Epidermal vekstfaktor reseptor strukturelle endringer i mage cancer

epidermal vekstfaktor reseptor strukturelle endringer i magekreft
Abstract
Bakgrunn
EGFR overekspresjon har blitt beskrevet i mange humane tumorer inkludert magekreft. I NSCLC somatiske mutasjoner EGFR, innen kinasedomenet av proteinet, så vel som genamplifikasjon var assosiert med en god klinisk respons på EGFR-inhibitorer. I mage svulster data vedrørende strukturelle forandringer av EGFR fortsatt kontroversielt. På grunn av dets mulige terapeutiske relevans, forsøkte vi å bestemme frekvens og type av strukturelle forandringer av EGFR
-genet i en serie av primære gastriske karsinomer.
Methods
Direkte sekvensering av kinase-domenet til EGFR
gen ble utført i en serie av 77 primær gastriske karsinomer. FISH analyse ble utført i 30 saker. Assosiasjonsstudier mellom EGFR
endringer og kliniske patologiske trekk ved svulster ble utført.
Resultater
Innenfor de 77 primære mage karsinom vi funnet to EGFR
somatiske mutasjoner og flere EGFR
polymorfismer i ekson 20. Seks forskjellige intronic sekvensvarianter av EGFR
ble også funnet. Fire mage karsinom viste balansert polysomy eller EGFR
genamplifisering. Vi bekreftet at magekreft med endringer av EGFR
(somatiske mutasjoner eller kopiere nummeret variasjon) viste en signifikant økning av tumorstørrelse (p
= 0,0094) sammenlignet med villtype EGFR
karsinomer.
Konklusjon
Vi viser at EGFR
strukturelle endringer er sjelden i magekreft, men når til stede, fører det til tumorvekst. Vi vurderte at søker etter EGFR
endringer i magekreft er sannsynligvis klinisk viktig for å identifisere pasienter som er mottakelige for svare på tyrosinkinasehemmere.
Bakgrunn
Magekreft er fortsatt den nest største årsaken til kreft død på verdensbasis [1] et scenario som understreker behovet for mer spesifikke og effektive behandlinger. De eksakte mekanismene bak magekreftutvikling er ennå ikke fullt ut forstått, men bevisene peker mot en sammenheng med trasé som er involvert i utviklingsprosesser [2]. Nøkkel molekyler av disse banene er de reseptor-tyrosinkinaser (RTK), som er funnet å være avvikende aktivert eller overuttrykt i mange tumorer og representerer derfor lovende mål for terapeutisk intervensjon.
Medlemmene av RTK-superfamilien av reseptorer er erbB glykoproteiner som består av et ekstracellulært domene, hvor bindingen av ligander finner sted en kort lipofil transmembrandomene og et intracellulært domene som bærer tyrosinkinaseaktiviteten [3, 4]. De er uttrykt i flere vev av epitel, mesenchymale og neuronal opprinnelse, der de spiller sentrale roller i utvikling, spredning og differensiering. Deregulert ekspresjon av ErbB-molekyler, nemlig erbB2, har vært implisert i utviklingen av en rekke typer av tumorer, inkludert gastriske tumorer. I gastrisk karsinom har det vist seg at ErbB2-overekspresjon er drevet av genamplifisering og er forbundet til karsinomer med høyt potensial invasiv [5]. ERBB1, bedre kjent som epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), og overekspresjon blitt beskrevet i mange humane tumorer, omfattende lunge, tykktarm, bryst, prostata, hjerne, hode og hals, skjoldbruskkjertelen, ovarie, blære, nyre og også magekreft [6 -11], og har blitt korrelert til avansert tumor stadium og dårlig klinisk utfall. Ganske nylig, demonstrerte vi at EGFR-aktivering er knyttet til tap av funksjon av E-cadherin, in vitro product: [12].
Den mekanismer for onkogen omdannelse av EGFR i kreft omfatter amplifisert kopiantall, strukturelle rearrangementer av reseptoren og aktiverende mutasjoner [13]. EGFR mutasjoner klynge i kinase domene av EGFR (eksoner 18-21), og føre til ligand-uavhengig aktivering av reseptoren, som representerer mulige mål for terapeutisk intervensjon. I denne forbindelse, somatiske EGFR mutasjoner samt genamplifisering hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) svært korrelerer med klinisk respons på tyrosinkinasehemmere [14, 15].
