PLoS ONE: Удобный модель Серьёзный, высокий уровень заболеваемости аутоиммунный гастрит Вызванный Polyclonal эффекторных Т-клеток и без Возмущение регуляторных Т-клеток

Абстрактный
<р> Аутоиммунные результаты гастрит от пробоя толерантности Т-клеток к желудочной H + /K + АТФазы. Желудочный Н + /К + АТФазы отвечает за закисление желудочного сока и состоит из -субъединицы (Н /Ка) и бета-субъединицы (H /Kβ). Здесь показано, что CD4 + Т-клеток из Н /Ка-дефицитных мышей (Н /Ка - /-) высоко патогенны и аутоиммунный гастрит может быть вызван в сублетально облучали мышей дикого типа приемными передачи нефракционированного CD4 + Т-клетки из Н /Ка - /- мышей. Все мыши получателей последовательно развиваются наиболее тяжелая форма аутоиммунного гастрита 8 недель после передачи, показывая гипертрофию слизистой оболочки желудка, полное истощение теменной и ферментативного клеток, а также наличие аутоантител к H + /K + АТФазу в сыворотке крови. Кроме того, мы показали, что болезнь значительно влияет вес желудка и рН желудка мышей-реципиентов. Истощение париетальных клеток в этой модели болезни требуется наличие обоих H /Ка и H /Kβ поскольку передача Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки не приводит к истощению париетальных клеток в Н /Мыши-реципиенты - Ка - /- Н /Kβ или - /. Консистенция тяжести заболевания, применение поликлональных Т-клеток и специфический ответ Т-клеток к аутоантигену желудка делают это идеальной моделью болезни для изучения многих аспектов органоспецифической аутоиммунитета, включая профилактику и лечение заболевания.
<р> Образец цитирования: Ту Е, Ang DKY, Hogan телевидение, Чтение S, Чиа CPZ, Глисон ПА и др. (2011) Удобный Модель Серьёзный, высокий уровень заболеваемости аутоиммунный гастрит Вызванный Polyclonal эффекторных Т-клеток и без Возмущение регуляторных Т-клеток. PLoS ONE 6 (11): e27153. DOI: 10.1371 /journal.pone.0027153
<р> Редактор: Сириако А. Piccirillo, Университет МакГилл Центр здоровья, Канада
<р> Поступило: 21 января 2011 года; Принято: 11 октября 2011 года; Опубликовано: 9 ноября, 2011
<р> Copyright: © 2011 Ту и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была поддержана исследовательских грантов от Национального медицинского исследовательского совета Австралии здравоохранения и и университета Мельбурна. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи

Конкурирующие интересы:. Авторы могут подтвердить, что Саймон Read был в Университете Мельбурна, когда это исследование было завершена и что Ново Нордиск является его текущий адрес. Авторы заявили, не существует никаких конкурирующих интересов.

