GSDMB энхансер управляемый HSV тимидинкиназы, экспрессирующих вектором для управления оккультную перитонеальный распространение клеток рака желудка

A GSDMB
энхансер-управляемый HSV тимидинкиназы, экспрессирующих вектором для управления оккультную перитонеальный распространение клеток рака желудка
Аннотация
фон
рак желудка (GC) является одним из основных злокачественных заболеваний во всем мире, особенно в Азии, а также Япония и Корея имеют самый высокий уровень в мире. Поскольку большинство случаев, которые резистентны к терапии умирают из-за перитонеального распространения (PD) раковых клеток, контролируя PD имеет важное значение для выживания пациента. GSDMB
является членом семейства генов gasdermin. Поскольку GSDMB
выражается во многих видов рака, в том числе GC, вполне вероятно, что ген содержит регуляторный участок, который используется для терапии оккультного PD через клеточно-специфической экспрессии рака цитотоксических генов.
Способов
Мы провели репортер анализы для определения регуляторной области для экспрессии клеток рака специфические. Мы также построили Lentiviral терапевтический вектор, выражающий вирусом простого герпеса тимидинкиназы (HSVtk) в клеточно-специфическим образом GC, и испытали его в модели мыши PD.

Результаты Мы определили регуляторную область в +496 чтобы +989 от GSDMB
сайта инициации транскрипции и обозначив его в качестве GSDMB
энхансер. Лентивирусов терапевтический вектор подавлено пролиферацию линии клеток ГХ, 60As6, экстракорпоральное
в присутствии ганцикловира и внутрибрюшинного введения вектора продлил срок выживаемости мышей, которым вводили внутрибрюшинно 60As6 за одну неделю до начала введения.
Выводы
The GSDMB
управляемом обществом выражение вектор HSVtk имел терапевтический эффект на оккультных PD модели мышей. Эта стратегия потенциально может быть использован для лечения пациентов с GC PD.
Ключевые слова
Желудочные новообразованиями полости брюшины Генетическая терапия ВПГ Тимидинкиназа Предпосылки
рак желудка (GC) является одним из основных злокачественных заболеваний, особенно в Азии, и второй ведущей причиной рака-ассоциированных смертей во всем мире [1]. Это, как правило, подразделяются на два типа (классификация Лорен) [2], кишечный и диффузный, которые, как полагают, чтобы отразить его патогенеза [3]. Диффузного типа GC (DGC) является подразделены на слабо дифференцированы GC (нетвердой типа) или недифференцированные GC в системе классификации японская Желудочный ассоциации рака [4]. DGC является инфильтративный и часто показывает агрессивное вторжение в стенки желудка, что приводит к метастаз и распространение ГЦ клеток в брюшную полость (перитонеальный распространения, PD).
Распространяемой GC клетки в брюшную полость приводят к перитонеального карциноматозом ( ПК) [5]. PC вызывает желудочно-кишечные симптомы, такие как боль в животе, тошнота и рвота, а также системные симптомы, такие как потеря веса и асцитом. ПК не только сильно ухудшает качество жизни пациентов GC, но это также является ведущей причиной смерти в GC [6]. С помощью поддерживающей терапии, медиана выживаемости больных с ПК составляет 3-6 месяцев [7]. Если лечение с системной химиотерапии, таким же образом, как и для других метастатических поражений, ПК показывает более слабую реакцию на терапию, чем другие типы метастаза в GC, главным образом, из-за плохого распределения химиотерапевтического агента в брюшную полость. Поэтому в последнее время усилия были сосредоточены на инновационных терапевтических средств для ПК, например совмещение циторедуктивного хирургии, термотерапия, и внутрибрюшинного химиотерапии. Эти комбинированные подходы немного улучшили прогноз PC, хотя средний период выживания по-прежнему меньше, чем 12 месяцев, давая понять, что есть практический предел эффективности хирургической циторедукции [8, 9]. Недавние исследования показывают, что очень важно для выявления пациентов GC с оккультной PD, выполняя цитологическое исследование перитонеального лаважа, поскольку такие случаи показали улучшенный прогноз, если они получают преобразование в отрицательной цитологии обширным интраоперационной перитонеального лаважа с последующим внутрибрюшинном химиотерапии [10].
