Mecanismo (s) de acção subjacentes ao efeito gastroprotector da fracção de acetato de etilo obtida a partir do extracto metanólico bruto folhas de Muntingia calabura

Mecanismo (s) de ação subjacente ao efeito gastroprotective da fração acetato de etila obtidos a partir do metanol bruto extrato das folhas de Muntingia calabura
Abstract
Fundo
Muntingia calabura
L. (família Muntingiaceae), vulgarmente conhecida como cereja jamaicano ou sião kerukup
na Malásia, é usado tradicionalmente para tratar várias doenças. O objetivo deste estudo é elucidar os possíveis mecanismos subjacentes gastroprotective de fração acetato de etila (EAF) de Muntingia calabura
metanólico extrato das folhas (MEMC).
Métodos
MEMC e suas frações foram submetidos a análise de CLAR identificar e quantificar a presença de seus fito-componentes. O mecanismo de gastroptotection de EAF foi adicionalmente investigado usando o modelo piloro induzida por ligadura lesão gástrica de ratos (100, 250, e 500 mg /kg). A análise macroscópica do estômago, avaliação dos parâmetros de conteúdos gástricos, tais como o volume, o pH, a acidez livre e total, a estimativa da proteína, e quantificação de muco foram realizadas. A participação do óxido nítrico (NO) e sulfidrilo compostos (SH) foi avaliada e a superóxido dismutase (SOD), glutationa (GSH), catalase (CAT), o malondialdeído (MDA), prostaglandina E 2 (PGE 2) e foi determinada nO nível no etanol induzida homogeneizado de tecido do estômago.

resultados da análise de HPLC confirmou a presença de quercetina e ácido gálico no EAF. No modelo piloro-ligadura, EAF significativamente (p
< 0,001) evitar a formação de lesão gástrica. Volume de conteúdo gástrico e conteúdo de proteína total reduzida de forma significativa (p
< 0,01 e p
< 0,05, respectivamente), enquanto que a acidez livre e total reduzido nas doses de 250 e 500 mg /kg (p
< 0,001 e p
< 0,05, respectivamente). EAF também aumentou o conteúdo de muco de forma significativa (p
< 0,001). Pré-tratamento com N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) ou N-etilmaleimida (NEM) reverteu a actividade gastroprotectora de EAF. tratamento EAF marcadamente melhorada a SOD, GSH e a actividade de CAT e PGE 2 e NO nível enquanto atenua nível MDA, relativamente ao grupo de veículo.

Conclusões Em conclusão, os mecanismos subjacentes gastroprotectores de EAF poderia ser associado com o anti-secretora, a participação de muco, antiperoxidative, a melhoria da capacidade antioxidante, a modulação de compostos de nO e SH, estimulação da PGE 2, bem como presença de quercetina e ácido gálico.
Palavras-chave
Muntingia calabura
Fraction óxido de úlcera gástrica anti-secretores Antioxidante nítrico composto sulfidrilo prostaglandina quercetina gaulês fundo ácido
úlcera gástrica é uma das principais doenças gastrointestinais que afetam número considerável de pessoas em todo o mundo, enquanto cresce na ocorrência e prevalência em todo o mundo [1]. Alguns autores referem-se a úlceras gástricas como o novo "praga" do século 21. [2]. Foi previsto que 14,5 milhões da população mundial são afetados por úlceras gástricas com uma taxa de mortalidade de 4,08 milhões de euros [3]. A fisiopatologia da úlcera gástrica está associado com o desequilíbrio entre factores agressivos e de protecção contra o estômago. lesão da mucosa gástrica ocorre quando fatores nocivos "submergir" uma defesa da mucosa intacta, ou enfraquecimento dos mecanismos de defesa da mucosa [4]. Os fatores nocivos neste contexto incluem a ingestão de álcool, a secreção de ácido e pepsina, má alimentação, stress, espécies reativas de oxigênio (ROS), o uso de drogas não esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINE) e Helicobacter pylori
infecção [5, 6]. Por outro lado, os factores de defesa principais e mecanismos que propiciam a defesa da mucosa incluem a secreção suficiente de muco e o fluxo de sangue na mucosa, a secreção de bicarbonato, a barreira de muco intacta, as prostaglandinas, a superfície fosfolipidos activos, aumento dos níveis de antioxidantes, a actividade de compostos anti-inflamatórios e adequada níveis de óxido nítrico (nO) [6-8].