Введение
<р> аутоиммунный гастрит является отличной системой для исследования потери толерантности Т-клеток к самообороне в тканях, так как это хорошо характеризуется аутоиммунным заболеванием с известный антиген-мишень и модель мыши заболевания имеет много общего с человеческим эквивалентом. Пагубная анемия, конечная стадия аутоиммунного гастрита, по оценкам, распространенность 1,9% в Западной взрослого населения в возрасте старше 60 лет [1], которая представляет наиболее частой причиной витамина B <суб> 12 дефицита у пожилых людей [2] , Аутоиммунный гастрит особенности инфильтрации мононуклеарных клеток в подслизистой, которая проходит в слизистую оболочку желудка, истощение желудка теменной и ферментативного клеток и гипертрофией слизистой оболочки желудка [1].
<Р> антиген-мишень в аутоиммунного гастрита был идентифицирован как желудочной H + /K + АТФазы выражается париетальных клеток желудка [3] - [5]. Желудочный Н + /К + АТФазы является мембраной протонного насоса отвечает за закисление желудочного сока, и это представляет собой гетеродимер, который состоит из каталитической субъединицы (Н /Ка) и гликопротеин -субъединицы (Н /Kβ). Предыдущие исследования показали, что оба представляют собой Н /Н и Ка /Kβ ориентированы в аутоиммунного гастрита [4], [6] - [8]. Это хорошо документирована, что в обоих мышей и человека, CD4 + Т-клетки, которые распознают желудка H + /K + АТФазы инициирует аутоиммунный гастрит в то время как CD8 + Т-клетки и В-клетки неэффективным при этом [7] - [17]. Тем не менее, после начала заболевания, аутоантител к H + /K + АТФазы производятся и очень полезный диагностический инструмент заболевания, хотя они не являются патогенными [3], [16], [18 ].
<р> BALB /с мышей было показано, что наиболее восприимчивы к лимфопения индуцированных аутоиммунного гастрита с частотой 30-90% [19], [20]. Заболевание может быть вызвано тимэктомированных 3-дневных мышей или взрослых тимэктомированных в сочетании с одной дозой циклофосфамида [19], [21]. Несмотря на это, трудно оценить терапевтические эффекты лечения, данных thymectomised мышей, поскольку спектр тяжести заболевания от легкой до тяжелой всегда наблюдается и частота является переменной, таким образом, большие размеры групп необходимы для проверки статистической значимости. Кроме того, операция участвует и послеоперационное содержание животных является технически требовательным. Аутоиммунный гастрит также может быть вызван в BALB /с мышей путем иммунизации с очищенным желудочной H + /K + АТФазы [5]. Тем не менее, эта болезнь носит обратимый характер после прекращения иммунизации и имеет низкую степень тяжести. Передача BALB /с Т-клеток истощенных регуляторных T (Treg) клеток в бестимусных мышей-реципиентов вызывает сильную аутоиммунный гастрит [15]. Поэтому невозможно расчленить связь между аутореактивных Т-клеток и клеток Treg во время развития болезни в этой установке, так как Treg клетки отсутствуют
. <Р> Высокая частота спонтанных аутоиммунного гастрита наблюдается у трансгенных мышей, экспрессирующих специфический ТКР для Н /Ка [8]. Тем не менее, эти мыши не представляют собой идеальную модель болезни для всех экспериментов, поскольку моноклональное характер патогенных Т-клеток не перепросматривать поликлональных ответ, что происходит в патофизиологических условиях.
<Р> С этой точки зрения, мы разработали модель болезни которая основывалась на передаче поликлональные Т-клеток из /Ка-дефицитных (Н /Ка - /-) мышей H в сублетально-облученных мышей дикого типа. Мы показали, что у мышей, которые получали нефракционированный Т-клетки из Н /Ка - /- мыши все поддались наиболее тяжелой аутоиммунной гастрита с патологическими изменениями, наблюдаемыми в течение всего желудка. Кроме того, эти патологические изменения существенно повлияли на физиологию желудка. Мы продемонстрировали полезность этой модели, показав, что развитие аутоиммунного гастрита в этой модели строго зависит от присутствия обоих H + /К + АТФазы а и р субъединиц.

Результаты

Повышенные T и B-клеточный ответ в Н /Ка ^{- /- мышей после иммунизации H + /K + АТФазы}

для того чтобы иметь систему что подходит для изучения различных аспектов аутоиммунитета, мы создали модель заболевания, при котором заболевание вызвано патогенными поликлональных т-клеток, а также тяжесть заболевания последовательно тяжелой. Ответ Т-клеток к Н /Ка требуется для начала аутоиммунного гастрита и может быть основным источником желудочных аутореактивных эпитопов [7], [8], [22]. Как толерантности Т-клеток к Н /Ка вряд ли произойдет в Н /Ка ^{- /- мышей, мы исследовали, если Т-клетки, которые были специфическими для H + /K + АТФазы и способных вызвать гастрит присутствовали в Н /Ка - /-. мышей
<р> для того, чтобы определить, есть ли там были повышенные иммунные реакции Н + /K + АТФазы в Н /Ка - /- мышей относительно мышей дикого типа мышей иммунизировали дважды с очищенным желудочной H + /K + АТФазы. После иммунизации, аутоантитела, специфичные для H + /K + АТФазы были обнаружены в иммунизированных Н /<Ка SUP> - /- мышей, но не у мышей дикого типа (Рис. 1А) Т-клеточный ответ на в пробирке
рестимуляции с H + /K + АТФазы была также значительно выше в Н /<Ка SUP> - /- мышей, чем у мышей дикого типа (Рисунок 1В). Поэтому, как было показано ранее в Н /Kβ - /- мышей [23], есть также значительное Т и В-клеточный ответ Н + /K + АТФазы в Н /Ка - /-. мышей, что нет мышей дикого типа}