понятие "гена самоубийства" рака терапии, с помощью простого герпеса вируса тимидинкиназы (HSVtk), возникшие в 1980-е годы [11]. HSVtk катализирует фосфорилирование аналог гуанозина ганцикловир (GCV) в виде монофосфата, который затем фосфорилируется клеточными киназами нуклеотидных в высокотоксичного ганцикловира трифосфата [12]. Ганцикловир трифосфат блокирует ДНК репликации, что приводит к остановке клеточного цикла и гибели клеток [13]. Терапия с участием передачи HSVtk в раковые клетки с последующим введением GCV, известен как ген самоубийства терапии, и этот метод был недавно использован в фазе III клинических испытаний на глиобластомы [12].
В этом исследовании мы разработали терапевтический вектор, который выражает HSVtk в раковых клетках, используя регуляторную область гена gasdermin B (GSDMB
). GSDMB
является членом семьи gasdermin (GSDM
), который состоит из четырех генов, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
и GSDMD
[14, 15], и выраженное в пролиферирующих клетках нормального эпителия, а также во многих видов рака, в том числе пищевода, желудка, печени, толстой кишки, шейки матки и рака молочной железы [14, 16-18]. GSDMB
выражение приводится в движение двумя промоутерами, клеточного промотора и LTR-производного промотора [19-21]. ДКП полученный промотор (LTR-промотор) является активным в большинстве нормальных тканей, за исключением того, желудка, и во многих линиях раковых клеток, в то время как клеточный промотор активен в нормальной ткани желудка и в некоторых линиях раковых клеток [20]. В данном исследовании мы идентифицировали область в нижнем течении промотора LTR, который показал сильную транскрипционную активность в линиях GC клеток. Мы использовали этот регион, чтобы построить вирусный вектор HSVtk-экспрессии для управления оккультную PD.
Методы
Человеческие ткани
Рак желудка (GC) ткани были предоставлены Национальной больнице онкологического центра после получения письменного информированного согласия от каждого пациент, который был одобрен Национальным советом онкологического центра Institutional Review (ID: No.17-030). Образцы ткани были немедленно замораживали жидким азотом после хирургической экстракции, и хранили при -80 ° С до использования.
микрочипов анализа
Общую РНК выделяли путем суспендирования клеток в буфере для лизиса ISOGEN (Nippon Gene, Тояма, Япония) с последующим осаждением изопропанолом. Мы провели анализ с использованием выражения человеческого массива Expression U95A версии 2 (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния) в соответствии с протоколами поставщиков. Значение выражения (средняя разница: AD) каждого гена рассчитывали с использованием GeneChip Analysis Suite, версия 4.0 программного обеспечения (Affymetrix). Иерархическая кластеризация данных микрочипов проводили с использованием GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel и Cluster &Amp; TreeView [22, 23]. Все данные микрочипов были сданы на хранение в базе данных MIAME совместимой, GEO (инвентарный номер; GSE47007). По Вилкоксона
(
р ≪ 0,05) у -test, гены экспрессируются и показав 2-кратное изменение конкретно в диффузного типа GC были выбраны [22]
клеточных линий и первичных культуры мыши. мезотелиальной клеток передаются
Три желудка линии раковых клеток, HSC-57, полученный из кишечного типа GC, и HSC-59 и HSC-60, и полученный из диффузного типа GC, были установлены и охарактеризованы одним из авторов [24 ]. SNU16, полученный из диффузного типа GC, была предоставлена ​​из Американской коллекции типовых культур (АТСС), две другие клеточные линии с эффективностью в производстве PD мышей, 60As6 и 60As6GFP (60As6 экспрессирующих зеленый флуоресцирующий белок), были созданы авторами из диффузного типа GC получены линии клеток HSC-60 после нескольких проходов внутрибрюшинной трансплантации мышам [25]. CC-2511, фибробласта клеточную линию, был приобретен у фирмы Lonza, Япония (Токио, Япония). Все клеточные линии поддерживали в среде Игла в модификации Дульбекко. Мышиные мезотелиальные клетки собирали путем инъекции 10 мл подогретого 0,25% раствора /ЭДТА Трипсин в брюшную полость [26]. Клетки инкубировали в течение 3 дней в среде RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, фенолового красного и HEPES (WAKO, Токио, Япония). Met-5A, человек мезотелиальной клеточная линия, была предоставлена ​​АТСС и поддерживали в среде 199 (Life Technologies, Токио, Япония) с добавлением 3,3 нМ EGF (Life Technologies), 400 нМ Гидрокортизон (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO США), 870 нмоль инсулина (Life Technologies) и 10% FBS.