Atualmente, a prevenção e tratamento de úlceras gástricas ganhou muito interesse e se tornou e importante desafio confrontando medicina hoje em dia. Até à data, há algumas abordagens utilizadas para prevenir a ulceração gástrica, que incluem potenciação da defesa da mucosa, juntamente com a redução da secreção de ácido e a sua neutralização, a estimulação da síntese de mucina gástrica, aumento dos níveis de antioxidantes no estômago, e a inibição da Helicobacter pylori
crescimento [9]. A secreção de ácido gástrico é acreditado ser o componente central de úlceras gástricas, apesar da presença de diversos factores causadores [7] e, portanto, a inibição da secreção de ácido gástrico tendem a ser o alvo terapêutico fundamental para doenças de úlcera [10]. Por outro lado, um outro factor chave na patogénese de úlceras gástricas é a produção de espécies de oxigénio reactivas (ROS). A produção de ROS e uma concomitante redução da capacidade antioxidante causa danos aos constituintes celulares essenciais, que são proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, o que resulta na formação de compostos tóxicos e provoca a morte celular devido à sua extrema reactividade [8, 11]. Portanto, o controlo da formação de ROS e da secreção de ácido gástrico são essenciais para o tratamento destas patologias [12].
O tratamento medicinal corrente de úlceras gástricas incluem bloqueadores de ácido que reduzem a secreção de ácido, inibidores da bomba de protões, antibióticos para erradicação de Helicobacter pylori e tecido protegendo revestimento tais como sucralfato e colinérgicos bismuto [13, 14]. Mesmo admitindo que essas drogas têm diminuído os índices de morbidade, mas eles são frequentemente associados com efeitos adversos indesejáveis, tais como hipersensibilidade, impotência, arritmia, doenças hematopoiéticas, ginecomastia e resistência aos antibióticos, a longo prazo [15, 16]. Além disso, estas drogas também têm disponíveis alta taxa de recaída, a baixa eficácia no tratamento de úlceras gástricas e são muitas vezes dispendiosos [5, 9, 10]. Deste modo, existe uma necessidade urgente de descobrir um mais eficazes e seguros terapias alternativas para o tratamento de úlceras gástricas. Neste contexto, o uso de plantas medicinais ganhou interesse e capturou a atenção de muitos pesquisadores. extractos de plantas pode ser valioso e servir como uma nova fonte de agentes terapêuticos no tratamento de úlceras gástricas em que anti-secretora, actividades citoprotectores e antioxidantes, isolado ou em combinação, são os três principais funções de um agente protector gástrico, que desempenham o papel chave na mucosa gástrica protecção [17].
A planta Muntingia calabura
L. (família Muntingiaceae), vulgarmente conhecida como cereja jamaicano ou kerukup sião
na Malásia, é amplamente distribuída em todas as áreas quentes da região da Ásia [18]. Vários usos medicinais têm sido documentado em várias partes desta árvore no Leste e Sudeste da Ásia, bem como a América tropical. folhas
, flores, cascas e raízes de Muntingia calabura ter sido usado como um remédio popular para o tratamento de dores de cabeça, febre e frio incipiente. De acordo com o folclore peruana, as folhas são usadas para proporcionar alívio de úlceras gástricas e para reduzir o inchaço da glândula da próstata [19]. Além disso, eles são também empregues como agente anti-séptico, anti-espasmódico, e antidyspeptic [20, 21].
