Prisutnost upalnih stanica S100A9-pozitivne u tkivu raka korelira s rani stadij raka i bolju prognozu u bolesnika s karcinomom želuca

Prisutnost S100A9-pozitivnih upalnih stanica u tkivima raka korelira s rani stadij raka i bolju prognozu u bolesnika s karcinomom želuca
apstraktne pregled pozadine pregled S100A9 izvorno otkrio kao faktor luče upalne stanice. Nedavno, S100A9 je utvrđeno da je povezan s nekoliko ljudskih zloćudnih bolesti. Svrha ovog istraživanja bila je istražiti S100A9 izraz u rak želuca i istraživati ​​svoju ulogu u progresiji karcinoma. Pregled Metode
S100A9 izražavanja u uzorcima iz 177 pacijenata s rakom želuca želučanog tkiva procijenjena je imunohistokemijski. Ekspresija njegovog partnera dimerizacije S100A8 i S100A8 /A9 heterodimera također su ocijenjeni istim postupkom. Zatim je ispitivan je učinak egzogenog S100A9 na motiliteta želuca stanica raka AGS i BGC-823. pregled Rezultati
S100A9 posebno izražena upalne stanice kao što su makrofagi i neutrofila u ljudskim karcinoma i gastritisa tkivu želuca. Statistička analiza je pokazala da je broj visoko S100A9 stanica (> = 200) po 200x uvećanja mikroskopskom polju u tkivu raka, bila je predvidivih ranom stadiju raka želuca. Visoki broj stanica S100A9 pozitivnim je u negativnoj korelaciji s limfnih čvorova metastaza (P pregled = 0,009) i tumorske invazije (P
= 0,011). S100A9 je identificiran kao samostalni prognostički prediktor ukupnog preživljavanja bolesnika s rakom želuca (P
= 0,04). Bolesnici s count visoka S100A9 stanica bili uz povoljnu prognozu (P
= 0,021). Daljnja istraživanja su otkrili da S100A8 distribucija u tkivima čovjeka s rakom želuca bila je slična S100A9. Međutim, broj S100A8-pozitivnih stanica nije pozitivno korelira s preživljavanje pacijenta. Upalne stanice infiltriranih raka su S100A8 /A9 negativni, dok su oni u gastritis bili pozitivni. Osim toga, egzogeni S100A9 protein inhibira migraciju i invaziju želučanih stanica raka. Pregled Zaključci
Naši rezultati sugeriraju S100A9 pozitivne upalne stanice u želučanog tkiva raka povezane su s ranom stadiju raka želuca i dobru prognozu.
Ključne riječi
rak želuca S100A9 Upalne stanice tumora uprizorenja opstanak pozadini pregled, rak želuca je jedan od vodećih uzroka smrtnosti od raka u svijetu. Ukupno 989,600 novih slučajeva raka želuca i 738,000 smrtnih slučajeva procijenjeno je da su se pojavili 2008. godine, a više od 70% novih slučajeva i smrtnih slučajeva javlja se u zemljama u razvoju, poput Kine. [1] Rak želuca obično se otkrije u uznapredovalom stadiju, kada je prognostički ishod su siromašni. Gotovo 70-80% bolesnika ima uključenost regionalnih limfnih čvorova koji ima dubok utjecaj na preživljavanje [2, 3]. Stoga, otkriće novih biomarkera pomaganje u ranom otkrivanju i točno predviđanje ponašanja tumora može poboljšati preživljavanje pacijenata [4-6].
