Presença de células inflamatórias S100A9-positiva em tecidos de câncer se correlaciona com um câncer em estágio precoce e um melhor prognóstico em pacientes com câncer gástrico

Presença de células inflamatórias S100A9-positivas em tecidos de câncer se correlaciona com um câncer em estágio precoce e um melhor prognóstico em pacientes com câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
S100A9 foi descoberto originalmente como um factor secretado pelas células inflamatórias. Recentemente, S100A9 foi encontrado para ser associado a várias malignidades humanas. O objetivo deste estudo é investigar a expressão S100A9 no câncer gástrico e explorar o seu papel na progressão do cancro.
Métodos
expressão S100A9 em amostras de tecido gástrico de 177 pacientes com câncer gástrico foi avaliada por imuno-histoquímica. A expressão da sua parceira dimerização S100A8 e S100A8 heterodímero /A9 também foram avaliadas pelo mesmo método. O efeito da S100A9 exógeno sobre a motilidade das células cancerosas AGS gástricas e BGC-823 foi então investigada.
Resultados
S100A9 foi especificamente expresso por células inflamatórias, como macrófagos e neutrófilos em tecidos de câncer e gastrite gástricos humanos. A análise estatística mostrou que uma alta contagem de S100A9 celular (> = 200) por aumento de 200x campo microscópico em tecidos de câncer foi preditiva de câncer gástrico fase inicial. contagem de células de alta S100A9 positivo foi negativamente correlacionada com metástases em linfonodos (P
= 0,009) e invasão tumoral (P
= 0,011). S100A9 foi identificada como um preditor independente de prognóstico de sobrevida global dos pacientes com câncer gástrico (P
= 0,04). Os pacientes com contagem de células de alta S100A9 estavam com prognóstico favorável (P
= 0,021). Outras investigações descobriram que a distribuição S100A8 em tecidos de câncer gástrico humano foi semelhante ao S100A9. No entanto, o número de células S100A8-positiva não se correlacionam de forma positiva com a sobrevivência do paciente. As células inflamatórias infiltrantes foram cancro S100A8 /A9 negativo, ao passo que aqueles na gastrite foram positivos. Além disso, a proteína S100A9 exógena migração e invasão das células cancerosas gástricas inibidos.
Conclusões
Nossos resultados sugerem células inflamatórias S100A9-positiva em tecidos com câncer gástrico estão associados com estágio inicial de câncer de estômago e bom prognóstico.
Palavras-chave
O câncer gástrico S100A9 As células inflamatórias do tumor encenação Survival fundo
O câncer gástrico é uma das principais causas de mortalidade por cancro em todo o mundo. Um total de 989,600 novos casos de cancro do estômago e 738,000 mortes foram estimados para ter ocorrido em 2008, e mais de 70% dos novos casos e mortes ocorrem em países em desenvolvimento como a China [1]. O câncer gástrico é comumente detectada em estágios avançados, quando os resultados prognósticos são pobres. Cerca de 70-80% dos pacientes têm o envolvimento dos gânglios linfáticos regionais que tem uma profunda influência sobre a sobrevivência [2, 3]. Portanto, a descoberta de novos biomarcadores auxiliando na detecção precoce e a predição precisa do comportamento do tumor pode melhorar a sobrevivência do paciente [4-6].
Os membros da família de proteínas S100 estão a emergir como biomarcadores em vários tipos de tumores [7]. O membro da família S100 S100A9 é uma proteína 13kd que contém motivos estruturais conservados consistindo de duas EF-hand Ca 2 domínios + liga�o ao. Após ligação ao cálcio, S100A9 interage com outro membro da família S100 S100A8 para formar o heterodímero funcional chamado calprotectina [8, 9]. S100A9 foi originalmente identificada como um factor secretado pelas células inflamatórias tais como neutrófilos e macrófagos em artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino, e outras doenças inflamatórias [10-14]. S100A9, S100A8, bem como o heterodímero calprotectina S100A8 /A9, são sobre-expressos durante a carcinogénese induzida por inflamação [15]. S100A9 expressão é sobre-regulada em células de tumor de pulmão em [16], da próstata [17], e cancro da mama [18, 19], ao mesmo tempo que é sub-regulada em células de cancro esofágico humanos [20]. Em amostras de tecido de cancro colorrectal, no entanto, a proteína S100A9 não foi detectada em células cancerosas, mas sim em células inflamatórias espalhados por todo o estroma tumoral [21]. Além disso, S100A9 foi significativamente mais elevada em amostras de fezes de doentes com cancro colorrectal do que nos controlos [22]. No cancro gástrico, a expressão de genes e análise de proteómica demonstraram elevada expressão de S100A9 no tecido. [23, 24]. No entanto, a sua distribuição dentro do tecido e de associação com características clínico-patológicas não foram plenamente demonstradas.