Por outro lado, Muntingia calabura
é relatado possuir uma ampla gama de actividades farmacológicas, que foram comprovadas cientificamente. Isto inclui antitumoral [20, 22], anti-bacteriana [23], antinocicepção [19, 24, 25], anti-inflamatório, antipirético [25], anti-oxidantes e anti-proliferativos [26] actividades exibidas pelas folhas de Muntingia calabura
, enquanto vários tipos de compostos foram isolados e identificados a partir das folhas, raízes e cascas do caule de Muntingia calabura
[20-22, 27, 28]. Vários fitoquímicos foram detectados nas folhas de Muntingia calabura
tais como flavonóides, saponinas, taninos e triterpenos [29].
Em nosso estudo anterior, nós relataram a atividade gastroprotetora de várias frações obtidas a partir de extrato de metanol bruto de Muntingia calabura
(MEMC), folhas, contra lesão gástrica induzida por etanol em ratos [30]. Do nosso estudo, verificou-se a fracção de acetato de etilo marcadamente melhorar a ulceração gástrica e exercida a protecção mais eficaz em comparação com as outras fracções. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar o mecanismo de ação subjacente ao efeito profilático da fração acetato de etila derivado de MEMC contra lesões gástricas em ratos.
Modelo Piloro-ligadura utilizada neste estudo é um dos modelos mais utilizados para estudar o efeito de drogas sobre o ácido gástrico e a secreção de muco. Úlceras desenvolvidos por ligação da extremidade do piloro do estômago são causados ​​pelo aumento da secreção e /ou estase do ácido gástrico ácido clorídrico (HCl), que conduz à auto digestão da mucosa gástrica e ruptura da barreira da mucosa gástrica [31]. Portanto, os agentes que são capazes de aumentar a secreção de muco (citoprotector) e /ou reduzir a secreção de factores agressivos gástricos, tais como a pepsina e o ácido são eficazes agentes gastroprotectores [32]. Por outro lado, o modelo de úlcera induzida por etanol é útil para estudar a eficácia de potenciais drogas ou testar agentes citoprotectores que têm e /ou actividades antioxidantes [33].

Métodos Produtos químicos Os produtos químicos utilizados
em neste estudo são de graus analíticos e tinha sido preparado imediatamente antes da utilização. Foram utilizados os seguintes fármacos: ranitidina (Sigma Aldrich, EUA), etanol absoluto (Fischer Scientific, EUA), N-etilmaleimida (NEM) (Sigma-Aldrich, EUA), n ésteres metílicos de L-nitro-L-arginina (L-NAME) (Sigma-Aldrich, EUA), a carbenoxolona (CBX) (Sigma-Aldrich, EUA) e éter dietílico (Fischer Scientific, EUA).
material de planta
Muntingia calabura
folhas foram recolhidas do seu habitat natural em Shah Alam, Selangor, Malásia, entre Maio e agosto de 2010. a planta foi identificada por um botânico do Instituto de Biociências (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor. Um espécime comprovante, SK 2466/14, foi depositado na UPM IBS Laboratório de Produtos Naturais Herbarium.
Extração e fracionamento de Muntingia calabura
deixa
método descrito por Zakaria et al. [26] e Sufian et ai. [28] foi utilizado para preparar o extrato bruto de Muntingia calabura
folhas e respectivas fracções, respectivamente. Quinhentas gramas de folhas maduras foram secos ao ar à temperatura ambiente (27 ± 2 ° C
) durante 1-2 semanas e moída até um pó fino. Metanol (MeOH), foi usado como o solvente para a extracção. O pó foi embebido em MeOH a uma proporção de 1:20 (w /v) durante 72 h. A mistura foi filtrada utilizando filtro de funil, algodão e papel de filtro Whatman N ° 1. A imersão e a filtração foram repetidas sobre o resíduo por duas vezes. O filtrado recolhido a partir de cada uma das extracções foram combinadas e evaporadas num evaporador rotativo a 40 ° C sob pressão reduzida para se obter extracto em metanol de Muntingia calabura
(MEMC). O extracto em bruto seco foi suspenso em MeOH e água destilada (dH 2O) água na proporção de 1: 2, para proporcionar uma solução aquosa de MeOH. A mistura foi particionada sequencialmente com diferentes solventes, os quais eram éter de petróleo e acetato de etilo, originando a fracção éter de petróleo (PEF), fracção de acetato de etilo (EAF). As fracções foram filtrados e evaporados até à secura sob vácuo utilizando um evaporador rotativo. MEMC, PFE e EAF foi submetido a HPLC para quantificar o composto de interesse, que poderia ser associado com efeito gastroprotector do extracto.
