sekvensering (figur 6). Flere av de signifikant nedregulert markører hos kreftpasienter som er vist på figurene 1 og 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da og 2387,3 Da, ble identifisert til å være pepsinogen C og pepsin A aktivering peptidfragmenter (tabell 1). De oppregulert triplet markører hos kreftpasienter som er vist på figurene 2, 7 og tilleggsfiler 4 ble identifisert til å være alfa defensin-1,2,3. Intensitet spredningsplott viser signifikante forskjeller i gjennomsnitts intensiteter av defensin og pepsin fragment mellom godartet kontroll og magekreft væskeprøver (p
= 0,003 og 0,00002, henholdsvis) (Figur 8). Ved hjelp av ELISA spesifikk for pepsinogen C, bekreftet vi betydelig lavere konsentrasjoner i magekreft væsker (11,9 ± 0,1 ng /ug totalprotein; gjennomsnitt ± SEM n = 6.) sammenlignet med godartede prøver (21,5 ± 1,4 ng /mikrogram total protein n =. 23) i en tredje prøvesett (p
= 0,0126; Students uparede tosidige t
test). ELISA utført på de samme prøvesett for defensin nivåer viste høyere konsentrasjoner i magekreft prøver (63,4 ± 9,2 pg /ug totalt protein; middelverdi ± SEM n = 6) enn i benigne prøver (46,2 pg /ug totalt protein; gjennomsnitt ± sem n = 23) ((p
= 0,0654; Student t
test) .table en peptidsekvenser identifisert ved MS //MS
Peptide m /z
Sequence
Protein Match
Mowse † scorer
Mowse score med betydelig homologi
2386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
Pepsin En aktivering peptid
35
> 28
2187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin A aktivering peptid
18
> 26
2040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin En aktivering peptid
28
> 26
1775,95
FLKKHNLNPARKYF
Pepsin A aktivering peptid
47
> 26
1628,84
LKKHNLNPARKYF
Pepsin En aktivering peptid
40
> 28
1880,92
LRTHKYDPAWKYRF
pepsinogen C aktivering peptid
31
> 22
† Mowse poengsum = -10Log ( P), hvor P = sannsynligheten for at kampen er en tilfeldig hendelse (P
< 0.05) m /z
, masse /lade
Figur 6 Høy-oppløsningsmassespektrum av fraksjonerte magevæske proteiner på LWCX30 ProteinChip matrisen fremskaffet på en QTOF utstyrt med en PCI1000 grensesnitt. Eske topper ble utsatt for fragmentering ved kollisjon analyse-indusert dissosiasjon MS /MS.
Figur 7 Høy-oppløsningsmassespektrum av magevæske proteiner på H50 ProteinChip matrisen fremskaffet på en QTOF utstyrt med en PCI1000 grensesnitt. Denne figuren viser oppregulert triplet markører i magekreft. Vennligst se tilleggsfiler 4 for hele bildet.
Figur 8 Spredningsplott av intensitetsverdiene av defensin og pepsin fragment til stede i mage væskeprøver av benign kontroll og mage kreftpasienter fra treningssettet.
Diskusjon
Våre data tyder på at den spektrale profilen til ufraksjonert magevæske kan være et nyttig supplement for kreftdiagnostikk og deteksjon av tidlig stadium sykdommen, når kombinert med klinisk gastroskopi. Nyeste forsøk på å identifisere protein biomarkører for magekreft har undersøkt serum [21-29] og vev [24, 30-37], og har i økende grad brukt massespektrometri. Eldre rapporter om serologiske analyser av enkelte kjente tumor markører f.eks CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 og TAG-72, har generelt lav følsomhet (< 50%) [38-41]. Videre er det vesentlig på tvers av positivitet av disse tumormarkører i ikke-gastriske cancere, f.eks hevet CEA og MG7-Ag nivåer er vanlig i tykktarmskreft, kolangiokarsinom, bukspyttkjertelkreft, og selv i friske kontroller [40, 23]. Ikke overraskende er slike serum tumormarkører har ingen etablert rolle i magekreft diagnose og screening, selv om de kan tjene som prognostiske indikatorer og tidlige markører for tilbakevendende sykdom etter gastrektomi [39, 41, 42].
Vi valgte å undersøke proteomic profiler av magevæske for sykdoms biomarkører fordi det virket sannsynlig at opprørt mage protein sekresjon i maligne og premaligne tilstander, kombinert med mulig tilstedeværelse av ekspandert kreftceller, kan generere karakteristiske proteomikk profiler. Som i jakten på serum biomarkører, har flere grupper undersøkt den diagnostiske nytten av kjente tumor markører i magesaft. Verken CEA eller CA 19-9 positivitet i magevæske har vist diagnostisk nøyaktighet [43-46]. Alpha-1 antitrypsin i magesyren har nylig blitt rapportert som en magekreft biomarkør [47, 48].
Vår tilnærming til å utvikle en sensitiv metode for magekreft diagnose skilte seg fra tidligere studier på tre måter. Først valgte vi en biologisk prøve som var organspesifikk (dvs. endoskopisk aspirert magevæske) i stedet for systemisk (dvs. serum), begrunnelsen at de molekylære funksjoner vil mer sannsynlig være sykdomsspesifikke. For det andre, massespektrometri gjort oss i stand til å ta en objektiv oppdagelsesbasert tilnærming. Tredje, våre data generert profiler av flere proteomikk markører som i økende grad anses å ha høyere sensitivitet og spesifisitet enn single tumor markører [49, 50]. For magekreft, ved å kombinere med 2 eller 3 tumor markører oppnådd bedre diagnostisk nøyaktighet i forhold til en enkelt markør alene [38, 40].
Protein fingeravtrykk av magesaft fra mage kreftpasienter viste totalt 106 proteomikk funksjoner som var betydelig opp - eller nedregulert (Tilleggsfiler filer~~POS=HEADCOMP 1 og 3). To fremtredende markører ble valgt for identifisering av MS /MS. Pepsinogen A og pepsinogen C aktiveringspeptider ble nedregulert i magevæskene fjernet fra magen med histologisk bekreftet adenokarsinomer. En studie av kryostatsnitt av magekreft Det er også rapportert betydelig nedregulering av pepsinogen C, identifisert ved MS /MS, i tumorvev [51].

• Genetiske linjer av udifferensiert-type mage karsinom analysert ved unsupervised clustering av genomisk DNA microarray data
• MiR-146a rs2910164 G /C polymorfisme og magekreft mottakelighet: en meta-analyse