PLOS ONE: Elevado Interleucina-32 expressão é associada com Helicobacter pylori Gastritis

Abstract

Fundo

A interleucina-32 (IL-32) é uma citocina pró-inflamatória descoberto recentemente envolvido em inflamatória doenças. Nós investigamos a expressão de mecanismo de IL-32 e sua regulação na resposta inflamatória de pacientes com Helicobacter pylori
( H. Pylori
) infecção.

Desenho e Métodos

IL-32 ARNm e a expressão de proteínas em tecidos gástricos foi detectada por quantitativa PCR em tempo real e imuno-histoquímica. A regulação de IL-32 na linha celular de epitélio gástrico humano AGS foi investigada por estimulação de citocinas diferente e diferente H. pylori
infecção tensão.

Resultados

gástrica IL-32 mRNA e expressão da proteína estavam elevados em pacientes com H. pylori
infecção e positivamente correlacionada com gastrite. Em H. pylori
pacientes infectados, o nível de ARNm de IL-32 foi também correlacionada com a de citocinas pró-inflamatórias de IL-1p e TNF-a. In vitro de Il-1β e TNF-α podia regular positivamente IL-32 ARNm e o nível de proteínas em células AGS, que era dependente da via de sinalização de NF-kB. A regulação da IL-32 expressão em resposta a H. pylori
-infecção pode ser enfraquecida por utilização de anticorpos neutralizantes para bloquear o IL-1β e TNF-α. Além disso, H. pylori
células AGS infectados também induziu IL-32 mRNA e expressão da proteína, que era dependente de CagA.

Conclusões

IL-32 nível é elevada em pacientes com H . pylori
infecção e a sua expressão é regulada por estímulos pró-inflamatórios, sugerindo que a IL-32 pode desempenhar um papel na patogénese de H. pylori
gastrite -relacionados

citação:. Peng L-s, Zhuang Y, Li W-H, Y-Y Zhou, Wang T-T, N Chen, et ai. (2014) Elevated Interleucina-32 expressão é associada com Helicobacter pylori
relacionados com gastrite. PLoS ONE 9 (3): e88270. doi: 10.1371 /journal.pone.0088270

editor: Ivo G. Boneca, Institut Pasteur de Paris, França |

Recebido: 24 de agosto de 2013; Aceito: 08 de janeiro de 2014; Publicação: 14 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Projeto de Formação de Jovens Ciência médica do Exército de Libertação do Povo chinês (13QNP108) e Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa, No. 2009CB522606). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Helicobacter pylori
( H. pylori
) é uma bactéria Gram-negativa, bactéria microaerophilic que coloniza o estômago de cerca de 50% da população mundial. A infecção persistente de H. pylori
provoca gastrite crónica e persistente e aumenta o risco de úlcera péptica e câncer gástrico.

H. pylori
mucosa gástrica infectado tem sido caracterizada pela infiltração de células imunitárias e a produção de factores inflamatórios. Th1 e Th2 são relatados para mediar a resposta imunitária a H. pylori
, e resposta Th1 é pensado para ser predominante [1]. Em seguida, indução de resposta Th17 no H. estômago infectado pylori
é confirmado [2]. Além de células Th1, Th2 e Th17, as células T reguladoras (Tregs) também desempenham um papel importante no H. pylori
-relacionados gastrite [3]. Enquanto isso, as citocinas, tais como IL proinflammtory-1β, TNF-α e IL-6 também têm demonstrado ser elevados na H. estômago infectado pylori
[4], e estas citocinas poderiam influenciar a resposta imune das células T em doenças inflamatórias, sugerindo que fatores inflamatórios pode ser crucial no H. inflamação gástrica -relacionados pylori
. No entanto, o mecanismo exacto do processo ainda não foi completamente elucidado.