A identificação e quantificação de fitoconstituintes presentes no EAF por HPLC
método descrito por Zacharia et al. [34] com ligeiras modificações foi adaptado para levar a cabo a análise por HPLC de EAF. Resumidamente, 10 mg de amostra foi suspenso em 1 ml de metanol. As soluções foram filtradas através de um cartucho de filtro (tamanho de poro de 0,45 um) antes da utilização. A amostra foi analisada utilizando um sistema de HPLC (Waters Delta 600 com 600 Controller) com detector de arranjo de fotodiodos (PDA) (Waters 996). Utilizou-se um C 18 coluna (4,6 mm d.i. x 250 mm) carregada com 5 uM partículas de diâmetro. A fase móvel foi água contendo 0,1% de ácido fórmico (A) e acetonitrilo (B). As condições iniciais foram de 85% A e 15% de B com um gradiente linear atingir 25% de B, em t = 12 min
. Esta condição foi mantida durante 10 min. B foi reduzido para 15%, a condição inicial, e foi mantida até t = 35 min
. No
t = 25 min, o programa devolvido à composição inicial de solvente. A taxa de fluxo foi de 1,0 ml /min, volume de injecção foi de 10 pi e o comprimento de onda de 280 nm eram para o ácido gálico e 330 nm para a quercetina. O forno da coluna foi fixada em 27 ° C. As soluções de reserva de referências de normalização foram preparadas em metanol a uma concentração de 1 mg /ml. Os picos da cromatografia foram confirmados por comparação do seu tempo de retenção com os de padrões de referência e pelo que os respectivos espectros de UV. curva de calibração para o ácido gálico foi Y = 29562x + 102777 (R 2 = 0,9969) e quercetina foi Y = 43236x - 81.458 (R 2 = 0,999). Todas as operações de cromatografia foram realizados a temperatura ambiente e em triplicado. A análise HPLC foi realizada no Laboratório de Phytomedicine, Plantas Medicinais Division, Instituto de Pesquisa Florestal da Malásia (FRIM), Kepong, na Malásia.