Neste estudo, foi utilizada análise de expressão gênica para comparar expressão S100A9 em tecidos com câncer gástrico e nos tecidos adjacentes, aparentemente normais. coloração imuno-histoquímica revelou S100A9 em células inflamatórias associadas ao tumor. Além disso, abordamos a correlação entre o número de células S100A9-positiva em tecidos tumorais e as características clínico-patológicas. Nós também dirigida a co-localização de S100A9 e S100A8, bem como a localização da calprotectina dímero por imunofluorescência. Finalmente, para obter insights sobre a função da S100A9 nas células cancerosas, nós investigamos o efeito da proteína S100A9 recombinante sobre a migração e invasão das células cancerosas AGS gástricas e BGC-823.
Métodos
Pacientes e amostras de tecido
Esta investigação foi realizada após a aprovação pelo Comitê de Ética da Peking University Hospital do Câncer. O consentimento informado foi obtido de cada paciente. Cento e setenta e seis pacientes com câncer gástrico foram estudados. 124 do sexo masculino e 53 do sexo feminino (idade, 57 anos; intervalo, 26-80 anos) foram diagnosticados e tratados cirurgicamente em Pequim Hospital do Câncer University, entre 1998 e 2004. A profundidade de invasão do tumor, grau histológico, metástase linfonodal, metástases hepáticas, e invasão vascular foram obtidos a partir de relatórios clínicos e histopatológicos. Estágio do câncer gástrico foi classificada de acordo com a 7ª edição do tumor-node metástase classificação (TNM) recomendado pela American Joint Committee on Cancer. Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia ou terapia de radiação no pré-operatório. Todos os pacientes foram acompanhados até janeiro de 2010. Depois de gastrectomia, uma parte do espécime ressecado foi fixado em formalina a 10% e processados ​​rotineiramente para avaliação patológica, e outro foi snap-congelados em nitrogênio líquido armazenado a -80 ° C para a extração de RNA. Além disso, 30 correspondentes linfonodos metastáticos também foram recolhidas a partir desses doentes. Dez casos de tecidos apendicite crônica com exacerbação foram fornecidos pelo Departamento de Cirurgia Geral, o hospital afiliada da Universidade de Qingdao Medical College.
Imuno-histoquímica (IHQ)
seções quatro micrômetros de tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina foram montados em poli-L-lisina-revestidas lâminas e, em seguida, desparafinados em xileno e re-hidratadas por meio de álcool para água destilada. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% de peróxido de hidrogénio durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de pressão cozinhar as lâminas em 10 mmol /L de EDTA (pH 8,0) durante 3 minutos, as secções foram incubadas com soro de cabra a 5%, depois incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo de ratinho anti-S100A9 (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Suíça), ou mouse anticorpo anti-S100A8 (1: 200, T1031, BMA Biomedicals), ou mouse anticorpo anti-S100A8 /A9 (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Os anticorpos primários foram detectados utilizando um sistema EnVision de dois passos (Dako, Glostrup, Dinamarca). A peroxidase de rábano e cloridrato diaminobenzedene (DAB) foram enzima e cromogénio empregue. Expressão de S100A9, S100A8 e S100A8 /A9, também foram detectados em Cybrdi lâminas de tissue microarray (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, China) contendo gastrite crônica com metaplasia (57 casos) e tecidos de carcinoma gástrico (23 casos). Dez casos de espécimes de apendicite crônica com exacerbação foram servidos como controle positivo para S100A8 /A9.