Članovi obitelji S100 proteina u nastajanju kao biomarkera u više vrsta tumora [7]. Član S100 obitelji S100A9 je 13kd protein koji sadrži očuvanog strukturnih motiva se sastoji od dva EF-ruke Ca 2 + -vezujući domena. Nakon vezanja kalcija, S100A9 interakciju s drugom S100 član obitelji S100A8 formirati funkcionalne heterodimera zove calprotectin [8, 9]. S100A9 izvorno je identificirana kao faktor luče upalne stanice kao što su neutrofili i makrofagi kod reumatoidnog artritisa, upalne bolesti crijeva, i drugih upalnih bolesti [10-14]. S100A9, S100A8, kao i S100A8 /A9 heterodimer calprotectin, prekomjerno tijekom upale induciran karcinogeneze [15]. S100A9 ekspresija doregulirana u tumorskim stanicama u plućima [16], prostate [17] i rak dojke [18, 19], dok je podregulirao ljudskih stanica raka jednjaka [20]. U kolorektalnim uzoraka raka tkiva, međutim, S100A9 protein nije otkriven u stanicama raka, nego u upalnim stanicama razasutih tumora strome [21]. Osim toga, S100A9 bila je značajno veća u uzorcima stolice bolesnika s kolorektalnim karcinomom u odnosu na kontrolnu [22]. U karcinomu želuca, ekspresiju gena i proteomskog analiza je pokazala jaku ekspresiju S100A9 u tkivu. [23, 24]. Međutim, njihova raspodjela unutar tkiva i povezanosti s kliničkopatološkim značajke nisu u potpunosti pokazao.
U ovom istraživanju koristili smo gensku analizu ekspresije usporediti ekspresiju S100A9 u želučanim tkiva raka i susjednih, navodno normalnog tkiva. Imunokemijsko bojenje je otkrio S100A9 u upalnim stanicama s tumorom. Osim toga, obratio mi korelaciju između broja S100A9-pozitivnih stanica u tumorskim tkivima i kliničkopatološkim značajke. Također, osvrnuo na suradnju lokalizaciju S100A9 i S100A8 kao i lokalizaciju dimera calprotectin po imunofluorescencije. Konačno, da dobije uvid u funkciji S100A9 u stanicama raka, istražili smo učinak rekombinantnog S100A9 proteina na migracije i invazije želučanih stanica raka AGS i BGC-823.
Metode pregled bolesnika i uzorke tkiva
Ovo istraživanje je provedeno nakon odobrenja Etičkog komiteta Peking University Cancer Hospital. Informirani pristanak dobiven je od svakog pacijenta. ispitivani su Stotinu sedamdeset i šest pacijenata s rakom želuca. 124 muških i 53 ženskih (srednja dob 57 godina, raspon, 26-80 godina) su dijagnosticira i kirurški liječiti u Pekingu University Cancer Hospital između 1998. i 2004. godine na dubini od tumorske invazije, histološkog stupnja, limfnih čvorova metastaze, metastaze jetre, i vaskularna invazija dobiveni su iz kliničke i patohistološke izvješća. Stadij raka želuca je klasificirati prema 7. izdanje tumorski čvor metastaza (TNM) klasifikacije preporučene od strane Odbora za američku protiv raka. Nijedan od pacijenata primili kemoterapiju ili radijacijsku terapiju postoperativno. Svi bolesnici su praćeni do siječnja 2010. Nakon gastrektomije, jedan dio reseciranih uzorka bio je fiksiran u 10% formalinu i obrađuju rutinski za patološku procjenu, a drugi je bio smrznuti u tekućem dušiku pohranjeni na -80 ° C za ekstrakciju RNA. Osim toga, 30 podudarne metastatski limfni čvorovi su također prikupljeni iz tih bolesnika. Deset slučajeva kroničnih upala slijepog crijeva tkiva s pogoršanjem nabavljeni su od Odjela za opću kirurgiju, povezanih u bolnici Sveučilišta Qingdao Medical College. Pregled Imunohistokem (IHC) pregled, četiri mjernih sekcije formalinom fiksne parafin-ugrađen tkiva su montirane na poli-l-lizin-obložene stakalca i deparafmizirani u ksilenu i rehidrirane alkohola destilirane vode. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana s 3% -tnim vodikovim peroksidom na 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon pritiska kuhanje preparata u 10 mmol /L EDTA (pH 8,0) tijekom 3 minute, sekcije su inkubirane s 5% kozjim serumom, inkubirani preko noći na 4 ° C s mišjim anti-S100A9 protutijelom (1: 200, T1028, BMA Biomedicals, Švicarska), ili miš anti-S100A8 antitijela (1: 200, T1031, BMA Biomedicals) ili miš anti-S100A8 /A9 antitijela (1: 200, T1023, BMA Biomedicals). Primarni antitijela su detektirana pomoću dva koraka isplanirati sustavom (Dako, Glostrup, Danska). Peroksidaza i diaminobenzedene hidroklorid (DAB) su enzima i kromogena zaposleni. Izražavanje S100A9, S100A8 i S100A8 /A9 detektirani su Cybrdi microarray tkiva slajdova (IC00-01-001, Cybrdi, Xi'an, Kina) koji sadrži kronični gastritis s metaplazije (57 slučajeva) i želučanog tkiva karcinoma (23 slučajeva). Deset slučajeva kroničnih upala slijepog crijeva uzoraka s pogoršanjem su služili kao pozitivna kontrola za S100A8 /A9.