RT-PCR
тотальную РНК из нормальных органов человека были приобретены у BioChain, Hayward, CA. Всего РНК экстрагировали с использованием RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Токио, Япония). После создания первой цепи кДНК из общей РНК с использованием Thermoscript системы RT-PCR (Life Technologies, Токио, Япония), ПЦР проводили с AccuPrime ™ PFX
ДНК-полимеразы (Life Technologies) при следующих условиях езда на велосипеде либо 35 (LTR транскриптов ) или 25 циклов (другие): 95 ° C в течение 1 мин; 56 ° С (β-актин) или 58 ° C (другие) в течение 1 мин; и 72 ° С в течение 1 мин. Были использованы следующие наборы праймеров: для клеточного промотора транскрипт, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'и 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; для LTR промотора, полученных транскриптов, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'и 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; для 'сторону GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3' 3 и 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3 '; для MYH11
, 5'- CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'и 5'- CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; и для бета-актина
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'и 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'.
Reporter Анализ
геномный фрагмент, от -1080 до +1053 из GSDMB
и содержащий промотор LTR, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием LA-Taq Hot Start ДНК-полимеразы (Takara) в 35 циклов 96 ° с в течение 30 с и 68 ° с в течение 2 мин, с использованием наборов праймеров: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'и 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', и вставляется в основной вектор pGL3 (Promega, Madison, WI). Он был усечен с использованием сайтов рестрикции: Nhe
Я и эко
R I для создания -1035 до +1053 фрагмента с; Kpn
I и Eco R I
для -426 до +1053; Nhe
I и AFL
II для -61 до +1053; Nhe
I и Eco
81 Я за +129 к +1053; и Nhe
Я и Stu
Я для +496 до +1053. Конструкция +496 к +1053 репортер был дополнительно усеченного ферментами рестрикции: Nhe I
и Сва
Я за +757 к +1053; Nhe
I и Pvu
II для +860 до +1053; Nhe I
и Bst
X I для +989 до +1053; Xho
I и Bst
X I для +496 до +989; Xho
I и Pvu
II для +496 до +860; и Xho
I и Сва
Я за +496 к +757. Для дальнейшего усечением +496 к +989 фрагмента, ПЦР проводили с фрагментом в качестве матрицы с использованием Ex Taq ДНК-полимеразы (Takara) в 35 циклов при 95 ° С в течение 1 мин, 58 ° С в течение 1 мин и 72 ° с в течение 1 мин, с использованием следующих наборов праймеров: для +562 до +989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'и 5'- AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; и +649 до +989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'и 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. После амплификации фрагменты вставляли в pGL4.12 [luc2CP
] вектором (Promega). -1 Т.п.н. слева области CXCR4
и CXCR7
были получены с помощью ПЦР с использованием геномной MightyAmp ДНК-полимеразы (Takara) в 35 циклов 98 ° С в течение 10 с, 62 ° С в течение 15 с и 68 ° С в течение 2 мин, с использованием следующих наборов праймеров: для CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'и 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; и для CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'и 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Эти фрагменты были вставлены в [luc2CP
] вектор pGL4.12. Один микрограмм каждой конструкции и люциферазы борьбы с переносчиками репортер Renilla (ПРЛ-SV40 вектор, Promega) котрансфицируют в 1 × 10 5 клеток с использованием Superfect трансфекции Реагент (QIAGEN). Анализ люциферазы проводили через 24 ч после введения репортера, с использованием двойного люциферазы репортерной системы анализа (Promega). Анализ проводили в трех экземплярах.