Análise UHPLC-ESI
O sistema UHPLC foi realizada em um sistema UHPLC Dionex 3000 adquirida da Thermo Fisher Scientific (EUA), que consistia de um amostrador automático equipado com um forno de coluna, um refrigerador do compartimento do tabuleiro, e uma bomba binária com desgaseificador construído em solvente. A separação cromatográfica foi realizada numa coluna BEH C18 UHPLC, com 100 mm x 2,5 mm, 1,7 um (Waters) a um caudal de 0,3 mL /min. As fases móveis utilizadas foram (A) 0,1% de ácido fórmico em água e (B) 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo. O gradiente de passos com 10% de fase móvel B, atingindo 20% de fase móvel B em 5 minutos, 60% de fase móvel B em 17,0 min, a eluição isocrática de 90% de B durante 3 min. O gradiente alcançado as condições iniciais foram mantidas durante 2 min como um passo de re-equilibração. O volume de injecção foi de 10 ul e a temperatura da coluna foi mantida a 40 ° C. O sistema UHPLC foi acoplado a um espectrómetro de massa por captura de iões Orbitrap-Q linear Exactive da Thermo Fisher Scientific (U.S.A.) equipado com uma fonte de ionização por electrospray (ESI). A detecção de massa foi realizada numa gama de 150-1500 m /z. A fonte ESI foi operado no modo de iões negativos sob as seguintes condições específicas: fonte de tensão, 3,2 kV; gás bainha, 35 unidades arbitrárias; gás auxiliar, 15 unidade arbitrária; varrer a gás, 10 unidade arbitrária; e temperatura capilar, 320 ° C. Nitrogênio (> 99,98%) foi empregado como gás de bainha, auxiliar e varrer gás. Instrumento de controlo e de aquisição de dados foram realizados com o software Chameleon 6.8 e 2.2 do software Xcalibur (Thermo Fisher Scientific)
Animais
Os experimentos foram realizados em ratos machos Sprague Dawley. (180-200 g; 8-10 semanas de idade). Eles foram obtidos a partir da Unidade de Animal, Faculdade de Medicina e Ciências da Saúde, a UPM, na Malásia. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com aparas de madeira, alimentados com pellet padrão e livre acesso permitido à água. Eles foram mantidos em temperatura ambiente (27 ± 2 0C; 70-80% de umidade; 12 h ciclo de luz /escuridão) na Unidade Segurar o animal (UPM). Antes de todos os ensaios, os ratos foram mantidos em jejum. drogas padrão e MEMC foram administrados oralmente (p.o.) por sonda esofágica com 8% de Tween 80 (10 mL /kg) como o veículo. O uso de animais neste estudo foi aprovado pelo Animal Care e do Comitê usado (ACUC) da UPM (Aprovação No: UPM /FPSK /PADS /BR-UUH /00474)
Determinação do mecanismo subjacente à atividade gastroprotetora do. EAF
ligadura Pyloric
Método por Shay et al. [35] com ligeiras modificações foi utilizada para efectuar ligação pilórica. Os ratos foram aleatoriamente divididos em 5 grupos, com seis ratos em cada grupo. Grupo-I foi o grupo de controle administrado com 8% Tween 80 (veículo) por via oral (po), Grupo-II foi o controle positivo administrado com ranitidina a 100 mg /kg (po), enquanto para o grupo-III, -IV e- V, os ratos foram administrados com EAF (100, 250 e 500 mg /kg, respectivamente). Piloro de ligação foi realizado em 48 horas em jejum ratos 1 h após a administração dos compostos de teste. Sob anestesia ligeira induzida utilizando HCl cetamina (100 mg /kg, por via intramuscular) e HCl xilazina (16 mg /kg, por via intramuscular), a 2 cm de comprimento na linha média incisão abdominal foi realizada, imediatamente abaixo do esterno. A porção do piloro do estômago foi gentilmente mobilizada e cuidadosamente ligados com uma ligadura de seda em torno do esfíncter pilórico em um nó apertado. Foi tomado cuidado ao amarrar o nó para evitar interferência com o fornecimento de sangue gástrico. A incisão abdominal foi suturada, a pele foi limpa de quaisquer manchas de sangue ou sangramento e os animais foram deixados a recuperar da anestesia.