IL-32 é uma citocina pró-inflamatória recentemente identificado produzido por células do sistema imunológico (células NK, células T, monócitos) e células não-imune (células endoteliais , células epiteliais) [5] - [7]. Foi originalmente clonado como um gene induzido pela IL-2 e NK-4 chamada, mas a sua função é desconhecida até 2005 [5], [8]. Existem seis variantes de splicing de IL-32α incluindo, β, γ, δ, ε, e ζ, e diversos papéis são potencialmente desempenhado pelos seus diferentes isoformas. No entanto, um receptor específico para a IL-32 não tenha sido descoberto, embora neutrófilos proteinase 3 liga-se a IL-32 com uma elevada afinidade [9]. A IL-32 desempenha um papel importante em várias doenças inflamatórias e a sua expressão tem sido demonstrado que se correlacionam com a gravidade das doenças em artrite reumatóide, doença atópica e dermatite de Crohn [10] - [12]. Além disso, IL-32 tinha sido implicada em algumas doenças infecciosas, incluindo H. pylori
infecção [13] - [16]. No entanto, a associação entre IL-32 expressão e H. pylori
gastrite induzida e o seu mecanismo de regulação exacta incluindo se auto- /parácrinos efeitos sobre a expressão de IL-32 pode estar envolvido no processo foi permanecem desconhecidos.

No presente estudo, detectou-IL -32 expressão em biópsias de pacientes com H. pylori
infecção e analisado a relação entre a IL-32 gástrico nível e a gravidade da inflamação da mucosa. Posteriormente, nós exploramos o impacto dos estímulos pró-inflamatórios e H. pylori
infecção na produção de IL-32 de expressão em linhas de células de epitélio gástrico humano. Os nossos resultados mostraram que a IL-32 pode ser envolvido na patogénese de H. pylori
gastrite -relacionados.

Declaração de Materiais e Métodos
Ética

biópsias da mucosa gástrica humana foram coletadas por endoscopia de rotina no Hospital Xinqiao da Terceira Universidade Médica Militar . O sangue foi obtido a partir do mesmo assunto que foram submetidos à endoscopia para H. pylori
teste de sorologia. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Xinqiao, Terceira Universidade Médica Militar. consentimento informado por escrito foi obtido de cada sujeito

Assuntos

tecidos gástricos e de sangue foram coletadas de 54 pacientes. (masculino /feminino = 27/27; média de idade de 47 ± 1,2 anos) com H. pylori
infecção que foram submetidos à endoscopia no Hospital Xinqiao da Terceira Universidade Médica Militar. H. pylori
foi confirmado pelo teste rápido-urease, sorologia, ^{13 C-ureia teste de respiração e histologia. Os pacientes foram classificados como H. pylori
positivo se dois dos quatro testes foram positivos. tecidos gástricos normais de 47 indivíduos (masculino /feminino = 23/24; idade média de 47 ± 1,3 anos). que tiveram resultados negativos para todos os quatro testes foram incluídos como controles}

Biópsia amostras e Avaliação Histologia

espécimes de biópsia foram retirados dos indivíduos em cada endoscopia. Uma delas foi imediatamente congelado em azoto líquido e armazenado a -80 ° C para extracção de ARN. O resto das amostras de biópsia foram fixadas em formalina e embebidas em parafina. Hematoxilina-eosina (H & E) cortes corados foram examinados por dois histopatologista experiente. A gravidade histológica da gastrite foi classificada de normal a grave com base na densidade de se infiltrar mononucleares e polimorfonucleares de acordo com os critérios estabelecidos [17], [18].

Cultura de Células

O gástrica a linha epitelial AGS (ATCC, American Type Culture Collection) foi cultivada a 37 ° C e 5% de CO _{2 em meio F12 de Ham (Hyclone, Logan, UT, EUA), que continha 10% de soro fetal de vitelo (FCS). As células AGS foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 1 x 10 ^{6 células /poço e estimuladas com 10 ng /ml de TNF-α ou /e 10 ng /ml de IL-1β (Peprotech, Rocky Hill, NJ , EUA); As células foram colhidas nos tempos indicados para análise de IL-32 ARNm e a expressão da proteína. Para o ensaio de inibição da via de sinal, inibidor de NF-kB (BAY 11-7082), MEK1 /2 inibidor (U0126), p38 /inibidor de MAPK (SB203580), inibidora da JNK (SP600125), JAK Inhibitor I (todos a 10 uM e todos a partir de Calbiochem, San Diego, CA, EUA) ou o veículo DMSO (Sigma, Saint Louis, MO, EUA) foram adicionados à cultura de células 1 hora antes da estimulação de citoquinas.}}