GSDMB
энхансер-HSVtk лентивирусов вектор
Вектор pMFG-HSVtk была предоставлена ​​RIKEN BRC через Национальный проект Био-Ресурсном МПКСНТ, Япония, любезно д-ра . Хирофуми Hamada, и кДНК HSVtk вырезали из него как Nco
I-Bam HI фрагмента изображения. Для построения GSDMB
лентивирус вектор энхансер-HSVtk, сначала +496 до +989 фрагмент (GSDMB
энхансер) был вставлен в пкДНК3.1 (+) (Life Technologies) между Nhe
I и Hind
III места, а затем HSVtk кДНК встраивали в вектор в
HI сайта Bam в прямом направлении (для смысловой нити выражения) или назад (для антисмысловой нити экспрессии) направлении. Затем GSDMB
энхансер-HSVtk смысл и GSDMB
фрагменты антисмысловых энхансер-HSVtk вырезали из плазмидных векторов, как Nhe I-
Не
Я фрагментов и встраивали в pLVSIN-CMV нео векторов между Xba
я и не
Я сайтов. И, наконец, ЦМВ промотор был удален из лентивирусов конструкций. Сформировать вирусные частицы, содержащие векторы, конструкции были введены в Ленти-X ™ 293 Т-клеток (Takara), с использованием System ™ HTX Упаковка Ленти-X (Takara). После того, как 72-Н ~ инкубации среду собирали и титр вируса (КОЕ /мл) определяли с помощью трансдукции в HT-1080 клеток в присутствии полибрен (5 мкг /мл в культуральной среде, Sigma-Aldrich). Частицы были применены к Met-5A и 60As6 (1 × 10 5 клеток на чашку, в трех экземплярах) в пробирке
в присутствии полибрен (5 мкг /мл) и клетки инкубировали в среде, содержащей Gancicrovir (GCV, 5 мкг /мл, фирма Вако) в течение 5 дней для анализов роста клеток. Анализы проводились в трех экземплярах и P
-Value Т Стьюдента
-test между культивируемыми клетками с (+) и без него (-) GCV рассчитывался
Лечение модели PD мыши с GSDMB векторы энхансер-HSVtk
ранее мы сообщали модель PD мыши (PD мышей), который был произведен путем внутрибрюшинной инъекции клеток 60As6 [25]. 60As6GFP клетки (1 × 10 6 клеток на мышь) инъецировали в брюшную полость 18 мышей (6-недельных мышей из СВ17 /ICR-Prkdc &ЛТ; SCID &Гт /CrlCrlj Генотип: SCID /SCID, Charles River, Yokohama Япония) в день 1. мыши были разделены на две группы; одна группа вводили в вектор экспрессии антисмысловой, а другая группа впрыскивали с вектором чувств; Обе группы были затем внутрибрюшинно вводили по 2 мл раствора PBS, содержащего вирусную частицу (5 × 10 5 КОЕ) и ганцикловир (2 мг) в 8, 10 и 12-й день. Рассчитывали время средняя продолжительность жизни каждой группы и P
-value студенческого т
-test между этими двумя группами. Исследование было одобрено Национальным комитетом онкологического центра по на экспериментах на животных.