Avaliação IHC e de corte Definição de S100A9 e S100A8 foram corados nas células inflamatórias, como macrófagos e neutrófilos infiltrando tecidos tumorais. As células positivas mostraram um grau variável de coloração citoplasmática. As imagens foram adquiridas utilizando Ariol sistema de análise de imagem (imagem Aplicada, San Jose, CA, EUA). O scanner é baseado em um microscópio Olympus BX61 com uma capacidade de palco e autofoco motorizado equipado com uma câmera. As lâminas foram feitos a varredura em 200 × ampliação. O grau de S100A9 monoclonal ou reactividade do anticorpo S100A8 em cada secção de tecido foi avaliada pela contagem do número de células inflamatórias manchados em três 200 × âmbitos de ampliação. Esta foi realizado por dois patologistas independentes, com a ajuda de um sistema de microscópio automática eo software de processamento de imagem (veja o arquivo adicional 1: Figura S1). valor de corte de S100A9 manchado células inflamatórias para a predição de estágio patológico do paciente foi determinada pela curva receiver operating characteristic (ROC). confocal
Laser
Para investigar a co-localização de S100A9 e seu parceiro de dimerização S100A8, ou o heterodímero S100A8 /A9, as lâminas tissue microarray Cybrdi (IC00-01-001) foram incubadas 1,5 horas à temperatura ambiente com anticorpo anti-S100A9 rato (1: 200) pré-marcado com o kit de Zenon Alexa Fluor 647 IgG de ratinho Etiquetagem (Z-25008, fluorescência vermelha), e, ou o anticorpo anti-S100A8 (1: 200) ou anticorpo anti-S100A8 /A9 (1: 200) pré-marcado com o Zenon Alexa Fluor 488 IgG de ratinho Labeling Kit (Z-25002 , fluorescência verde). imagens confocais foram adquiridos usando o Leica TCS SP5 microscópio confocal (Leica, Mannheim, Alemanha). . Além disso, os núcleos de contra-coradas com DAPI (Vector, Burlingame, CA, EUA), excitação a 358 nm
espécimes de tecidos apendicite crónicas com exacerbação foram incubadas com anticorpo anti-S100A9 (1: 200, fluorescência vermelha marcada), S100A8 e anti-/anticorpo A9. (1: 200, a fluorescência verde marcado) como um controlo positivo para a expressão específica heterodímero S100A8 /A9 cultura celular

Ambas as linhas celulares neste estudo foram previamente perfilado por análise de microarray e foram regularmente verificada por meio de análise STR (short DNA fingerprinting em tandem repeat) [25]. linha de células de câncer gástrico AGS foi obtida a partir de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), e a linha celular BGC-823 foi estabelecida na China e obteve do Instituto de Pesquisa Cell, Shanghai, China. As células cancerígenas foram rotineiramente cultivadas como uma monocamada em meio de RPMI-1640 (Gibco BRL, Carlsbad, CA), suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de vitelo (FCS, Gibco) e antibióticos, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% CO 2 atmosfera. ensaio
celular invasão
CytoSelect 24 Bem celular Invasion Assay kit foi comprado de celular Biolabs, EUA. S100A9 proteína recombinante foi adquirida a BMA Biomedicals, Suíça. Os ensaios de invasão celular foram realizadas com inserções Transwell, que permite que as células para migrar através de uma membrana de policarbonato de tamanho de poro de 8 um. A superfície superior da membrana inserção foi revestido com uma camada uniforme de solução de matriz de membrana basal seca. As células foram ressuspensas em meio livre de soro foram plaqueadas na câmara superior de cada Transwell a uma densidade de 10 6 células /mL (200? L /Secção). S100A9 proteína recombinante foi adicionado ao meio de câmara superior a 0, 10, 20, 50, ou 100 ng /ml. A câmara inferior foi preenchida com o meio de 500 ul contendo 10% de FCS. As células foram deixadas migrar durante 48 h a 37 ° C. As células que permaneceram na câmara superior foram removidas com uma mecha de algodão, e as células que tinha penetrado para o lado inferior da membrana foram coradas na Cell Stain Solution durante 15 minutos, e contaram-se nove campos microscópicos seleccionados aleatoriamente (200 ×) por poço . Cada pastilha foi depois transferida para um poço vazio e incubadas em 200? L de Solução Extractiva. Após 10 minutos, 100 uL de solução de cada amostra foram transferidos para uma placa de microtitulação de 96 poços e medida num leitor de placas a OD560nm.