I mage svulster, data om struktur endringer av EGFR fortsatt kontroversielt. På grunn av dets mulige terapeutiske relevans i den foreliggende studie forsøkte vi å klargjøre betydningen av EGFR strukturelle endringer i gastrisk karsinogenese ved å analysere en serie av primære gastriske karsinomer for kopiantall og mutasjoner i tyrosinkinase-domenet (eksoner 18-21) av EGFR
genet.
Metoder
sak utvalg og histopatologisk klassifikasjon av svulstene
Representative blokker med 77 formalinfiksert, parafininnebygde menneskelige mage primære svulster ble hentet fra Institutt for patologi av Hospital S. João etter informert samtykke fra pasientene. Pasientene ble informert om at svulst materialet ville bli brukt til forskningsformål. Ingen av pasientene som inngår i den nåværende serien hadde en familiehistorie med magekreft. H & E- fargete snitt ble brukt til å kategorisere svulster i henhold til klassifiseringen av Lauren og Ming. Penetrasjon av mageveggen og tilstedeværelse og lokalisering av lymfeknutemetastaser ble registrert for alle pasienter som bruker standardkriteriene for patologisk iscenesettelse. Orcein-fargede seksjoner ble anvendt for deteksjon av vaskulær invasjon.
EGFR Mutasjon Screening
Genomisk DNA ble ekstrahert fra 10 um seksjon etter mikrodisseksjon av tumor rom for å oppnå en renhet på minst 70% av neoplastiske celler. DNA-ekstraksjon ble utført ved anvendelse av genomisk DNA Purification Kit (Gentra System) i henhold til produsentens protokoll. Ekson-spesifikke primere ble utformet og DNA ble underkastet PCR-amplifikasjon av exon 18, 19, 20 og 21. De fire EGFR
eksoner kode for tyrosin kinase domene av EGFR. Primersekvensene er vist i tabell 1 1.Table primerne anvendt for PCR amplifikasjon av EGFR kinase domene
Exon

Primer Sekvens
PCR produkt størrelse (bp)
Exon 18
Forward
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Omvendt
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
Exon 19
Forward
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Omvendt
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
Exon 20
Forward
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Omvendt
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
Exon 21
Forward
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Omvendt
CCTGGTGTCAGGAAAATGCT
PCR produktene ble kjørt på en 2% agarosegel og PCR forsterket band ble hentet fra gelen med gel band Purification Kit (GE Healthcare). Prøvene ble deretter renset og sekvensert ved hjelp av ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, California) etter produksjon instruksjon og en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin Elmer, Foster City, California). Resultatene ble analysert ved hjelp av 3100 datainnsamlingen programvare. Sekvensering ble utført på begge tråder. I de tilfeller der det er mistanke mutasjoner PCR-amplifisering ble gjentatt, og prøven ble re-sekvensert for å utelukke PCR-artefakter.
EGFR Copy Number Variasjon Screening Bedrifter Den parafinblokker ble seksjonert på 5 um og vevssnitt ble tørket ved 60 ° C i 30 minutter. Glassene ble deparaffinised og vasket etterfulgt av en forbehandling og et digereringstrinnet ved hjelp av pepsin og endelig dehydrert. LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set (VYSIS ®), optimalisert for å oppdage bandet regionen 7p12 i spekteret oransje og cent av kromosom 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) i spekteret grønt, både i interfase kjerner og på metafase-kromosomer, ble anvendt. Fem pl av proben ble brukt til hvert objektglass. Denaturering ble gjennomført ved 80 ° C i 8 minutter etterfulgt av hybridisering med et fuktig kammer ved 37 ° C i 16 timer. Etter hybridisering, ble objektglass vasket og inkubert med 4'-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for nukleær farging. For evaluering, ble seksti 100 intakte interfase kjerner analysert av to uavhengige observatører for å score signalene for kromosom 7 cent og EGFR-genet. Omkringliggende lymfocytter og normal slimhinne ble brukt som intern kvalitetskontroll for analysene. I det minste to eller tre representative områder av de neoplastiske celler ble valgt, i henhold til et 100 x /200 x forsterkning felt, for å telle de signaler kjerner. Etter en oversikt under en 400 × forsterkning, ble signalene så telles ved hjelp av nedsenking olje (1000 ×).