Avaliação da lesão da mucosa gástrica
Os animais foram sacrificados 6 horas após a ligação por exposição a éter dietílico e deslocamento cervical. Os estômagos foram removidos, e os conteúdos foram drenados para fora, recolhido e centrifugado. O estômago foi aberto ao longo da curvatura maior para determinar o dano da lesão, conforme descrito por Balan et ai. [36]. A protecção percentual foi calculada utilizando a seguinte fórmula: $$ \\ mathrm {Protecção} \\ \\ left (\\% \\ right) = \\ frac {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {controle} \\ \\ hbox {-} \\ \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {tratados} \\ \\ mathrm {group} \\ direita)} {\\ left (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {controle} \\ right)} \\ times 100 \\% $$ Determinação do volume, pH, livre e acidez total do conteúdo gástrico
o conteúdo gástrico drenada foi centrifugado durante 10 min a 2500 rpm para remover qualquer resíduo sólido. O volume e o pH do suco gástrico foi medido. O suco gástrico também foi submetido a estimativa acidez total e livre de acordo com o método descrito por Srivastava et ai. [37]. A titulação com NaOH 0,01 N com o reagente de laranja de metilo foi realizada até a cor da solução tornou-se amarelada, a fim de determinar a acidez livre. O volume de álcali adicionado foi observada. Em seguida, duas a três gotas de fenolftaleína foi adicionado à solução. A solução foi titulada até reflexos vermelhos definidas aparecer. O volume total de NaOH adicionada foi observado. Este volume corresponde a acidez total. Acidez foi calculada utilizando a seguinte fórmula: $$ \\ mathrm {acidez} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ \\ mathrm {de} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times \\ mathrm {normalidade} \\ \\ mathrm {de} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ times 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /\\ mathrm {l} $$ estimativa de proteína
O conteúdo total de proteínas no suco gástrico foi estimado pelo método de Lowry, adaptado de Lowry et ai. [38] utilizando o reagente de cobre alcalino e reagente de Folin. A cor desenvolvida foi lida a 660 nm. O teor de proteína foi calculado a partir da curva padrão preparada com a concentração de albumina de soro de bovino e a proteína foi expressa em mg /ml de suco gástrico.
Estimativa da parede do muco gástrico do conteúdo
método descrito por Corne et al. [39] com ligeiras modificações foi utilizada para determinar o teor de parede muco gástrico. O estômago foi aberto ao longo da curvatura maior, pesados ​​e imersos em 10 ml de 0,1% de azul Alcian (0,16 M de sacarose em acetato de sódio 0,05 M, pH 5,8) durante 2 h. O estômago foi então enxaguado duas vezes em solução de sacarose 0,25 M (15 min cada) para remover o corante em excesso. O corante remanescente que complexado com o muco gástrico foi extraída com 0,5 M MgCl 2. O segmento glandular manteve-se nesta solução durante 2 h, com agitação intermitente durante 1 min em cada intervalo de 30 min. O extracto de azul resultante foi em seguida agitada vigorosamente com um volume igual de éter dietílico até que a formação de uma emulsão. A emulsão resultante foi centrifugado durante 10 min a 3600 rpm. A absorvência da camada aquosa foi lida a 580 nm utilizando um espectrofotómetro. A concentração de azul Alcian foi calculado através de uma curva padrão e os resultados foram expressos em mg de Alcian blue /g de tecido molhado.
Lesão da mucosa gástrica induzida por etanol em L-NAME ou ratos NEM pré-tratadas in the papel do nO endógeno e o envolvimento de sulfidrilo (SH) compostos em o efeito gastroprotector do EAF foram avaliadas utilizando o método descrito por Takayama et ai. [40]. Os ratos machos foram divididos em 9 grupos e pré-tratado (ip) com (éster de N-nitro-L-arginina metil, 70 mg /kg) de solução salina, L-NAME um inibidor da síntese de NO ou NEM (N-etilmaleimida, 10 mg /kg) um composto SH bloqueador. Trinta minutos após o pré-tratamento, os animais foram administrados os (p.o.) de veículo (8% de Tween 80), a carbenoxolona (100 mg /kg) ou EAF (500 mg /kg). Sessenta minutos mais tarde, todos os grupos receberam etanol absoluto (5 ml /kg, p.o.) para induzir úlceras gástricas. Todos os ratos foram sacrificados uma hora após a administração de etanol por exposição a éter dietílico e deslocamento cervical. O estômago foi removido e dano gástrico foi determinada como descrito acima. Desde EAF exibiram um efeito dependente da dose e acção protectora exercida substancial contra a mucosa gástrica no modelo de úlcera gástrica induzida pelo etanol, foi usada a mais elevada dose eficaz (500 mg /kg) para este estudo.