Procjenu IHC i cut-off definicija pregled S100A9 i S100A8 su obojeni u upalnim stanicama kao što su makrofagi i neutrofila koji infiltriraju tumorskih tkiva. Pozitivne stanice pokazuju promjenjivu stupanj citoplazmatski bojenja. Slike su skupljene pomoću Ariol analiza slike sustava (Applied Imaging, San Jose, CA, USA). Skener se temelji na Olympus BX61 mikroskopom s motoriziranim stolićem i autofokus sposobnosti opremljenih kamerom. Slajdovi su skenirani na 200 × uvećanja. Stupanj monoklonskih S100A9 ili S100A8 antitijela reaktivnosti u svakom dijelu tkiva je procijenjena brojanjem obojenih upalnih stanica u tri povećanje 200 puta opsega. To je provedeno od strane dva neovisna patologa uz pomoć automatskog sustava mikroskopom i softver za obradu slike (vidjeti dodatne datoteke 1: Slika S1). Cut-off vrijednost S100A9 obojeni upalne stanice za predviđanje pacijenta patološke faze određen je prijemnik karakteristične (ROC) krivulja. Pregled Laser konfokalnog skeniranje pregled, da istraži ko-lokalizaciju S100A9 i njegova dimerizacije partnera S100A8, ili heterodimer S100A8 /A9, a Cybrdi microarray tkiva na predmetnim stakalcima (IC00-01-001) su inkubirani 1,5 sata na sobnoj temperaturi s mišjim anti-S100A9 antitijela (1: 200), prethodno označen s Zenon Alexa Fluor 647 miš IgG Labeling Kit (Z 25.008 crvena fluorescencija), a svaki od anti-S100A8 antitijela (1: 200) ili anti-S100A8 /A9 antitijela (1: 200), prethodno označen s Zenon Alexa Fluor 488 miš IgG Labeling Kit (Z 25.002 , zeleni fluorescentni). Konfokalnom slike su stečene pomoću Leica TCS SP5 konfokalnog mikroskopa (Leica, Mannheim, Njemačka). . Osim toga, jezgre negativno DAPI (Vector, Burlingame, CA, USA), pobuda pri 358 nm pregled Uzorci kroničnih upala slijepog crijeva tkiva s pogoršanjem inkubirani s anti-S100A9 protutijelom (1: 200, crvena fluorescentnom oznakom), i anti-S100A8 /A9 antitijela. (1: 200, zeleni fluorescentni označen) kao pozitivna kontrola za određeni S100A8 /A9 ekspresije heterodimera kultura pregled Cell pregled obje stanične linije u ovoj studiji su prethodno profilirati analize mikropolja i redovito se provjeravaju korištenjem STR analizu (kratka tandem repeat DNA otisaka prstiju) [25]. Rak želuca stanična linija AGS dobiven je iz ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), a stanične linije BGC-823 je osnovana u Kini, a dobiveni od Cell Research Institute, Šangaju, Kina. Stanice raka su rutinski uzgajane u monosloju u RPMI-1640 mediju (Gibco BRL, Carlsbad, CA), uz dodatak 10% (v /v) fetalnog telećeg seruma (FCS, GIBCO) i antibiotici, na 37 ° C u vlažnoj 5% CO 2 atmosferu. test pregled Cell invazija pregled CytoSelect 24 Pa Cell test invazije kit je kupljen od Cell Biolabs, SAD-u. S100A9 rekombinantni protein je kupljen od BMA Biomedicals, Švicarska. Invazije stanice testovi provedeni su s transjažičnim umetke, koji omogućuje stanicama da migriraju kroz 8 um veličine