CD4 ^{+ Т-клетки из Н /Ка - /- мыши были высоко патогенного
<р> Для того, чтобы определить, является ли адоптивный перенос Т-клеток из Н /Ка - /- мышей, могли бы привести к аутоиммунным гастритом, мы обогащенные CD4 + Т-клеток либо из Н /Ка - /- или мышей дикого типа до ~ 85 % чистоты и переносили 5 × 10 7 из этих клеток в сублетально облученных мышей дикого типа. Так как это было ранее показано, что H + /K + АТФазы-специфических CD4 + Т-клетки были быстро удалены на периферии и не могут вызывать аутоиммунные гастриты в необлученных мышей дикого типа [24], все мыши-реципиенты, использованные в этом исследовании, были слегка облучали при 600 радах для повышения выживаемости переданных Т-клеток из Н /Ка - /-. мышей
<р> Через восемь недель после передачи, мышей, которые получали Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки все развитые самые тяжелые формы аутоиммунного гастрита (оценка 5 и 6). Это было продемонстрировано полное истощение париетальных клеток и ферментативного клеток и гипертрофией слизистой оболочки желудка (Фигура 2А, 2В). В противоположность этому, у мышей, которые получали дикого типа CD4 + Т-клетки были полностью свободны от гастрита (Фигура 2А, 2В), который показал, что аутоиммунный гастрит у мышей, получавших Н /Ка - /- CD4 + Т-клеток не было вызвано облучением сами по себе
, а скорее, клеточный инокулят T.
<р> Патологические изменения в желудке мышей, относящийся к гастриту значительно влияет на их желудка физиологии. Гипертрофия слизистой оболочки желудка приводит к расширению морщинками желудка (фиг.2с) и увеличение веса желудка (рис 2D). Во-вторых, истощение париетальных клеток вызывало повышение рН желудка из-за отсутствия секреции кислоты (рис 2E). Кроме того, аутоантитела, специфичные для желудка H + /K + АТФазы можно обнаружить во всех относящийся к гастриту мышей (рис 2F). Аутоантитела достигли высоких уровней у всех мышей через 6 недель после переноса (рис 2G). В совокупности эти результаты показали наличие высоко патогенного H + /K + АТФазы-специфические Т-клетки в Н /Ка - /-. Мышей}

аутоиммунный гастрит был вызван CD4 ^{+ Т-клеток опосредованной воспаление
<р> Мыши с аутоиммунным гастритом, вызванной передачей Н /<Ка SUP> - /- CD4 + Т-клетки имели значительно больше клеток в желудке осушение paragastric лимфы узлы по сравнению с нормальными мышами и мышей, получавших CD4 + Т-клеток от доноров дикого типа. В отличие от этого, не было никакой разницы в размерах паховых лимфатических узлов между относящийся к гастриту и не относящийся к гастриту мышей (фиг.3А). Это позволило предположить, что увеличение ячеистости paragastric лимфатических узлов в относящийся к гастриту мышей была вызвана местное воспаление желудка и не льготными выживания или расширения Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки по сравнению с диким типом CD4 + Т-клетки после передачи
<р> В этих экспериментах клетки от донора Н /<Ка SUP> -. /- или мышей дикого типа могут быть дифференцированы от клеток реципиента, потому что они несут разные аллели CD90. Донором население в paragastric лимфатических узлов мышей, получавших Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки имели значительно больше CD4 + Т-клеток с фенотипом эффектор /памяти (CD44 hiCD62 ло) по сравнению с мышами, которые получали дикого типа CD4 + Т-клеток. Тем не менее, уровни эффектор /Т-клетки памяти были сходными в не дренирующего лимфатического узла (рис 3B). Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что развитие аутоиммунного гастрита у мышей, которые получили CD4 + Т-клеток из Н /Ка - /- мышей была вызвана клеточно-опосредованной воспалительной реакции Т в желудочной среде, а не более обобщенный ответ.
<р> развитие аутоиммунного гастрита в этой модели заболевания не было связано со снижением уровня регуляторных Т (Treg) клеток, так как относящийся к гастриту мышей содержат сходные пропорции клеток Treg в paragastric лимфатических узлов по сравнению с не -gastritic управления (рис 4A, 4B). На самом деле, значительно больше клеток Treg были обнаружены в желудке мышей с аутоиммунным гастритом (рис 4A, 4C)}