Результаты
идентификация региона энхансер в GSDMB
, который управляет экспрессией генов в клетках GC
Для того, чтобы определить регионы промотор /энхансер, что будет эффективным при разработке терапевтического вектора для перитонеального распространения (PD), мы сначала искали гены чаще, выраженные в диффузной типа GC, чем в кишечном типа GC с использованием сравнительного анализа экспрессии генов между 12 первичных диффузного типов и 18 кишечника -типы, потому что ПД чаще рассматривается в диффузного типа GC, чем в кишечном типа [22]. Мы заметили, что четыре из десяти Affymetrix GeneChip зонда наборы, показывающий наибольшую Наклоняемый изменения для экспрессии генов в диффузного типа GC по сравнению с кишечным типа были наборы зондов для MYH11
(миозин, тяжелой цепи 11, ген гладкой мускулатуры, Дополнительный файл 1: Таблица S1). После подтверждения того, что этот ген не экспрессируется в увековечен человеческой линии клеток мезотелиальной Met-5A (данные не показаны), мы выбрали MYH11
в качестве сильного кандидата гена, чей промотор позволяет диффузного типа GC конкретное выражение HSVtk. Тем не менее, этот ген не экспрессируется в клетках 60As6, которые были использованы для изготовления PD модели мышей (Дополнительный файл 2: Рисунок S1). Вполне вероятно, что MYH11
выражается в раковых ассоциированных с фибробластами, которые особенно многочисленны в тканях GC диффузного типа. Далее, выходя из анализа микрочипов данных, мы переместили свое внимание на вверх по течению регионов CXCR4
(хемокина (СХС мотив) рецептора 4 гена) и CXCR7
(хемокинов (СХС мотив) рецепторов 7 генов), так как оба выражены во многих типах рака и играют важную роль в метастазирования [27]. Однако, используя репортер анализов, мы обнаружили, что вверх по течению участки этих генов были транскрипционно активны в обоих Met-5A и клетки 60As6 (дополнительный файл 2: Рисунок S2), подразумевая, что регионы привода экспрессию HSVtk в мезотелиальной клетках человека в естественных условиях
. И, наконец, мы сосредоточились на GSDMB
гена, так как наша предыдущее исследование показало, что оно сильно выражено в GC тканей и клеточных линий [14].
GSDMB
транскрибируется двумя промоутерами, клеточных и LTR промоторов ( рис. 1a), а второй в основном используется в нормальных тканях и в линиях раковых клеток [19-21]. Мы подтвердили эти данные путем выполнения ОТ-ПЦР анализы на РНК из нескольких типов нормальных тканей (рис. 1b). RT-PCR на GC хирургических образцов показали, что промотор LTR был использован в 14 из 15 кишечного типа ШС и в 11 из 15 ШС диффузного типа (рис. 1в). Инжир. 1 GSDMB
ген транскрибируется промоутеров Cellular и LTR. (А) Схематическое изображение двух промоторов. (Б) экспрессии двух транскриптов, один клеточными промотором, а другой LTR, в нормальных тканях человека (RT-PCR). Четыре варианта GSDMB транскрипта человека зарегистрированы в GenBank; Вариант 1 (NM_001042471), вариант 2 (NM_018530), вариант 3 (NM_001165958) и вариант 4 (NM_001165959). Транскрипция вариантов 1, 3 и 4 приводится в движение с помощью клеточного промотора и варианта 2 является промотором LTR. Борт 3 'GSDMB
транскриптов является общим для каждой из них. (С) экспрессия LTR-транскриптов в желудочном раковых тканей, 15 кишечного типа и 15 образцов диффузного типа (RT-PCR на образцах хирургических)
Для идентификации области критической для транскрипционной активности в GC клетки, ДНК-фрагмент, охватывающий -1080 до +1053 п.н., положение от сайта инициации транскрипции для промотора LTR, был выделен (рис. 2а). Репортер анализы на усеченных фрагментов ДНК с использованием двух клеточных линий GC, ГСК-57 и ГСК-59, показали, что +496 до +989 область имела сильную транскрипционную активность, даже сильнее, чем у оригинала -1080 до +1053 фрагмент, и что дальнейшее укорочение +496 к +989 фрагмента привело к значительному снижению транскрипционной активности (рис. 2, б). Область, соответствующий этому фрагменту с сильным транскрипционной активностью был назван GSDMB
энхансер. Инжир. 2 Идентификация GSDMB
энхансер. (А) схематичное изображение репортерные конструкции, используемые в люциферазы анализов. Длинный элемент концевой повтор (LTR) эндогенного ретровируса человека проявляется в двунаправленную стрелку. Положение от стартового сайта транскрипции для стенограммы промотора LTR. (Б) люциферазы анализы с использованием двух желудочных клеточных линий рака, ГСК-57 и ГСК-59, выявили область с сильной транскрипционной активностью, охватывая от +496 до +989, который был обозначен как GSDMB
