Förekomst av S100A9-positiva inflammatoriska celler i cancervävnader korrelerar med ett tidigt stadium cancer och en bättre prognos hos patienter med magcancer

Förekomst av S100A9-positiva inflammatoriska celler i cancervävnader korrelerar med ett tidigt stadium cancer och en bättre prognos hos patienter med magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
S100A9 upptäcktes ursprungligen som en faktor som utsöndras av inflammatoriska celler. Nyligen var S100A9 befunnits vara associerad med flera humana maligniteter. Syftet med denna studie är att undersöka S100A9 uttryck i magcancer och utforska sin roll i cancerutveckling.
Metoder
S100A9 uttryck i mag vävnadsprover från 177 patienter med ventrikelcancer bedömdes genom immunhistokemi. Uttrycket av dess dimeriseringspartner S100A8 och S100A8 /A9 heterodimer bedömdes också med samma metod. Effekten av exogent S100A9 på motiliteten av gastriska cancerceller AGS och BGC-823 undersöktes därefter.
Resultat
S100A9 var specifikt uttrycks av inflammatoriska celler såsom makrofager och neutrofiler i humana gastriska cancer och gastrit vävnader. Statistisk analys visade att en cellräkning hög S100A9 (> = 200) per 200x förstoring mikroskopisk fält i cancervävnader var prediktiva för tidigt magcancer. Hög S100A9-positiva celler var negativt korrelerade med lymfkörtelmetastaser (P
= 0,009) och tumörinvasion (P
= 0,011). S100A9 identifierades som en oberoende prognostisk prediktor för total överlevnad av patienter med magsäckscancer (P
= 0,04). Patienter med högt S100A9 kroppar var med god prognos (P
= 0,021). Ytterligare undersökning visade att S100A8 fördelning i humana magcancer vävnader liknade S100A9. Däremot har antalet S100A8-positiva celler inte positivt korrelerar med patientens överlevnad. De inflammatoriska celler infiltrerar cancer var S100A8 /A9 negativt, medan de i gastrit var positiv. Dessutom exogena S100A9 protein inhiberade migration och invasion av gastric cancerceller.
Slutsatser
Våra resultat föreslog S100A9-positiva inflammatoriska celler i magcancer vävnader i samband med tidigt stadium av magcancer och god prognos.
Sökord
Magcancer S100A9 Inflammatoriska celler tumör staging Survival bakgrund
Gastric cancer är en av huvudorsakerna till dödlighet i cancer i hela världen. Totalt 989,600 nya magen cancerfall och 738,000 dödsfall beräknas ha skett under 2008, och över 70% av nya fall och dödsfall inträffar i utvecklingsländer som Kina [1]. Gastric cancer vanligen upptäcks i ett långt framskridet skede, när prognosresultat är fattiga. Nästan 70-80% av patienterna har medverkan av regionala lymfkörtlar som har ett djupgående inflytande på överlevnad [2, 3]. Därför upptäckten av nya biomarkörer medhjälp i tidig upptäckt och korrekt förutsägelse av tumör beteende skulle kunna förbättra patientöverlevnad [4-6].
Medlemmar i S100 familj av proteiner växer fram som biomarkörer i flera typer av tumörer [7]. S100 familjemedlemmen S100A9 är en 13kd protein som innehåller konserverade strukturella motiv som består av två EF-handen Ca 2 + -bindande domäner. Efter kalciumbindande, S100A9 interagerar med en annan S100 familjemedlem S100A8 att bilda den funktionella heterodimer kallas calprotektin [8, 9]. S100A9 identifierades ursprungligen som en faktor som utsöndras av inflammatoriska celler såsom neutrofiler och makrofager i reumatoid artrit, inflammatorisk tarmsjukdom och andra inflammatoriska sjukdomar [10-14]. S100A9, S100A8, liksom S100A8 /A9 heterodimer calprotektin är överuttryckt vid inflammation-inducerad cancer [15]. S100A9 expression är uppreglerad i tumörceller i lunga [16], prostata [17], och bröstcancer [18, 19], medan det nedregleras i humana esofagus cancerceller [20]. I kolorektal cancer vävnadsprover, dock S100A9 proteinet detekterades inte i cancerceller, utan snarare i inflammatoriska celler utspridda i tumörstroma [21]. Dessutom S100A9 var signifikant högre i avföringsprover av kolorektala cancerpatienter än i kontrollgruppen [22]. I magcancer, genuttryck och proteomik analys visade hög expression av S100A9 i vävnaden. [23, 24]. Men dess fördelning i vävnaden och tillsammans med kliniskt patologiska drag var inte fullständigt klar.