Н /Ка ^{-. /- CD4 + Т-клетки быстро индуцированное повреждение тканей в желудке
<р> тяжесть аутоиммунного гастрита анализировали в различные моменты времени после передачи Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки. Умеренный истощение париетальных клеток и ферментативного клеток, как указано гастрита счетом 4 [24], можно было наблюдать уже через 2 недели после передачи, и болезнь быстро прогрессировала с большинства мышей симптомами острого гастрита, как показал гастрит оценка 5 и 6, через 4 недели после передачи (рисунок 5).}

вес Желудок может быть использован в качестве количественной меры аутоиммунный гастрит
<р> Мы показали, что у мышей с аутоиммунным гастритом имели больший вес, чем желудок незараженных мышей из-за гипертрофии слизистой оболочки желудка (рис 2D). Таким образом, мы исследовали, если вес желудка может быть использован в качестве количественной меры для тяжести аутоиммунного гастрита. Для дальнейшей проверки, если вес желудка может дифференцироваться среди различных степеней тяжести аутоиммунного гастрита, мы исследовали неонатально-thymectomised мышей, как можно было бы получить большее число мышей с переменными оценки заболевания. Мы обнаружили, что существуют значительные различия в средней массе тела желудка между каждой из первых пяти уровней аутоиммунный гастрит (счет 0-4) (рисунок 6). Однако средние веса желудка гастрита баллов 4, 5 и 6 существенно не отличались друг от друга (рис 6). Это, вероятно, связано с тем, что степень гипертрофии слизистой оболочки желудка не увеличивается по мере прогрессирования заболевания на поздних стадиях

Индукционная аутоиммунного гастрита Н /Ка ^{-. /- CD4 + Т-клеток зависит от присутствия H /H и Ка /Kβ
<р> Мы предположили, что патогенность CD4 + T-клетки из Н /<Ка SUP> - /- мышей было вызвано отсутствие толерантности к Н /Ка при отсутствии этого желудка аутоантигенов. Чтобы проверить это, CD4 + Т-клетки были переведены из Н /Ка - /- мышей в сублетально-облученной Н /<Ка SUP> - /- и мышей дикого типа. Было показано, что Н /Ка, при отсутствии Н /Kβ, не могут быть представлены молекулами MHC [25] (S Аллен, личное сообщение). Поэтому мы перевели CD4 + T-клетки из Н /Ка - /- мышей в сублетально облученного Н /Kβ - /- мышей и сравнили их с Н /Ка - /- и дикого типа Мыши-реципиенты. Анализ аутоиммунной атаки на слизистую оболочку желудка осложняется в Н /Ка - /- и Н /Kβ - /- мышей по изменениям, которые происходят в слизистой оболочке желудка, так как отсутствие желудочной кислоты у этих мышей приводит к повышенным уровням трофической гормона гастрина. Это приводит к конститутивной гипертрофии и истощение ферментативного клеток [26],. Поэтому для того, чтобы оценить, если аутоиммунные реакции атакует слизистую оболочку желудка у этих мышей, мы вместо того, чтобы определили распространенность париетальных клеток, которые, как правило, обедненного в аутоиммунного гастрита но найдены в изобилии в Н /Ка - /- и H /Kβ - /- мышей, а также присутствие желудка аутоантител
<р> морфология желудка в Н /<Ка SUP> -. /- мышей или Н /Kβ - /- мышей не зависит от передачи Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки (рис 7А, 7В). В частности, не было истощение париетальных клеток, указывающих на отсутствие аутоиммунной реакции. В противоположность этому, полное истощение париетальных клеток наблюдалось у мышей-реципиентов дикого типа, которые получили H /Ка - /- CD4 + Т-клеток (рис 7в). Так как желудки Н /Ка - /- и Н /Kβ - /- мышей появились отличаются от нормальных, так и относящийся к гастриту мышей, мы не смогли оценить этих мышей, используя стандартную систему гастрит подсчета очков. Тем не менее, H + /K + АТФазы аутоантитела, другой признак аутоиммунного гастрита, не были обнаружены в сыворотке крови обоих Н /Ка - /- и Н /Kβ - /- мышей-реципиентов, но были обнаружены у мышей-реципиентов дикого типа (Рисунок 7D). Эти результаты показали, что присутствие обоих альфа и бета субъединиц требовалось для разрушения париетальных клеток Н /<Ка SUP> - /-. CD4 + T-клетки}