Análise bioquímica
Medição de superóxido dismutase (SOD), o nível de glutationa (GSH) e a actividade de catalase (CAT)
tecidos do estômago dos ratos pré-tratados com o veículo (8% de Tween 80), ranitidina (100 mg /kg) ou EAF (100, 250 e 500 mg /kg), seguido de indução de úlcera com etanol absoluto, durante 1 h foram usadas para a determinação de SOD, o nível de GSH e a actividade de CAT. tecido gástrico foi cortado em pedaços e o peso exacto foi gravado. Os tecidos foram homogeneizados com um homogeneizador utilizando tampão frio adequado e, em seguida, foram centrifugadas a 10000 g durante 15 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram utilizados para determinar as actividades de CAT e os níveis de SOD, e GSH. A concentração de proteína no sobrenadante foi medida pelo método de Bradford [41] utilizando albumina de soro bovino (BSA) como padrão. Os níveis de SOD, GSH e de CAT foram determinados utilizando os kits de ensaio comerciais de acordo com as instruções do fabricante, respectivamente (superóxido dismutase Assay Kit, Kit de Ensaio de glutationa e catalase Assay Kit, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EUA).
a medição do nível de malondialdeído (MDA)
níveis de MDA foram medidos em tecidos obtidos a partir do estômago a úlcera gástrica induzida por etanol. O tecido do estômago foi homogeneizada e centrifugada tal como descrito antes e o sobrenadante foi utilizado para determinação de MDA, utilizando um kit de ensaio imunossorvente ligado a enzima (USCN Life Science Inc., Atlanta, GA, EUA). As densidades ópticas foram medidas a 450 nm e os resultados foram expressos como ng /mg de proteína.
Determinação de prostaglandina E2 (PGE2)
PGE 2 foram determinados em tecidos obtidos a partir do estômago do gástrica induzida por etanol úlcera. O sobrenadante de tecido homogeneizado e centrifugado estômago foi utilizado para a determinação da PGE 2 pelo uso de prostaglandina E 2 Kit expresso EIA (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EUA). As densidades ópticas foram medidas a 412 nm. O 2 concentrações PGE foram normalizados por teores de proteína e os resultados foram expressos como proteínas pg /mg.
Determinação do NO nível
NO nível na mucosa gástrica foi avaliada como o total de níveis de nitrato /nitrito utilizando reagente Griess [42]. Em resumo, prepararam-se os homogenados de estômago em tampão de fosfato de potássio 50 mM (pH 7,8). Os homogenatos foram centrifugados a 4000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Cinquenta microlitros de reagente de Griess (0,1% de N- (1-naftil) ethylenediamide dicloridrato, 1% de sulfanilamida em ácido fosfórico a 5%) foi adicionado a 50 ul de sobrenadante e a absorvância foi medida a 540 nm após 10 min. de nitrito de sódio foi usado como o padrão neste ensaio para gerar a curva padrão. A análise estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM) e analisados ​​utilizando One Análise de variância (ANOVA), seguido por hoc
pós-teste de Dunnett ou o teste de Newman-Keuls. Os resultados foram considerados significativos quando p <
0.
05.