I denna studie använde vi genuttryck analys för att jämföra S100A9 uttryck i magcancer vävnader och i angränsande, till synes normala vävnader. Immunohistokemisk färgning avslöjade S100A9 i tumörassocierade inflammatoriska celler. Dessutom riktar vi sambandet mellan antalet S100A9-positiva celler i tumörvävnad och kliniskt patologiska funktioner. Vi tog också samlokalisering av S100A9 och S100A8 samt lokalisering av dimer calprotektin genom immunofluorescens. Slutligen, för att få insikt i funktion S100A9 i cancerceller, undersökte vi effekten av det rekombinanta S100A9 proteinet om migration och invasion av gastric cancerceller AGS och BGC-823.
Metoder
Patienter och vävnadsprover
Denna undersökning genomfördes efter godkännande av etiska kommittén i Peking University Cancer Hospital. Informerat samtycke erhölls från varje patient. Hundra sjuttiosex patienter med magcancer studerades. 124 män och 53 kvinnor (medelålder, 57 år, intervall 26-80 år) hade diagnosen och opereras i Peking University Cancer Hospital mellan 1998 och 2004. djup tumörinvasion, histologiska grad, lymfkörtel metastas, levermetastaser, och vaskulär invasion erhölls från kliniska och histopatologiska rapporter. Stadium av magcancer klassificerades enligt den 7: e upplagan tumör nod metastasering (TNM) klassificering som rekommenderas av den amerikanska kommittén för cancer. Ingen av patienterna fick kemoterapi eller strålbehandling preoperativt. Alla patienter följdes upp till januari 2010. Efter gastrektomi, var en del av utskurna prov fixerades i 10% formalin och bearbetas rutinmässigt för patologisk bedömning och en annan var snabbfrystes i flytande kväve förvaras vid -80 ° C för RNA-extraktion. Dessutom har 30 matchade metastaserande lymfkörtlar också samlats in från dessa patienter. Tio fall av kronisk appendicit vävnader med exacerbation lämnades av Institutionen för allmän kirurgi, var det anslutna sjukhuset i Qingdao University Medical College.
Immunohistokemi (IHC) Review fyra mikrometer sektioner från formalinfixerade paraffininbäddade vävnader monterade på poly-L-lysin-belagda objektglas och sedan avparaffinerades i xylen och rehydratiserades genom alkohol till destillerat vatten. Endogen peroxidasaktivitet blockerades med 3% väteperoxid under 15 minuter vid rumstemperatur. Efter tryckkokning objektglasen i 10 mmol /L EDTA (pH 8,0) under 3 minuter, inkuberades sektionerna med 5% getserum och inkuberades sedan över natten vid 4 ° C med mus-anti-S100A9 antikropp (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Schweiz), eller mus-anti-S100A8 antikropp (1: 200, T1031, BMA Biomedicals), eller mus-anti-S100A8 /A9-antikropp (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Primära antikroppar detekterades med användning av en två-stegs EnVision System (Dako, Glostrup, Danmark). Pepparrotsperoxidas och diaminobenzedene hydroklorid (DAB) var enzymet och kromogen användes. Expression av S100A9, S100A8 och S100A8 /A9 detekterades också i Cybrdi vävnad microarray slides (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, Kina) innehållande kronisk gastrit med metaplasi (57 fall) och magcancer vävnader (23 fall). Tio fall av kronisk appendicit prover med exacerbation var tjänstgjorde som positiv kontroll för S100A8 /A9.