Обсуждение
<р> аутоиммунный гастрит может быть вызван в BALB /с мышей несколькими способами, в том числе новорожденных тимэктомированных, для взрослых тимэктомированных с циклофосфамидом [19], [21], иммунизация с желудочным H ^{+ /K + АТФазы [5] и поколение H + /K + АТФазы специфические TCR трансгенных мышей [7], [8]. Тем не менее, иммунная система доминирует Т-клеток с одной специфичности, как наблюдается у TCR трансгенных мышей, не похожи на нормальных физиологических условиях. Кроме того, тимэктомия и иммунизации не передают тяжести заболевания и последовательной они технически сложные, что делает его неудобно использовать эти модели для анализа иммунотерапии. Поэтому мы разработали новую модель болезни, которая опиралась на передаче Т-клеток из Н /<Ка SUP> - /-. Мышей, поликлональное популяция, которая содержала весьма gastritogenic Т-клетки
<р> Мы обнаружили, что иммунизация Н /Ка - /- мышей с очищенным H + /K + АТФазы индуцирует энергичную реакцию Т-клеток, как результат отсутствия толерантности Т-клеток к аутоантигенов желудка, что указывало на присутствие H + /K + АТФазы-специфические Т-клетки в Н /<Ка SUP> - /- мышей. Кроме того, мы показали, что перенос CD4 + T клеточные популяции из Н /Ка - /- мышей, индуцированные повреждения тканей желудка мышей-реципиентов вскоре после передачи. Аутоиммунный гастрит, индуцированный передачей Н /Ка - /- CD4 + Т-клеток было стабильно тяжелой: все мыши-реципиенты разработали самые тяжелые заболевания через восемь недель после переноса и их желудок физиология была существенно влияет как показано увеличение массы в желудке и рН. Эта модель является предпочтительным, так как тяжесть и частота подходов заболевания, которые наблюдаются у TCR трансгенных мышей, пока вызывается поликлональных репертуара, технически просто установить, она не зависит от возмущения нормального клеточного репертуара Treg.
<р> население донор клеток из Н /Ка - /- мышей, обогащенного до ~ 85% CD4 + Т-клеток с помощью процедуры "негативной селекции", потому что основная цель данной работы заключалась в создании простой , недорогой и удобной моделью заболевания. Мы пришли к выводу, что это CD4 + T-клеток в инокулята, которые вызвали аутоиммунный гастрит, поскольку он твердо установлено многими исследованиями, что CD4 + Т-клеток, а не другие типы клеток способны инициировать аутоиммунный гастрит [7 ] - [17]. Очевидно, что популяции Т-клеток и В реактивных к H + /K + АТФазы присутствуют в репертуаре нормальных мышей [5], [14] - [16], [21], [24 ], [28] - [33]. Таким образом, мы полагаем, что H + /K + АТФазы-специфических Т и В-клетки реципиента затем набраны на поражение и реципиентом происхождения В-клетки отвечают за выработку аутоантител.}