a infecção de células com AGS H. pylori

H. pylori
11637 estirpe e sua isogênico CagA-negativos estirpe mutante (CagA ^{- estirpe) foram cultivadas em placas de infusão cérebro-coração contendo 10% de sangue de coelho a 37 ° C sob condições de microaerofilia (5% O _{2 , 10% de CO 2, 85% N 2). H. pylori
foi lavado das placas de cultura com PBS e centrifugada a 2500 × g durante 5 min, antes de ser ressuspenso em PBS para a quantificação da densidade óptica a 600 nm (um valor OD 600 = 1 × 10 9 H. pylori
/ml). Uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1, 10, e 100 foi utilizada para infectar células AGS. Para ensaios de neutralização, os anticorpos neutralizantes contra o TNF-α (nTNF-α, 1 ug /ml, BioLegend) ou IL-1β (NIL-1β, 1 ug /ml, eBioscience) foi adicionado no sistema de co-cultura.}}

Isolamento de ARN e quantitativa PCR em tempo real

O ARN foi extraído a partir de amostras de biópsias ou células de TRIzol reagent® (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e transcritos de modo inverso em ADNc utilizando ReverTra Ace (TOYOBO, Osaka, Japão). Quantitative PCR em tempo real foi levado a cabo pelo Sistema de Detecção IQ5 (Bio-Rad, EUA). Os iniciadores de PCR foram concebidos para atravessar uma fronteira exão-intrão e utilizados para detectar a expressão de mRNA de IL-32, TNF-α, IL-1β e β-actina e as sequências são as seguintes: IL-32, para a frente, 5 ' -ACGACTTCAAAGAGGGCTACC-3 '; reverso, 5'-GCCTCGGCACCGTAATCCAT-3 '; TNF-α, para a frente, 5'-TCTCTAATCAGCCCTCTGGC-3 '; reverso, 5'-ATGAGGTACAGGCCCTCTGA-3 '; IL-1β, para a frente, 5'-GTTCTTTGAAGCTGATGGCC-3 '; reverso, 5'-GTGGTCGGAGATTCGTAGCT-3 '; β-actina, para a frente, 5'-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTCC-3 '; reverso, 5'-TGGCGTACAGGTCTTTGCGG-3 '. β-actina foi utilizado como um controlo interno. A expressão do gene relativo foi calculado como a mudança vezes pelo método ΔΔCt.

Imunohistoquímica

Quarenta amostras embebidos em parafina foram cortados em secções de 5 mícrons. Depois de ser desparafinadas e hidratadas, as secções em tampão de citrato (pH = 6,0) foram sujeitos a calor induzido por recuperação de antigénio em um forno de microondas e tratada com peróxido de hidrogénio a 3%. Após a incubação com anticorpo de coelho anti-humano IL-32 (Abcam, MA, EUA) durante a noite a 4 ° C, as lâminas foram tratadas com anticorpo anti-coelho secundário de rábano silvestre conjugado com peroxidase (Zhongshan ponte Golden Biotech., Pequim, China), seguido de substrato 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB). anticorpo isotipo combinado foi usado como controlo negativo. As imagens foram adquiridas em um microscópio equipado com uma câmera digital Nikon Eclipse 80i (Tóquio, Japão). Para a análise semi-quantitativa da imuno-histoquímica, cada secção foi escolhido para a avaliação de IL-32 nos tecidos gástricos imunocoloração e foi classificada como se segue: pontuação 0, ausência de expressão; escore 1, baixa expressão; escore 2, expressão intermediária; pontuação 3, de expressão elevada.