IHC bedömning och cut-off definition
S100A9 och S100A8 färgades i inflammatoriska celler såsom makrofager och neutrofiler infiltrerar tumörvävnad. Positiva celler visade en varierande grad av cytoplasmisk färgning. Bilder förvärvades med användning av ARIOL bildanalyssystem (Applied Imaging, San José, CA, USA). Skannern är baserad på ett Olympus BX61 mikroskop med en motoriserad skede och autofokus kapacitet som är utrustade med en kamera. Glasen skannas på 200 gångers förstoring. Graden av monoklonala S100A9 eller S100A8 antikroppsreaktivitet i varje avsnitt vävnad fastställdes genom räkning av antalet färgade inflammatoriska celler i tre 200 gångers förstoring scope. Detta genomfördes av två oberoende patologer med hjälp av en automatisk mikroskopsystem och bildbehandlingsprogrammet (se Ytterligare fil 1: Figur S1). Cut-off värdet på S100A9 färgade inflammatoriska celler för att förutsäga patientens patologiska skede bestämdes genom Receiver Operating Characteristic (ROC) kurvan.
Laser konfokal skanning
att undersöka samlokalisering av S100A9 och dess dimerise partner S100A8, eller heterodimeren S100A8 /A9, de Cybrdi vävnadsmicroarray slides (IC00-01-001) inkuberades 1,5 timmar vid rumstemperatur med mus-anti-S100A9 antikropp (1: 200) för-märkt med Zenon Alexa Fluor 647 mus-IgG Labeling Kit (Z-25008, röd fluorescens), och antingen anti-S100A8 antikropp (1: 200) eller anti-S100A8 /A9-antikropp (1: 200) för-märkt med Zenon Alexa Fluor 488 Mus-IgG Labeling Kit (Z-25002 , grön fluorescens). Konfokala bilder förvärvades med hjälp av Leica TCS SP5 konfokalmikroskop (Leica, Mannheim, Tyskland). . Dessutom har kärnorna motfärgades med DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA), excitation vid 358 Exemplar av kronisk appendicit vävnader med exacerbation nm
odlades med anti-S100A9 antikropp (1: 200, röd fluorescens märkt), och anti-S100A8 /A9-antikropp. (1: 200, grön fluorescens märkt) som en positiv kontroll för det specifika S100A8 /A9 heterodimer expression
Cellodling
Båda cellinjerna i denna studie har tidigare profilerat av microarray analys och regelbundet kontrolleras med hjälp av STR-analys (kort tandemupprepnings DNA-fingeravtryck) [25]. Magcancer cellinje AGS erhölls från ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) och cellinje BGC-823 etablerades i Kina och som erhållits från Cell Research Institute, Shanghai, Kina. Cancerceller odlades rutinmässigt som ett monoskikt i RPMI-1640-medium (GIBCO BRL, Carlsbad, CA), kompletterat med 10% (volym /volym) fetalt kalvserum (FCS, GIBCO) och antibiotika vid 37 ° C i en fuktad 5% CO 2 atmosfär.
Cell invasionsanalys
CytoSelect 24-Well Cell invasion analys kit köptes från Cell Biolabs, USA. S100A9 rekombinant protein köptes från BMA Biomedicals, Schweiz. Cellinvasion utfördes med Transwell skär, vilket tillåter celler att migrera genom en 8 pm porstorlek polykarbonatmembran. Den övre ytan av insatsen membranet belades med ett enhetligt skikt av torkad basalmembranmatrislösningen. Celler återsuspenderades i serumfritt medium ströks ut i den övre kammaren i varje Transwell vid en densitet av 10 6 celler /ml (200 pl /kammar). S100A9 rekombinant protein tillsattes till den övre kammaren medium vid 0, 10, 20, 50, eller 100 ng /ml. Bottenkammaren fylldes med 500

• Identifiering av DNA-metylering förändringar i samband med mänsklig gastric cancer
• Karakterisering av humant gastric carcinoma relaterade metylering av 9 miR CpG-öar och förtryck av deras uttryck in vitro och in vivo