Ensaio de migração celular
mobilidade celular foi avaliada utilizando um ensaio de ferida cura. As células foram semeadas em pratos de seis cavidades de cultura de tecidos e foram cultivadas até à confluência para obter uma monocamada de células, que foi, em seguida, esterilizadas ferido usando 200 ul de pontas de pipeta. Quaisquer detritos celulares foram removidos por lavagem com PBS. A célula monocamada ferida foi então incubado em meio com 100 ml de proteína /ng S100A9 recombinante. As células de controlo foram tratadas com meio isento de soro de meio RPMI-1640. imagens de lapso de tempo foram capturadas usando um microscópio de contraste de fase invertida a 200 × ampliação para 0, 24 e 48 h. A capacidade de migração celular foi avaliada calculando a média da distância de migração de células. A análise estatística

variáveis ​​clinicopatológicas foram extraídos a partir de relatórios clínicos e histopatológicos. Curvas ROC foram utilizados na determinação do valor de corte da contagem de células inflamatórias S100A9 positivo na avaliação de estágio TNM patológico. A associação de contagem de células inflamatórias S100A9-positiva com diferentes estágios TNM foi feito com o teste de soma de postos de Wilcoxon. Para obter associações entre a contagem de células S100A9 ou S100A8 e variáveis ​​clínico-patológicas, os dados era uma tabulação cruzada e uma χ
2 foi realizado teste. sobrevida cumulativa foi estimado com o método de Kaplan-Meier, e as comparações entre os grupos foram feitas com um teste de log-rank. A sobrevida global foi medida a partir da data da cirurgia inicial a data da morte, contando morte por qualquer causa como o ponto final, ou a última data de informações como o ponto final se nenhum evento foi documentado. A análise multivariada do modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox (para trás, passo a passo) foi criado para avaliar a influência de cada variável sobre a sobrevivência. Significância foi estabelecido em P Art < 0,05.

Resultados Expressão de S100A9 na infiltração de células inflamatórias no cancro gástrico e tecidos gastrite crônica
Numa análise matriz gene anterior, encontramos que os tecidos com câncer gástrico foram distinguidos de mucosa não canceroso adjacente por diferentes características de sua padrões de expressão de genes [26]. A diversidade de padrões de expressão de genes podem reflectir a variação nas propriedades intrínsecas de células tumorais e normais, bem como a variação na composição celular desses tecidos complexos. Dentro destes genes, a expressão de S100A9 em tecidos de cancro gástrico foi maior do que a da mucosa benigno adjacente combinados (P = 0,00241
, Figura 1A). Figura 1 Expressão de S100A9 no cancro gástrico e tecidos não-cancerosas adjacentes. (A) o valor expressão diferente da S100A9 em 72 tecidos de câncer gástrico e emparelhado não-cancerosas tecidos através da análise de dados de cDNA microarray BeadChip Sentrix illumina. (B-E) Coloração imuno-histoquímica em tecidos de S100A9 cancro gástrico (B) linfonodos metastáticos (C), gastrite crónica (D), e da mucosa gástrica não cancerosos adjacentes (E). S100A9 localização foi revelado como loci granulado castanho ou vermelho no citoplasma de células inflamatórias infiltrantes, especialmente em fagócitos mononucleares e granulócitos neutrófilos. (Ampliação de × 200).