энхансер. Вектор, пустой вектор репортер, Бар, стандартное отклонение
Строительство GSDMB
энхансер приводом лентивирусов вектора HSVtk
Ранее мы сообщали о мыши PD модель (PD мышей), который был произведен путем внутрибрюшинной инъекции клеток 60As6 [ ,,,0],25]; В данном исследовании мы разработали вирусный вектор терапевтический для лечения мышей PD. Для изучения прочности транскрипционной активности GSDMB
энхансер в 60As6, репортерные анализы выполняли, используя репортер построить для восходящего потока областей CXCR4
и CXCR7 Китай для сравнения. В GSDMB
энхансер показали сильную транскрипционную активность в клетках 60As6 чем
CXCR4 или CXCR7
вверх по течению регионов, а также, что немаловажно, GSDMB
энхансер имел очень слабую транскрипционную активность в мышиных перитонеальных мезотелиальной клетках и в Met-5A, человека мезотелиальной клеточная линия (рис. 3). Этот результат наводит на мысль, что GSDMB
энхансер позволяет экспрессию HSVtk почти исключительно в 60As6 но не в мезотелиальной клетках в брюшную полость мышей с БП, и, вероятно, не в брюшную мезотелием человека. Инжир. 3 GSDMB
энхансер имеет сильную транскрипционную активность в клеточной линии 60As6. Люциферазы анализы с тремя типами культивируемых клеток: 60As6 клетки, которые были использованы для изготовления перитонеального распространения (PD) модели мышей в этом исследовании, первичная культура клеток мыши перитонеального мезотелиальной клеток и установили человеческой линии клеток mesotherial Met-5A. Бар, стандартное отклонение
Далее, мы исследовали влияние терапии HSVtk /GCV с использованием GSDMB
энхансер управляемых HSVtk лентивирус вектор на 60As6 в пробирке
(рис. 4а). Число клеток 60As6 трансдуцированных с лентивирусов вектор был значительно снижен при инкубации в среде, дополненной GCV; с другой стороны, то же лечение HSVtk /GCV не оказывал влияния на количество клеток Met-5A (рис. 4, б). Инжир. 4 HSVtk /GCV терапия с использованием энхансероподобные загнал GSDMB
лентивирус вектор улучшила выживаемость мышей PD. (А) лентивирусов терапевтический вектор GSDMB
энхансер (ENH) управляемом обществом экспрессия вируса простого герпеса тимидинкиназы (HSVtk). (Б) анализ на пролиферацию клеток на 60As6 и Met-5A трансдуцированная с терапевтическим вектором, выполненным путем инкубации в среде с (+) /без (-) ганцикловир (GCV). (С) с использованием режима химиотерапии HSVtk /GCV терапии для PD мышей. Бар, стандартное отклонение, P
, P
-value Т Стьюдента
-test между культивируемыми клетками с (+) и без него (-) GCV. (D) Микроскопическое проявляли небольшую популяцию клеток 60As6GFP (зеленая флуоресценция), имплантированных в брюшины мыши в день 10. (е) количество выживших мышей после HSVtk /GCV терапии с смысловой нити вектор экспрессии (красный) и с антисмысловым -strand вектор экспрессии в качестве эталонного (синий). Среднее время выживания каждой группы показана на правой стороне с P
- значение Стьюдента
-test между двумя группами
HSVtk /GCV терапии оккультных мышей PD
Мы применили HSVtk /GCV терапия мышей PD. В этом терапевтическом анализе, мы приготовили два типа энхансероподобные загнал GSDMB
лентивирусов вектора: один вектор выражается чувственным прядь HSVtk кДНК и использовали для лечения мышей PD, в то время как другой вектор выражается антисмысловой нити и использовали в качестве контроля. Терапия была начата через семь дней после внутрибрюшинного заражения клеток 60As6, экспрессирующих зеленый флуоресцирующий белок (60As6GFP). Этот режим был разработан для лечения оккультной модели PD, в которых клетки были 60As6GFP диффузно привиты в брюшную полость (рис. 4, в, г). После трех доз лечения, т.е. 36-й день, ни один из девяти мышей, обработанных смысловыми-вектор экспрессии, HSVtk не умер, в то время как два из девяти контрольных мышей уже умерли. Ни один из девяти контрольных мышей были живы в день 57, то есть, через восемь недель после инъекции клеток 60As6GFP; Тем не менее, четыре из девяти терапевтических векторных обработанных мышей были все еще живы (рис. 4, д). Этот результат свидетельствует о том, что терапия может улучшить прогноз оккультных мышей PD.