Western Blot

As células foram lavadas em PBS arrefecido com gelo e, em seguida, rompidas em tampão de lise (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1 mM de EGTA, 1% de Triton X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, glicerofosfato 1 mM, Na3VO4 1 mM, 1 ug /ml de leupeptina e inibidor de protease). A concentração de proteína foi medida com um kit de ensaio de proteína BCA (Boster, Wuhan, China). Os lisados ​​celulares foram separados por 12% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas durante 1 h com 3% de albumina de soro bovino em solução salina tamponada com Tris-Tween à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com IL-32 de coelho (Abcam, MA, EUA) ou anti-ratinho anti-humano humano β-actina ((Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd, China). anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano foi usado de acordo com instructures do fabricante. as proteínas de interesse foram visualizadas usando Supersignal® Oeste Dura reagente substrato Duração (Thermo, IL , EUA).

análise estatística

Todos os resultados foram resumidos como média de erro ± padrão da média (SEM) e análise estatística foi realizada utilizando o GraphPad Prism 5.0 Software. as diferenças entre dois . grupos foram analisadas pelos grupos de teste e múltiplos de Mann-Whitney foram analisados ​​por uma análise de uma via da variância (ANOVA), quando as variações foram detectados, correlação de Spearman foi utilizado para avaliar o grau de associação entre variáveis ​​P <. 0,05 foi considerado estatisticamente significativa.

resultados

elevados de IL-32 mRNA Nível detectado em pacientes com H. pylori
Infecção

Para estudar se IL-32 está envolvida na patogênese da H. pylori
induzida gastrite, determinou-se pela primeira vez a expressão de mRNA de IL-32 em amostras de biópsia gástrica de indivíduos com e sem H. pylori
infecção. Como mostrado na Fig. 1A, IL-32 foi significativamente maior em H. pylori
amostras -positivas do que no H. pylori
amostras -negative (P < 0,001). Para avaliar se a expressão de IL-32 estava relacionada com o grau de inflamação em H. amostras gástricas infectados pylori
, dividimos as amostras em grupos normais e leves, moderados e graves gastrite com base na avaliação histológica, como descrito em Materiais e Métodos. Os resultados mostraram que os níveis de IL-32 ARNm in H. pylori
amostras -positivas foram positivamente correlacionados com o grau de inflamação gástrica (Fig. 1B). Além disso, o nível de IL-32 ARNm também mostraram uma correlação positiva com os níveis de ARNm de IL-1β TNF-α e (Fig. 1C).

aumento de IL-32 Expressão de Proteínas em doentes com H. pylori
Infecção

Para visualizar IL-32 expressão em amostras de biópsia gástrica, coloração imuno-histoquímica de IL-32 foi realizado em tecidos embebidos em parafina. Como mostrado na Fig. 2B, um pouco de IL-32 produtoras de células foram detectados em H. pylori
tecidos gástricos -negative, enquanto que em H. pylori
tecidos gástricos -positivas, observou-se que a IL-32 de expressão de proteína foi significativamente aumentada (Fig. 2C). Além disso, a avaliação semi-quantitativa da IL-32 imunorreactividade confirmou que a expressão de IL-32 nos tecidos gástricos de H. pylori
pacientes infectados a nível da proteína também foi significativamente aumentada em comparação com aqueles em H. pylori
tecidos gástricos -negative e na gastrite leve.

IL-32 mRNA e nível de proteína foram regulada por TNF-α e IL-1β

Uma vez que encontramos uma relação positiva entre a IL -32 níveis de ARNm e o grau de inflamação gástrica em tecidos gástricos e correlação entre a IL-32 e IL-ARNm 1β e ARNm de TNF-α, a regulação de citocinas pró-inflamatórias de IL-32 de expressão de ARNm foi investigada em células de AGS. Como mostrado na Fig. 3A, depois de serem tratados com citoquinas durante 24 horas,-32 IL nível de ARNm foi significativamente regulada positivamente: 5,0 ± 0,5 vezes por TNF-α, 6,9 ± 0,5 vezes pela IL-1β, e 11,2 ± 1,4 vezes pela IL-1β e TNF-α. Este efeito foi completamente dependente da via de sinalização de NF-kB como pré-tratamento com inibidor de NF-kB BAY 11-7082, mas não de JNK, p38 /MAPK, MEK1 /2 ou JAK /STAT inibidores da sinalização inibiu a indução de IL-32 ARNm após estimulação por TNF-α ou IL-1β (Fig. 3C). Além disso, Western blot confirmou que o nível de proteína de IL-32 foi também induzido pelo TNF-α e /ou estimulação de IL-1β que dependia do NF-kB via de sinalização (Fig. 3B e D). A seguir, estudaram se TNF-α ou IL-1β foi envolvido em H. pylori
regulação positiva induzida de expressão IL-32. células AGS foram infectadas com o H. pylori
e tratados simultaneamente com anticorpos neutralizantes para bloquear o TNF-α ou IL-1β. Como mostrado na Fig. 3E, H
. pylori
induzida por expressão da proteína IL-32 foi significativamente reduzida utilizando anticorpos citocinas de bloqueio indicados.