Imuno-histoquímica de amostras de 177 doentes com cancro gástrico mostrou que S100A9 foi positivo em todos os tecidos de cancro primário com a imunomarcação exclusivamente localizado em células inflamatórias tais como neutrófilos e macrófagos infiltrantes tecidos tumorais primários (Os tipos celulares diferentes em tecido As amostras foram identificadas por dois patologistas independentes) (Figura 1B). Todos os linfonodos metastáticos analisados ​​(n = 30) também foram positivos para S100A9 com imunocoloração exclusivamente localizado em células inflamatórias circundantes aos tecidos de cancro metastático (Figura 1C). Na mucosa não-canceroso adjacente, S100A9 foi expresso em células inflamatórias infiltrantes gastrite. mucosa gástrica teve expressão S100A9 negativo ou muito fraca (Figura 1D, E).
contagem de células inflamatórias S100A9-positiva em tecidos de câncer está associado com o estágio do câncer e sobrevida do paciente
Para avaliar a extensão da expressão S100A9 em Câncer gástrico ambiente associada, o número de células inflamatórias S100A9-positivos em todos os tecidos do tumor foi medido através da média das contagens de células de três campos (ampliação original, 200 ×), na área com o maior número de células positivas no local da mais profunda invasão do tumor. Correlação entre a contagem de células e os parâmetros clínico e sobrevida do paciente foi analisada por meio do teste de soma de postos de Wilcoxon e método de Kaplan-Meier. Como mostrado na Figura 2A, diminuição gradual da contagem de células inflamatórias S100A9-positiva em tecidos de cancro foi associada com o aumento de tumor fase patológica de I a IV (teste da soma de pontuação de Wilcoxon para as fases 4, P = 0,0265
). Figura contagem de células 2 High S100A9 no tecido do cancro indica melhores resultados em pacientes com câncer gástrico. (A) Gráfico de dispersão da contagem de células inflamatórias S100A9-positiva em cada estágio TNM patológico. A linha azul indica o nível de 200. (B) curva ROC de contagem de células S100A9 para a predição de estágio TNM patológico. Seta indicou o ponto de corte cerca de 200. (C) Análise de Kaplan-Meier de sobrevida global para cada estágio TNM patológico. (D) Análise de Kaplan-Meier de sobrevida global para a contagem de células de alta S100A9 (≥ 200) de grupo e baixa contagem de células S100A9 (< 200) do grupo. (Apenas 176 pacientes foram incluídos na análise de um paciente perdidos para follow-up).
Em seguida, testamos o poder de predição da contagem de células S100A9 para o estágio do tumor no câncer gástrico. Com base no estágio TNM, os pacientes foram divididos em dois grupos, o grupo menos avançado (estágio I + II) e grupo avançado (estágio III + IV). Área sob a curva (AUC) obtida a partir da curva ROC (ROC), utilizando as células inflamatórias S100A9 positivo contagem foi 0,623 para os estádios TNM patológicas. O valor de corte foi de 198,5 (usamos 200 na análise a seguir) por 200 campo × ampliação com sensibilidade de 64,3% e 61,9% de especificidade para a previsão do estágio do tumor (Figura 2B). A linha de corte 200 pode ser utilizado para separar o grupo menos avançado a partir do grupo avançado. A diferença foi significativa entre os dois grupos (teste de Wilcoxon rank sum para dois grupos, P = 0,017
, Figura 2A).
Desde análise de sobrevivência mostrou prognóstico significativamente diferentes para pacientes com câncer gástrico em diferentes estágios do câncer (Figura 2C) , foi analisada a relação entre as células inflamatórias S100A9-positivos contam e taxa de sobrevida dos pacientes. Os pacientes foram estratificados por valor de corte para a contagem de células de alta S100A9 (≥ 200) de grupo e baixa contagem de células S100A9; grupo (<200). taxa de sobrevida em 5 anos foi de 44,6% no grupo alta contagem de células versus 22,5% no grupo baixa contagem de células (P = 0,021
, Figura 2D). tempo médio de sobrevivência foi de 35,1 ± 10,8 meses para o grupo contagem de células de alta e de 20,3 ± 3,0 meses para o grupo de baixa contagem de células, respectivamente. Tomados em conjunto, a contagem de células inflamatórias S100A9-positiva no tecido de cancro gástrico pode ser usado como um preditor para distinguir fase precoce e cancro gástrico avançado, com o ponto de corte de 200 células positivas /HPF. Presença de células inflamatórias S100A9-positivas em tecidos de câncer correlaciona-se com um melhor prognóstico em pacientes com câncer gástrico.