Resultado
Identificação e quantificação de ácido gálico e quercetina
fingerprinting HPLC de MEMC, PEF e EAF revelou a presença do gálico ácido a λ max 216,6-272,0 nm e quercetina na λ max 255,5-370,6 nm (Fig. 1a e b). Bater destes compostos em MEMC, PFE ou EAF aumentou a área do pico, que corresponde ao mesmo λ valor máximo dos compostos. O resultado quantificação apresentados na Tabela 1 mostra que EAF contém a maior quantidade de ácido gálico (39,89 ± 0,96 mg /g de extracto) e quercetina (9,36 ± 0,29 mg /g de extracto) seguido por MEMC e PFE. FIG. 1 a e b: A análise por HPLC de MEMC, PFE e EAF efectuada no comprimento de onda de 330 nm revelou a presença de quercetina em À ^ nm 255,5-370,6 à TA 3,696 min. Bater da quercetina com os extractos de aumento da área do pico, correspondendo ao mesmo valor Xmax dos compostos. c e d: HPLC fingerprinting de MEMC, PFE e EAF no comprimento de onda de 280 nm revelou a presença do gallicacid em À ^ nm 216,6-272,0 à TA 4,204 min. Bater de ácido gálico com os extractos de aumento da área do pico, correspondendo ao mesmo valor Xmax dos compostos
Tabela 1 gálico ácido e composição da quercetina em MEMC e as suas fracções activas (PFE e EAF) em mg /1 g de extracto. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (SDS) de três determinações
compostos
MEMC
PEF
EAF
ácido gálico (mg /g)
11,97 ± 0,27
3,40 ± 0,01
39,89 ± 0,96
quercetina (mg /g)
4,83 ± 0,16
8,81 ± 0,44
9,36 ± 0,29
identificação de compostos fenólicos em EAF
EAF foi analisada com base nos dados de massa precisas dos íons moleculares, em que iões detectados foram tentativamente identificados pela sua fórmula molecular gerado, por meio da análise de software de dados (Xcalibur), que forneceu uma lista de possíveis elemental fórmulas, em conjunto com a utilização do padrão quando disponíveis e depois levantamento completo da literatura.
o limiar precisão amplamente aceite para a confirmação de composições elementares foi de 5 ppm. A análise UHPLC-ESI de EAF revelou a presença de 22 compostos fenólicos (Tabela 2), cuja lista o número de pico, tempo de retenção, observado m /z
, a fórmula molecular gerado e o composto proposto detectado. A Figura 2 corresponde ao pico de base no cromatograma de iões negativos, com a estrutura da molécula de ermanin, kaempferide, pinobaksin e pinostrobin na Fig. 3.Table 2 Os compostos fenólicos identificados na EAF por UHPLC-MS
Peak Nenhuma
tR (min)
[MH] -
Error (ppm)

Fórmula
Identificação
1.
0,45
169,01376
3.433
C7H5O5
ácido gálico
2.
2,34
163,03978
4.964
C9H7O3
ácido protocatecóico
3.
3.10
193,05020
3.443
C10H9O4
ácido ferúlico
4.
4,53
599,10547
3.879
C28H23O15
quercitrina-2 "-O-galato
5.
4,93
939,11377
4.220
C41H31O26
Pentagalloyl -hexoside II
6.
5.05
447,09421
4,523
C21H19O11
Kaempferol-3-O
-galactoside
7.
5,31
317,0308
5.130
C15H9O8
miricetina
8.
6,20
193,08661
3.569
C10H9O4
isoferúlico ácido
9.
6,91
583,11053
3,941
C28H23O14
afzelina-O-galato
10.
7,35
301,03586
4,023
C15H9O7
quercetina
11.
7,42
603,07928
3.894
C30H19O14
quercetina dímero
12.
7,67
255,06636
4.605
C15H11O4
pinocembrina
13.
8,14
593,13116
3.697
C30H25O13
Kaempferol-3-O
-glucoside
14.
8,18
315,05196
6,478
C16H11O7
ramnetina
15.
8,55
271,06094
3.099
C15H12O5
Pinobaksin
16.
8,94
285,04037
3.528
C15H9O6
Kaempferol
17.
10.80
253,05063
4.326
C15H9O4
Chyrsin I
18.
11,67
253,05099
5.749
C15H9O4
Chyrsin II
19.
11,91
299,05597
3.195
C16H11O6
Kaempferide
20.
12,56
313,07245
5,703
C17H13O6
Ermanin I
21
12,78
313,07230
5.224
C17H13O6
Ermanin II
22.
13,32
269,08194
4.105
C16H13O4
Pinostrobin
Fig. FIG. FIG. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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