pora polikarbonatne membrane. Gornja površina umetka membrane je obložena sa uniformnim slojem osuši bazalne membrane otopine matriksa. Stanice suspendirane u mediju bez seruma se zatim smjeste u gornju komoru svake transjažice pri gustoći od 10 6 stanica /mL (200 uL /​​komora). S100A9 rekombinantni protein se doda u medij gornje komore u 0, 10, 20, 50 ili 100 ng /ml. Dno komora je ispunjena 500 ul medija koji je sadržavao 10% FCS. Stanice su ostavljene da migriraju tijekom 48 sati na 37 ° C. Stanice koje su ostale u gornjoj komori su uklonjene pamučnom krpom, a stanice koje su prodrle na donjoj strani membrane obojene su u stanične Stain Rješenje tijekom 15 minuta, a radioaktivnost u devet slučajno odabranih mikroskopskih polja (200 ×) po jažici , Svaki umetak se zatim prenese u praznu udubinu i inkubirano u 200 ul od ekstrakciju. Nakon 10 minuta, 100 ul otopine od svakog uzorka se prenesu u mikrotitarske pločice s 96 jamica i izmjeren je na čitaču pločica pri OD560nm. Test migracije pregled Cell pregled pokretljivost stanica je ocijenjena pomoću zacjeljivanja testa. Stanice su nanesene u posude za kulturu tkiva sa šest jažica, uzgojene do konfluencije dobiti staničnog, koji je zatim ranjeno korištenjem sterilnih pipeta s 200 ul savjeta. Svaki stanični debris uklonjen ispiranjem s PBS. Ranjeni monosloj stanica je zatim inkubiran u mediju sa 100 ng /ml S100A9 rekombinantnog proteina. Kontrolne stanice su obrađene s RPMI-1640 medij. Time-lapse fotografije su snimljene obrnuti faznokontrastne mikroskopa na 200 × uvećanja za 0, 24 i 48 sati. Migracija stanica sposobnost ocijenjena je izračunavanjem prosječne udaljenosti migraciju stanica.
Statistička analiza pregled kliničko varijable su iz kliničke i patohistološke izvješća. ROC krivulje su korišteni u određivanju graničnu vrijednost od upalnog broja stanica S100A9-pozitivne u procjeni patološki TNM stadij. Udruga S100A9-pozitivne upalne broja stanica s različitim stupnjevima TNM je učinjeno sa Wilcoxon rank sum test. Da bi se dobila povezanost između S100A9 ili S100A8 broja stanica i kliničko varijabli, podaci su bili unakrsno tabelarno i χ pregled 2 test izveden. Kumulativno preživljavanje je procijenjena sa Kaplan-Meier metodi, a usporedbe između skupina su učinili s log-rank testa. Sveukupno preživljenje mjeri na datum inicijalne operacije do dana smrti, računajući smrt od bilo kojeg uzroka, kao krajnje točke, odnosno posljednjeg dana informacijama kao krajnje točke, ako nema događaj je dokumentirano. Multivarijantna analiza Cox proporcionalnih rizika modelu regresije (unatrag, stepenasto) je stvoren za procjenu utjecaja svake varijable na preživljavanje. Značaj postavljena je na P Netlogu < 0,05.

• Identifikacija metilacije DNA promjena povezanih s ljudskom želuca cancer
• Karakterizacija ljudskog metilacije želučanog karcinoma povezanih s 9 miR CpG otoka i represiju njihovih izraza in vitro i in vivo