Baixo número de células inflamatórias S100A9-positivas em tecidos de câncer se correlaciona positivamente com pobres características clinicopatológicas
baixa contagem de células S100A9 foi encontrado estar correlacionada com a profundidade de invasão tumoral (estádio T), metástase linfática (N palco), e estágio TNM clínico (P
= 0,011, 0,009 e 0,002, respectivamente). Correlação entre a contagem de células S100A9 e outras características clínicas, tais como sexo, idade, localização do tumor, metástase hepática (M palco), invasão vascular e diferenciação não foram estatisticamente significativas (todos P Art > 0,05) (Tabela 1). Além disso, a análise multivariada demonstrou estádio N (P
= 0,006), metástase hepática (P
= 0,000) e contagem de células S100A9 (P
= 0,046) a ser fatores independentes na previsão de sobrevida global (Tabela 2 ) .table 1 Associação de contagem S100A9 positivo de células inflamatórias nos tecidos cancerosos com os parâmetros clínico em doentes com cancro gástrico
Variáveis ​​
Baixa S100A9 (células positivas < 200)
alta S100A9 ( células positivas > = 200)
P valor
Sex
0,125
Masculino
74
50
Feminino
25
28
Idade
0,089 Art < 50
32
18
50-59
24
12
60-69
33
33 Restaurant > = 70
10
15
localização do tumor
0,271
Cardia
26
15
não-cárdia
73
63
Depth of invasão tumoral **
0,011
T1 Sims 3 Página 2
T2
7
19
T3
69
42
T4
20
15
metástases linfonodais
0,009
N0
13
23
N1
32
30
N2
32
17
N3
22
8
metástase hepática
0,571
negativo
89
68
positiva
10
10
estágio TNM
0,002
І Sims 3
12
II
37
35
III
50
21
IV
9
10
invasão vascular
0,742
negativo
38
31
positiva
58
43
Não gravado * Sims 3
4
Diferenciação **
0,472
Bem Página 2 4
Moderadamente + mal
82
66
Outros tipos
13
6
Não determinado Página 2 Página 2
* Os dados incompletos.
** teste exato de Fisher.
Tabela 2 A análise multivariada de fatores prognósticos para a sobrevida global de pacientes com câncer gástrico
Variações
P
RR
IC (95%)
Sex
0,671
1.106
0,694-1,765
Homem contra o sexo feminino
Idade
0,179
1.148
0,938-1,405 Art < 50
50-59
60-69 Restaurant > = 70
localização do tumor
0,545
0,864
0,538-1,387
Cardia vs.
não-cárdia
Diferenciação
0,301
0,751
0.437- 1.292
Bem contra moderadamente + mal
metástases linfonodais
0,006
1.841
1,196-2,835
N0 + N1 contra N2 + N3
profundidade de invasão tumoral
0,1
1.756
0,897-3,435
T1 + T2 contra T3 + T4
metástase hepática
0
3.461
2,002-5,983
negativa em relação positiva
Vascular invasão
0,107
1.452
0,922-2,285
negativa em relação positiva
células inflamatórias S100A9 positivo contagem
0,046
0,643
,417-0,991 Art < 200 contra > = 200
RR: risco relativo; CI:. Intervalo de confiança
O estado de expressão de S100A8 e heterodímero S100A8 /A9 em gástrica tecidos de câncer e tecidos gastrite
gastrite crônica é uma lesão gástrica crônica, patologicamente caracterizada por inflamação crônica não específica da mucosa gástrica. As células inflamatórias na gastrite crónica são morfologicamente como aqueles infiltrar tecidos com cancro gástrico primários. Em alguns casos, gastrite crónica mesmo pode conduzir ao cancro do estômago. Em seguida, examinamos ainda mais a expressão de S100A8, um familiar próximo de S100A9 e a forma heterodimerização S100A8 /A9 em ambos os tecidos de câncer gástrico e não tumorais tecidos gastrite crônica adjacentes nas amostras com câncer gástrico através da realização de imuno-histoquímica. De forma semelhante ao padrão de S100A9, S100A8 foi exclusivamente expressa em células inflamatórias infiltrantes ambos os tecidos de tumor e os tecidos adjacentes gastrite. . S100A8 não foi expresso em todas as células de cancro gástrico e mucosa gástrica normal de