ранее было документально подтверждено, что CD4 ^{+ Т-клетки из Н /Kβ - /- мышей вызывают аутоиммунный гастрит у бестимусных BALB /с мышей, но не у облученных мышей дикого типа [24]. CD4 + Т-клетки из Н /Ка - /- мышей вызвали гастрит у облученных мышей дикого типа предполагая, что эта популяция более патогенными, чем CD4 + Т-клеток из Н /Kβ - /- мышей , Эти данные подтверждают более доминирующую роль иммунного ответа против Н /в Ка патогенезе аутоиммунного гастрита, в соответствии с выводами, содержащимися в TCR трансгенных мышей [7], [8].
<Р> В отличие от других моделей заболеваний, которые использовали Treg клеток обедненный поликлональные Т-клетки от мышей дикого типа, чтобы вызвать аутоиммунную реакцию [15], не было необходимости для удаления клеток Treg из Н /Ка - /- CD4 + популяции Т-клеток для индукции тяжелой аутоиммунного гастрита. Кроме того, развитие аутоиммунного гастрита у мышей-реципиентов не было вызвано пониженным уровнем клеток Treg из популяции доноров, так как относящийся к гастриту мышей содержали аналогичную долю клеток Treg в paragastric лимфатических узлов по сравнению с не относящийся к гастриту управления. Ранее мы показали, что Treg клетки из Н /Ка - /- мыши были столь же эффективными, как Tregs клеток от мышей дикого типа в подавлении H /Ка-специфических аутореактивных Т-клеток [34]. Таким образом, наши результаты здесь поддерживают предыдущую работу, указывающую, что репертуаром Т-клеток, которые не перенесшие удаление периферической Т-клеток не могут быть подавлены населения нормальным Treg клеток [24], [35].}

Несмотря на то, нормальный уровень из Treg клетки были обнаружены в paragastric лимфатических узлов мышей, относящийся к гастриту, и значительно более высокий процент клеток Treg был найден в желудке относящийся к гастриту мышей по сравнению с нормальными мышами, Treg клетки были не способны предотвратить или подавить болезнь. Это согласуется с выводом о том, что, хотя Treg клетки накапливаются в центральной нервной системе, когда экспериментальный аллергический энцефаломиелит было приведено в [36], они не смогли предотвратить расширение и функции миелина олигодендроцитов гликопротеина специфических Т-клеток, так как местное воспалительный цитокин среда визуализации патогенные Т-клетки, устойчивые к подавлению Treg.
<р> Истощение париетальных клеток является отличительным признаком аутоиммунного гастрита и основной причиной того, что злокачественная анемия является опасным для жизни заболеванием, поскольку теменной клетки производят внутренний фактор, отсутствие которого приводит к летальному исходу , Мы обнаружили, что истощение париетальных клеток в этой модели заболевания зависит от присутствия обоих H ^{+ /К + АТФазы субъединиц как CD4 + Т-клеток из Н /Ка - /- мышей только индуцированное истощение теменной клеток у мышей дикого типа, но не в Н /Ка - /- и Н /Kβ - /- мышей. истощение париетальных клеток не было вызвано Т-клеточного ответа по отношению к H /Kβ, поскольку Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки не индуцируют истощение париетальных клеток в Н /Ка - /- мышей-реципиентов в то время как было высказано H /Kβ у этих мышей [26]. С другой стороны, отсутствие теменной истощения клеток в Н /Kβ - мышей-реципиентов, получивших H /Ка - - //- CD4 + Т-клетки армированные наши предыдущие исследования, что указывает на необходимость H /Kβ для того, чтобы Н /Ка, которые будут представлены молекулами MHC [22]. Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что теменной истощение клеток в этой передаче модели, разработанной в результате иммунного ответа на H /CD4 на Ка + Т-клетки из Н /Ка - /- мышей. Отметим, что в предыдущей работе мы обнаружили, что теменной клетки не обеднена либо Н /Ка - /- ни Н /Kβ - /- мышей после неонатального тимэктомированных, что подчеркивает состоятельность этой новой модели с результатами этого предыдущего, хорошо налаженной модели.
<р> Мы также показали, что здесь вес желудок может быть использован в качестве количественной меры степени тяжести заболевания, так как гипертрофия слизистой оболочки желудка наблюдалось у мышей с аутоиммунным гастритом и привело в увеличении веса желудка [37]. Был значимая корреляция между массой тела желудка и тяжести аутоиммунного гастрита у мышей, получавших Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки. Это соотношение было дополнительно подтверждено в неонатально-thymectomised мышей, со средней величиной веса желудка в каждом гастрита счет будучи значительно отличается от другого. Тем не менее, из-за изменения в пределах группы, большой размер выборки будет требоваться, если вес желудок должен быть использован для оценки тяжести заболевания. Поэтому, гистологическое исследование в сочетании с весом желудка можно рассматривать как дополнительные меры для оценки тяжести аутоиммунного гастрита
<р> Мы показали, что аутоиммунный гастрит, индуцированный приемному передачи H /Ка -. /- CD4 <вир> + Т-клетки представляет собой отличную модель болезни для рассечения аутоиммунного ответа и конструкции interventionary терапии аутоиммунных заболеваний. В этой модели заболевания, аутоиммунный гастрит была вызвана нефракционированного населения поликлональные Т-клеток, которая содержала патогенные Т-клетки, специфичные для одного антигена, и в соответствии тяжести заболевания высокосортной наблюдается у всех мышей-реципиентов. Более того, мы показали, что тяжесть заболевания может быть легко определяется по весу желудка, рН желудка и гистологическое исследование секции желудка.}