H. pylori
induzida por IL-32 Expressão

Para aprofundar o estudo do efeito directo do H. pylori
sobre a expressão de IL-32 em células epiteliais gástricas, células AGS foram infectados com H. pylori
a uma MOI de 1, 10, e 100. Como se mostra na Fig. níveis 4A e B, IL-32 mRNA e proteína aumentaram após H. pylori
infecção de uma forma dependente da dose. A seguir, analisou se H. pylori
diferenças de estirpes iria contribuir para a expressão diferente de IL-32. As células foram infectadas com H. pylori 11637
tensão e CagA ^{- tensão. Embora CagA - infecção tensão aumentou ligeiramente a expressão de IL-32 nas células AGS, a indução de IL-32 mRNA e nível de proteína por CagA - infecção estirpe foi significativamente menor do que em H. pylori 11637
infecção tensão (Fig. 4C e D).}

Discussão

No presente estudo, observou-se que gástrica IL-32 foi significativamente elevados em pacientes com H . pylori
infecção em ambos os níveis de proteína mRNA e. O nível aumentado de ARNm de IL-32 correlacionada com a gravidade da inflamação gástrica. Além disso, os níveis de ARNm de IL-32 também foram correlacionados com os niveis de IL-1β ARNm de TNF-α e, H. pylori
biópsias gástricas positivos, e uma das duas citocinas pode regular positivamente a IL-32 ARNm e o nível de proteína. Além disso, descobrimos que H. pylori
infecção de linhas de células epiteliais gástricas também induzida por IL-32 ARNm e a expressão da proteína. Estes resultados indicam que a IL-32 é provavelmente envolvidos na inflamação gástrica de pacientes com H. pylori
infecção.

IL-32 foi recentemente descrita como um factor de proinflammtory envolvido em muitas doenças inflamatórias como a rinossinusite crónica, uma condição causada principalmente por bactérias gram-positivas infecção [19], [20]. Elevados de IL-32 foi relatada em seguida, HCV e HBV-fígado infectado e correlacionar-se com a gravidade da inflamação hepática e fibrose hepática [15], [21]. Neste estudo, mostrou que a IL-32 mARN foi nível significativamente elevados em doentes com H. pylori
infecção, e também foi observada uma correlação elevada entre a IL-32 ARNm e inflamação gástrica, sugerindo que a IL-32 pode desempenhar um papel importante na H. pylori
estômago infectado. Adicionalmente, imuno-histoquímica foi utilizado para detectar a fonte de IL-32 e os resultados mostraram que a IL-32 foi expressa em células epiteliais gástricas e sua altamente expressão foi observada em H. pylori
tecidos gástricos positivos. Uma vez que IL-32 foi encontrada para induzir a produção de IL-8 em células epiteliais gástricas e inibiu a secreção do factor VEGF pró-angiogénico por células epiteliais brônquicas [16], [22], e observaram-se também o nível de mRNA de IL-32 foi positivamente correlacionada com a IL-8, a expressão (dados não mostrados). É razoável que a IL-32 influenciam a função das células epiteliais gástricas em H. pylori
estômago infectado.