Statistisk analyse
Association studier mellom EGFR endringer og clinicopathological funksjoner av sakene ble utført bare i 30 tilfeller (svulster analysert for EGFR mutasjoner og EGFR kopi antall variant). Statistiske analyser ble vurdert av x2 test eller Student t
test. En p
verdi. ≪ 0,05 ble ansett statistisk signifikant
Resultater
EGFR mutasjon Screening
Fra 77 mage karsinom analysert, ble EGFR
mutasjoner i eksoner 18-21 påvist i 2,6% (2/77) av tilfellene (fig. 1a). Én mutasjon tilhørte ekson 20 og var en missense mutasjon (2300 C > T) som fører til substitusjon av alanin 767 for en valin. Den andre mutasjon påvirkes exon 21 og var en missense mutasjon (2524 A > G) som fører til substituition av asparagin 842 for en asparaginsyre. Ingen av mutasjonene ble tidligere beskrevet. Det er ingen sekvens endringer ble funnet i eksoner 18 og 19. Figur 1 Strukturelle forandringer i EGFR. (A) Direkte sekvensering som viser en av de mutasjoner som finnes i kinase domene av EGFR - missense mutasjon (2300 C > T) i exon 20, som fører til substitusjon av alanin 767 for en valin. (B) Diffus magekreft med EGFR økt kopiantall forårsaket av kromosom 7 polysomy. (C) neoplastiske celler som utviser genamplifikasjon med dannelse av klaser med en rekke signaler for EGFR. På flere polymorfismer EGFR ble funnet i exon 20 (tabell 2). Den polymorfisme 2361G > En Gln787Gln, tidligere beskrevet av Mu et al product: [16], var til stede i 55,8% (43/77) av tilfellene, og i ni av 43 tilfeller i en homozygot tilstand. Vi screenet 50 normale kontroller og 2361G > En Gln787Gln var til stede i 82% av kontrollene (41/50). To andre EGFR tause mutasjoner (i 2301 C > T Ala767Ala og 2415 C > T His805His) ble funnet i ekson 20, ingen av dem tidligere beskrevet. Begge endringer ble funnet i et enkelt tilfelle og var fraværende i normale controls.Table 2 Sequence endringer funnet ved direkte sekvense

Endring

Skriv
Frekvens
Referanser
Exon 18
2184 + 19 G > A
Intronic variant
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
Exon 19
2185-9 C > G
Intronic variant
1/77
ennå beskrevet
2283 + 11 G > A
Intronic variant
1/77 ennå ikke anbefale beskrevet
2283 + 47 G > A
Intronic variant
1/77
ennå beskrevet
2283+ 49 C > T
Intronic variant
1/77
Foreløpig beskrevet
Exon 20
2284-60 C > T
Intronic variant
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T
missense Ala 767 Val
1/77
ennå beskrevet
2301 C > T
Silent Ala 767 Ala
1/77
ennå beskrevet
2361G > A
Silent Gin 787 GLN
43/77 product: [16]
2415 C > T
Silent Hans 805 Hans
1/77
ennå beskrevet
Exon 21
2524 A > G
missense Asn 842 Asp
1/77
ennå beskrevet
Vi fant seks forskjellige sekvensvarianter lokalisert i intronic regioner av EGFR, to av dem tidligere beskrevet i Ensembl [17].
EGFR Kopier nummer Variasjon Screening
analyse av EGFR
kopiantall, som vurdert av fluorescens in situ hybridisering (FISH), var bare mulig i 30 av de 77 tilfellene som ble analysert for EGFR mutasjoner. All EGFR
signaler ble sammenlignet med signaler for centromeric prober for kromosom 7. Mer enn 2,0 EGFR
kopier per celle (balansert polysomy eller genamplifisering) ble påvist i 13,3% (4/30) av tilfellene. Av de fire sakene som viser mer enn 2 eksemplarer av EGFR
per kromosom 7, tre hadde økt kopiantall skyldes polysomy og en hadde genamplifisering, en diffus magekreft, viser dannelsen av klynger med mange signaler for EGFR
(fig. 1B, C).