Материалы и методы исследования

Этика заявление
<р> Эта работа направлена чтобы получить более детальное знание аутоиммунного заболевания и иммунологические механизмы, которые предотвращают аутоиммунные у нормальных индивидуумов. По мере того как иммунная система очень сложная, интегрированная сеть, животные должны правильно оценить эти вопросы.
<Р> Большинство процедур были клинические испытания, проведенные на образцах крови и тканей, взятых у мышей, которые поддерживаются в отличном жилищных условий , Мышей пристально следить и если серьезно пострадали или огорчен убиты. По окончании каждого эксперимента мышей забивали асфиксией CO2 или цервикальной дислокации, которые связаны с минимумом бедствия.
<Р> Все эксперименты тщательно спланирована, чтобы уменьшить количество животных и выполняются в строгом соответствии с руководящими принципами, диктуемых университетом Мельбурна Комитета по этике исследований на животных; по предотвращению жестокого обращения с Законом животных 1986 года; и NHMRC /CSIRO /AAC Австралийский кодекс практики по уходу и использованию животных в научных целях (1997).
<р> Эта работа была одобрена университетом комитетом по этике животных в Мельбурне в рамках проекта номером 0706327.3. <бр>

Мыши
<р> BALB /cCrSlc [38], BALB /cCrSlc.CD90.1 конгенных, Н /Ка ^{- /- [26], Н /Kβ - /- [ ,,,0],27] и BALB.B6- Gasa
конгенных мышей [20] были описаны ранее. Оба Н /Ка - /- и Н /Kβ - /- мышей были возвратное скрещивание больше, чем в 10 раз BALB /cCrSlc. Н /Ка - /- мыши были скрещены мышам BALB /c.CD90.1 для генерации H /Ка - /- мышей. CD90.1. Все мыши содержались в обычном виварии в науке и биотехнологии Института молекулярной Bio21, Университет Мельбурна. Все мыши и эксперименты были одобрены комитетом Университета Мельбурна экспериментирования животных по вопросам этики.}

Антитела и потока цитометрии анализ
<р> Анти-CD3-FITC (145-2С11), анти-CD90.1- FITC (HIS51), анти-CD90.2-FITC (30H-12), анти-CD62L-PE (MEL-14), анти-CD4 PerCP (RM4-5) и анти-CD8-APC (53-6.7) были приобретены у BD Pharmingen; анти-CD44-APC (IM-7) был приобретен у eBioscience. Внутриклеточное окрашивание Foxp3 проводили с использованием анти-FOXP3-APC (ЗСК-16S) и FOXP3 окрашиванием Kit (eBioscience) в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Проточной цитометрии проводили на Becton Dickinson FACSort проточном цитометре и анализировали с использованием CellQuest Pro программное обеспечение или компании Beckman Coulter Cyan и анализировали с помощью программного обеспечения на высшем уровне.