Em seguida, foi quantificado o número de células inflamatórias S100A8-positivo em cada tecido tumoral, tal como descrito anteriormente para S100A9 (arquivo adicional 1: Figura S1). Surpreendentemente, a contagem de células S100A8 em tecidos com cancro gástrico não se correlacionou com a maioria das características clínico-patológicas (arquivo adicional 2: Tabela S1) ou de sobrevivência do paciente (arquivo adicionais 3: Figura S2). Além disso, a expressão da forma heterodimerização S100A8 /A9 não foi detectada em nenhum células inflamatórias infiltrantes tecidos de cancro gástrico, enquanto algumas células positivas S100A8 /A9 foram identificados nos tecidos gastrite crónica (dados não mostrados). Estes dados indicaram que a distribuição de S100A9, S100A8 e S100A8 /A9 pode ser diferente no cancro gástrico humano e tecidos gastrites crónicas.
Para confirmar esta hipótese, foi investigada adicionalmente o padrão de localização subcelular de S100A9, S100A8 e S100A8 /A9 heterodímero expressão através da realização de coloração immunofluorecence em um tissue microarray incluindo 23 casos de câncer gástrico e 57 casos de gastrite crônica. Em tecidos de cancro gástrico, tanto S100A9 e S100A8 proteínas foram detectadas nas células inflamatórias que se infiltram no tumor (Figura 3A, B), enquanto nenhum heterodímero S100A8 /A9 foi encontrada em todos os casos (Figura 3G). Expressão de S100A8 e S100A9 parcialmente sobrepostos no citoplasma das células (Figura 3D, E). Além disso, as proteínas S100A9 e S100A8 foram detectados em células inflamatórias na gastrite crónica (Figura 3K, G). Distribuição de estas duas proteínas também parcialmente sobrepostos (Figura 3N, O). Consistente com os resultados de imuno-histoquímica, S100A8 /A9 não foi expresso em todas as células de tecidos de cancro gástrico (Figura 3G), enquanto que a expressão de S100A8 /A9, em parte sobreposto com o S100A9 em células inflamatórias de tecidos gastrite (Figura 3Q, S, T) . Sem surpresa, expressão e distribuição de S100A8 /A9 em tecidos apendicite crónicas com exacerbação (controlo positivo) foram muito semelhantes aqueles em tecidos gastrite crónica (Figura 3U, V, X, Y). Tomados em conjunto, a expressão diferencial e localização subcelular de S100A9, S100A8 e S100A8 /A9 em vários tecidos pode implicar seus papéis diferentes no câncer gástrico ou ambiente de gastrite crônica. imagens Figura 3 imunofluorescência de S100A9, S100A8 e proteínas S100A8 /A9 em lâminas de tecido microarrays que contêm tecidos de câncer gástrico (A-J) e tecidos gastrite crônica (T K-), e tecidos de apendicite crônica com exacerbação (U-Y). S100A9 e S100A8 foram detectados pelo anticorpo monoclonal, prelabeled com o Zenon Alexa Fluor rato IgG Labeling Kit (com fluorescência verde e vermelho, respectivamente). O núcleo foi corado por DAPI. heterodímeros S100A8 /A9 eram detectáveis ​​utilizando o 27E10 anticorpo específico de dímero de BMA Biomedicals prelabeled com fluorescência verde. A co-localização de S100A9 e S100A8 ou S100A8 /A9 foi mostrado em imagens fundidas (D, I, N, S, X) e as maiores imagens fundidas (E, J, S, T, Y). seta branca 3 T mostra co-localização de S100A9 e S100A8 /A9 na gastrite crônica. comprimento da barra, de 50 um.