EGFR strukturelle endringer og clinicopathologic parametere for pasientene og svulster
Tabell 3 viser de statistiske sammenhenger mellom EGFR endringer og clinicopathologic kjennetegn ved pasientene og svulster. Når man sammenligner magekarsinom husing EGFR endringer med karsinom med normal EGFR status eller kopiantall, observerte vi en signifikant sammenheng mellom EGFR strukturelle endringer og økt tumorstørrelse. (P
= 0,0094). Det er ingen signifikant sammenheng ble funnet mellom EGFR-endringer og andre clinicopathologic parametere av pasientene og tumorer, nemlig kjønn og alder av pasientene, tumorlokalisering, histologisk type vegg penetrasjon, tilstedeværelse av lymfeknutemetastase, vaskulær invasjon og tumor oppsetning av tumoren .table 3 Association i EGFR-genet endringer med clinicopathological parametere
Clinicopathological parametere
EGFR status

Amplification /mutasjon (n = 6)
Normal (n = 24)
Totalt (n = 30)
p
verdi
Sex (F /M)
1/5
10/14
11/19
0,2557
Age (SD)
62,3 ± 14,1
56,3 ± 16,8
57,5 ​​± 16,2
0,4271
Tumor lokalisering
0,8548
Proximal
3
11
14
Distal
3
13
16
Size (SD)
11,6 ± 9,8
5.8 ± 2.0
6,9 ± 5,0 product: * 0,0094
Lauren klassifisering
0,1261
Tarm
1 12
13
Diffuse
5
9
14
Atypisk
0
3
3
Wall penetrasjon
0,4642
Tidlig (T1)
0
2
2
Advanced (T2-T4)
6
22
28
Vaskulær Invasion
0,7125
Fraværende ( N0)
3
14
17
Present (N = 1)
3
10
13
lymfeknutemetastaser
0,1921
Fraværende
1
11
12
Present
5
13
18
Staging
0,3845
jeg
1 7
8
II
0
5
5
III
5
11
16
IV
0
1 1
diskusjon
EGFR-genet er lokalisert på kromosom 7p12 og koder for et 170 kDa reseptor, tilstede i membranen til cellene som et inaktivt monomerer. Ved ligandbinding til det ekstracellulære domene, gjennomgår reseptoren konformasjonsendringer, dimerises og blir autofosforyleres i nøkkel tyrosinrester i intracellulær tyrosin kinase (TK) domene. Dette fører til aktivering av nedstrøms reaksjonsveier som kontrollerer celleoverlevelse, apoptose og inhibisjon av proliferasjon [18].
Mye oppmerksomhet er blitt trukket til den oncogene effekt av EGFR og mest av alt for å lykkes med EGFR mål-terapier, som er vel etablert for ikke-småcelle lungekarsinomer. Rollen av EGFR i magekreft er svært kontroversielt. Enkelte forfattere rapporterte at EGFR er høyt uttrykt i magekreft, noe som tyder på sin egnethet som et mål for reseptor-tyrosin-kinase-inhibitorer [19, 20]. Omvendt, Takehana og medarbeidere rapporterte at overekspresjon av epidermal vekstfaktor-reseptor er en sjelden hendelse i gastrisk karsinom [21] og forekommer hovedsakelig på grunn av EGFR genamplifikasjon, noe som bekrefter resultatene fra tidligere undersøkelser [22-24]. EGFR mutasjoner i primær magekreft eller magekreft cellelinjer ble aldri rapportert [25-27]; likevel vi nylig viste at arve diffuse magekreft assosiert E-cadherin kimcellelinje missense mutasjoner føre til økt EGFR aktivitet.
På bakgrunn av dette, vurderte vi at du søker etter EGFR endringer i magekreft kan ha vært viktig å identifisere terapi mottakelige tilfeller.