Анализ ответов Т-клеток у мышей, иммунизированных H + /K + АТФазы
<р> Очищенная свинья желудка H + /K + АТФазы готовили в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (Life Technologies). Мышам вводили подкожно в каждую сторону от основания хвоста. Н /Ка - /- и BALB /cCrSlc мышей иммунизировали дважды 30 мкг H + /K + АТФазы, с одного месяца друг от друга между прививках. Через одну неделю после второй иммунизации мышей умертвили их сывороток и паховые лимфатические узлы. H + /K + АТФазы-специфические аутоантитела были обнаружены ELISA. Клетки из паховых лимфатических узлов были использованы в анализе пролиферации Т-клеток. 1 × 10 5 клетки культивировали в течение 72 часов с 2 × 10 4 селезеночной DC от мышей BALB /cCrSlc. пролиферацию Т-клеток оценивали путем включения 3 Н-тимидина в течение заключительных 16 часов культивирования. Т-клетки культивировали в трех повторах либо DC с антигеном (50 мкг /мл мыши мембраны желудка) или с DC в одиночку. Желудочный мембраны получали из желудков мыши, как описано ранее [5]

Индукция аутоиммунного гастрита у мышей
<р> CD4 ^{+ Т-клетки были обогащены до &Гт. 85% чистоты из лимфатических узлов и селезенке Н /Ка - /- и мышей BALB /cCrSlc. Одноклеточных суспензий инкубировали в смеси F4 /80 и В220 супернатантов гибридомы плюс анти-CD8 антитела (53.6.72, BioXCell). В не-CD4-клетки удаляли с помощью анти-IgG крысы покрытием магнитных шариков (Dynal, Invitrogen). CD4 + (5 × 10 7) Т-клетки либо Н /Ка - /- или мышей BALB /cCrSlc вводили в сублетально облучены (600 радах) дикого типа конгенных BALB /cCrSlc.CD90.1 мышей с помощью внутрибрюшинно. В некоторых экспериментах очищенный Н /Ка - /- CD4 + Т-клетки вводили в облученной BALB /cCrSlc, Н /Ка - /- и Н /Kβ - /- мышей. У всех мышей-реципиенты были облучены в 600 рад за один день до переноса Т-клеток. Восемь недель спустя, мышей-реципиентов были убиты и желудки, лимфатические узлы и сывороток собирали.
<Р> BALB /cCrSlc и BALB.B6- Gasa
конгенных мышей использовали в опытах Тимэктомия. Новорожденных тимэктомия проводили, как описано ранее [20].}

Гистологическое исследование желудков и измерения рН желудка
<р> секции Желудок были исследованы на наличие патологических изменений, как описано ранее [24]. Скоринг проводили в слепом и каждый слайд был независимо друг от друга забили по крайней мере, двух человек. Для того, чтобы измерить рН желудка, мышей подвергали голоданию в течение ночи перед жертву. Желудки были вскрыты и промывали в 1 мл физиологического раствора, который собирают и измеренным с помощью рН-метра.

Н + /К + АТФазы специфичные твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA),
<р> ELISA для обнаружения H + /к + АТФазы аутоантитела проводили с использованием очищенного свинью H + /K + АТФазы, как описано ранее [29].

Статистический анализ
<р> Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism 5.0 (GraphPad). Данные были проанализированы с использованием Mann-Whitney U-тест или тест корреляции Спирмена и значение P ≪ 0,05 считают значимым
.

• PLoS ONE: Экспрессия генов Профилирование в слизистой оболочке желудка с Helicobacter Pylori-инфицированных и неинфициро…
• PLoS ONE: Точность и Cut-Off Значения Pepsinogens I, II и гастрин 17 для диагностики желудочных фундальный атрофии: Влияние Gas…