A inflamação gástrica clássico com H. pylori
pode ser influenciado pela infiltração de células imunitárias e inflamatórias, o posterior pode incluir o recentemente descoberto de IL-32 [19] - [22]. No nosso estudo, verificou-se que in vitro, o TNF-α e /ou IL-1β estimulada células AGS para regular positivamente IL-32 ARNm e a expressão da proteína, que suportada uma relação positiva entre a IL-32 e TNF-α e IL-1β in vivo . No entanto, Th17 citoquina (IL-17A, IL-17F, IL-6), citocina Th2 IL-4, Tregs citocina TGF-β1 e citocina Th1 IFN-y todos falharam na indução de IL-32 ARNm e a expressão da proteína no nosso sistema, embora todos os tipos de células imunitárias relevantes e citoquinas foram relatados para infiltrar H. pylori
estômago infectadas (ver figura S1). Estes resultados sugerem que a IL-32 é provavelmente produzido antes da infiltração destas células, que é suportada pelo relatório de que a IL-32 induz a maturação de células dendríticas e promove a Th1 e Th17 polarização [23]. Além disso, a indução de IL-32 ARNm e proteína por TNF-α ou IL-1β foi bloqueado pelo inibidor de NF-kB POR 11-7082, indicando que o mecanismo molecular subjacente a este processo é provavelmente dependente de NF-kB. Curiosamente, usando anticorpos neutralizantes para bloquear o TNF-α ou IL-1β em paralelo com H. pylori
, observamos que o nível de proteína IL-32 foi significativamente reduzida. Por conseguinte, os nossos resultados indicaram que as citoquinas epiteliais (TNF-α e IL-1β) resposta a H. pylori
foram importantes para a regulação da expressão de IL-32.

Os nossos resultados também mostraram que o nível de ARNm e proteína de IL-32 foram aumentados numa forma dependente da dose a seguir H. pylori
infecção, sugerindo que o efeito de H. pylori
infecção na expressão IL32 é directamente fisiológico. Além disso, mutações CagA em H. pylori
poderia enfraquecer significativamente a expressão de IL-32 em células AGS, indicando que H. pylori
induzida por IL-32 upregulation era dependente CagA. H. pylori
expressar muitas proteínas para facilitar sua patogênese [24]. UreB também é uma importante proteína de virulência para a colonização de H. pylori Comprar e mediada H. pylori
disfunção induzida de barreira gástrica [25], [26]. Achamos que as mutações UreB também atenuada H. pylori
induzida por IL-32 de expressão de ARNm (ver Figura S2). Portanto, IL-32 expressão foi predominantemente regulada pela translocação de CagA em células epiteliais e outras proteínas de virulência pode também influenciar a resposta patogênica do H. pylori
às células epiteliais gástricas.

Em conclusão, nossos dados demonstram que a IL-32 expressão foi elevada em pacientes com H. pylori
infecção e correlacionados com a gravidade da inflamação gástrica. A regulação da IL-32 expressão em resposta a H. pylori
depende de diferentes fatores que interagem. Estes dados em conjunto sugerem que a IL-32 pode desempenhar um papel importante na patogénese das gastrites causadas por H. pylori
infecção.

Informações de Apoio
Figura S1.
AGS células foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 1 x 10 ^{6 células /poço e estimuladas com 10 ng /ml de citocinas Th17 (IL-17A, IL-17F, IL-6), Th2 citocina IL-4, Tregs citocina TGF-β1 e citocinas Th1 IFN-γ durante 24 horas, e as células foram recolhidas para análise de IL-32 ARNm e a expressão da proteína. Os dados são média ± SEM de três experiências separadas e um blot representativo foi mostrado
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088270.s001
(TIF)
Figura S2.
H. pylori
estirpe 26695 foram cultivadas em placas de infusão cérebro-coração contendo 10% de sangue de coelho a 37 ° C sob condições microaerofílicas (5% O _{2, 10% de CO 2, 85% N 2 ), e a sua subunidade de urease estirpe mutante B-negativo isogénica (UreB - estirpe) foi obtido como anteriormente descrito [27]. Uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100 foi utilizada para infectar células AGS e GES-1. As células foram recolhidas para análise de expressão de ARNm de IL-32. Os dados são média ± SEM de três experiências separadas. * P Art < 0,05; ** P Art < 0,01; *** P Art < 0,001
doi:. 10.1371 /journal.pone.0088270.s002
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