O efeito inibidor da proteína recombinante S100A9 sobre a migração e a invasão de linhas celulares de cancro gástrico in vitro
A proteína S100A9 é expressa e segregada por células inflamatórias, que serve como um mediador em aguda e inflamação crônica. Uma vez que a contagem de células inflamatórias S100A9-positiva correlacionada com características clinicopatológicas menos agressivos, testou-se ainda mais a função inibitória directa de S100A9 recombinante sobre a migração e a invasão de células de cancro gástrico. Para avaliar a capacidade invasiva das células cancerosas gástricas, foi utilizado transpo� ensaios. Duas linhas celulares de cancro gástrico, AGS e BGC-823, foram tratadas com meio isento de soro ou meio contendo diferentes concentrações de proteína S100A9 recombinante (10, 20, 50 e 100 ng /ml, respectivamente). células invasoras foram contados em nove campos microscópicos escolhidos aleatoriamente (200 ×). Os resultados mostraram que a proteína recombinante S100A9 inibida ligeiramente AGS invasão celular (Figura 4A), enquanto S100A9 inibiu significativamente BGC-823 invasão de um modo dependente da concentração (P
< 0,05, Figura 4C). Para analisar a capacidade de migração das células cancerosas gástricas, foi realizada a ferida ensaio de cura. Ambas as linhas celulares foram tratadas com meio isento de soro ou meio contendo ml de proteína recombinante 100 ng /S100A9. Os resultados mostraram que S100A9 ligeiramente inibiu a migração de células AGS (Figura 4B), enquanto que as distâncias de migração de células de BGC-823 células tratadas com S100A9 após 24 h e 48 h de incubação foram significativamente mais baixos do que os de controlo (P
< 0,05, Figura 4D). Figura 4 Efeito da proteína recombinante S100A9 na invasão e migração de linhas celulares de cancro gástrico. No Transwell ensaio, as células AGS (A) e BGC-823 (C) foram tratadas com meio isento de soro ou meio contendo 10, 20, 50 ou 100 ng /ml de proteína recombinante S100A9. células invasoras foram contados em aleatoriamente nove campos microscópicos escolhidos (200 ×). No ensaio de cicatrização de feridas, as células AGS (B) e BGC-823 (D) foram tratados com meio ou meio RPMI-1640 isento de soro contendo ml de proteína recombinante 100 ng /S100A9. Fotos foram capturados por um microscópio de contraste de fase invertida a 0 h, 24 he 48 h após o ferimento. Foram realizados três experimentos independentes. Os resultados foram apresentados como média ± S.D. destas experiências independentes. P valor
vs. grupo
controle.
Discussão
câncer humano é uma doença crónica que se origina a partir de células transformadas que abrigam genética, bem como alterações epigenéticas. No entanto, o câncer não é composto apenas das células cancerosas. cancro do tecido contém outros tipos celulares, incluindo fibroblastos e células epiteliais, células do sistema imunológico, e as células que formam os vasos sanguíneos e vasculatura linfática [27]. Neste complexo microambiente tumoral, mediadores inflamatórios regular diferentes estágios de desenvolvimento do tumor, incluindo a iniciação, promoção, invasão e metástase [28].
S100A9, um membro da família S100, é abundante em granulócitos, monócitos e queratinócitos activados durante várias condições inflamatórias. Neste estudo, descobrimos que S100A9 foi especificamente localizados em células inflamatórias infiltrantes tecidos de câncer gástrico e tecidos gastrite crônica, enquanto todas as células cancerosas gástricas ou células adjacentes da mucosa gástrica não expressou S100A9. Nossos resultados concordam com estudos anteriores demonstrando alta expressão de S100A9 na infiltração de células imunes em vários tipos de cancro, incluindo o cancro colorectal [21] e câncer pancreático [29]. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• Identificação de alterações de metilação de DNA associados com a identificação cancer
• Caracterização de metilação relacionadas com carcinoma gástrico humano de 9 ilhas miR CPG e repressão de suas expressões in vitro e in vivo