Her rapporterer vi tilstedeværelsen av EGFR
økt kopiantall i 13,3% av de 30 sakene der FISH analyse var mulig. Av de fire tilfeller med økt antall kopier, bare en present genamplifisering, mens de resterende 3 tilfeller viste polysomy av kromosom 7. Disse resultatene samsvarer med tidligere rapporter som undersøker EGFR kopiantall i magekreft [22-24]. Mutasjonsanalyse av kinasedomenet av EGFR avslørte tilstedeværelsen av mutasjoner i 2,6% av 77 gastriske karsinomer. De identifiserte mutasjoner var av missense typen og var tilstede i eksoner 20 og 21 EGFR-genet. Ingen av de identifiserte mutasjoner hadde blitt tidligere beskrevet, og deres funksjonelle betydning er ennå ikke vurdert. Men på grunn av deres lokalisering i kinase domene av EGFR, er det fristende å spekulere at de påvirker aktiviteten av reseptoren, og derfor pasienter som hadde følgende EGFR mutasjoner kan ha nytte av tyrosinkinaseinhibitorer som terapeutisk tilnærming.
Foruten disse mutasjonene funnet andre sekvensendringer, ble identifisert, alle clustering i exon 20. EGFR polymorfisme 2361 G > A (tidligere beskrevet i Ensembl) forekommer i en høy prosentdel av tilfellene og i normale kontroller. I kontrast, men ikke de to andre beskrevet tause varianter i ekson 20 (2301 C > T, 2415 C > T) var fraværende i normale kontroller. I tillegg til disse EGFR sekvensvarianter i koding regioner, har vi også identifisert variasjoner i intronic sekvens flankerer eksoner 18, 19 og 20, men deres funksjonelle effekten er fortsatt uklar.
Korrelasjon av de kliniske parametre for de tilfeller der både mutasjon og FISH-analyse var mulig, viste en signifikant sammenheng mellom EGFR endringer og tumorstørrelse. Interessant, alle tilfeller med endringer i EGFR (forsterkning /mutasjon) var karsinomer allerede invaderende basalmembranen og sprer seg inn i mageveggen (T2-T4), noe som tyder på at endringer av dette genet kan gi en invasiv atferd til neoplastiske celler.
imidlertid må denne hypotesen avklares ved videre studier, siden vi ikke bekrefte en statistisk signifikant sammenheng mellom EGFR endringer og invasjon i mageveggen (p = 0,4642), som vi nettopp har analised et svært lavt antall tidlige mage karsinom ( n = 2) i serien. Begge resultatene er i overensstemmelse med rapporter om Hirono et al
., 1995 [23] og Tsugawa et al
., 1998 [24], noe som tyder på at EGFR er involvert i tumorvekst og aktivere endringene kan være en sen hendelse involvert i tumorprogresjon.
Selv om ingen andre statistisk signifikant sammenheng ble funnet, er det interessant å legge merke til at EGFR endringer forekommer hovedsakelig i karsinom av den diffuse typen. Tilstedeværelsen av EGFR endringer i diffuse karsinomer er i motsetning til hva som tidligere er observert for andre medlemmer av erbB-reseptor-familien i magekreft. I gastrisk karsinom ErbB2-amplifisering ble detektert fortrinnsvis i tarm karsinomer i mage [5].
Konklusjon
Som konklusjon i denne studien viste at EGFR-aktiverende forandringer ikke er en hyppig hendelse i gastrisk karsinogenese. Endringer fortrinnsvis vises i gastriske karsinomer i diffuse undertypen og er forbundet til tumorstørrelsen. Til tross for den lave hyppigheten av EGFR endringer, våre resultater tyder også på at det er en begrenset gruppe utvalgte mage pasienter som kan ha nytte av ikke-konvensjonell terapi, inkludert farmakologiske hemmere av EGFR-reseptoren.
Merknader
Catia Moutinho, Ana R Mateus bidratt likt til dette arbeidet
Erklæringer
Takk
denne studien ble finansiert med tilskudd fra Fundação para en Ciencia ea Tecnologia, Portugal (SFRH /BD /16747/2004, Poci /SAU -. OBS /57670 /2004 og PTDC /SAU -. OBD /64319/2006)
forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 1 Konkurrerende interesser
forfatteren (e) erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

• Banded gastric bypass - fire år følge opp i en prospektiv multisenter analyse
• Nedbryting av OLFM4 genet hemmer cellevekst og øker allergi til hydrogen peroxide og tumornekrosefaktor-alfa indusert-apoptose i magekreftceller