Обсуждение
The GSDMB
усиливающего стимулирует экспрессию генов в клетках GC
Ранее мы сообщали, что GSDMB
выражается во всех GC ткани и клеточные линии исследовали [14], и в этом исследовании мы показали, что промотор LTR диски GSDMB
выражение в 25 из 30 образцов GC (рис. 1в). Транскрипционную активность LTR области (рис. 2а), была ранее продемонстрирована репортерных анализов в не-ГЦ клеточных линий [20, 21]. Тем не менее, мы нашли четкую область с сильной транскрипционной активностью в нижнем течении ДКП области, и назначил его в качестве GSDMB
энхансер. В дополнение к двум линиям GC клеток, HSC-57 и HSC-59, транскрипционный активность этого региона была обнаружена репортерных анализов в других линиях GC клеток, в том числе MKN74 (относительная активность люциферазы составляла примерно 1,9), ГСК-60 (29,4 ), ГСК-42 (2,5) и ГСК-44 (4,6), но не в HSC-58 или MKN28 (данные не показаны) [14]. Таким образом, GSDMB
энхансер не гонит экспрессию генов в некоторых клетках GC.
Усечение области, охватывающей +496 к +562 значительно снизило транскрипционную активность GSDMB
энхансер (рис. 2б, +562 до +989). В +496 до +562 области, мы нашли консенсус-сайты связывания нескольких факторов транскрипции, в том числе GATA2, GATA3, GATA4, YY1, Sox5, SOX9, Sox10 и NFY-A, а также базовой замещением в любом из этих консенсусных последовательностей сделал не влияет на транскрипционную активность энхансера (данные не показаны). Фактор транскрипции, который взаимодействует с энхансером и способствует его транскрипционной активности до сих пор не идентифицированы.
Применение терапевтического лентивирусов вектора к лечению оккультного PD человека
лечебной терапии не была установлена ​​для PD. GC пациентов с макроскопической PD имеют плохие прогнозы, с медиана общей выживаемости 3-6 месяцев. Те, у кого только микроскопической PD также имеют плохой прогноз; скорость их 5-летняя выживаемость составляет 0-18% [28]. Поэтому, важно, чтобы обнаружить оккультную PD путем цитологическом исследовании перитонеального лаважа и полностью уничтожить раковые клетки в брюшную полость. Мета-анализ, проведенный Cabalag и др
. указал, что обширная внутрибрюшинного промывание (EIPL, физиологический раствор 1 помет /доза, в 10 раз) и интраоперационной внутрибрюшинного химиотерапии (IIPC) с цисплатином значительно улучшилось 5-летняя общая выживаемость более чем на 40% [28]. Результаты исследования свидетельствуют о том, что HSVtk /GCV терапия с использованием лентивирусов вектор улучшает прогноз больных независимо друг от друга, и мы предполагаем, что будет использоваться в качестве консолидирующей терапии. Солидные опухоли с диффузной роста состоят из многих миофибробластов и несколько сосудов (например, диффузного типа ШС, поджелудочной железы и скиррозных типа рака молочной железы). В зависимости от условий микросреды, таких как дефицит питательных веществ, что эти опухоли показывают высокую распространенность редко-пролиферативных опухолевых клеток. Таким образом, GC клетки диффузная типа вкрапленные в брюшную полость, может состоять из популяции, которая может противостоять цитотоксическое действие цисплатина. Лентивирусов терапевтический вектор может ввести HSVtk в обоих пролиферирующих и не размножающихся клеток. Кроме того, GSDMB
энхансер позволяет GC-клеточную специфическую экспрессию HSVtk. Это ограниченное выражение минимизирует Мезотелиальной повреждение клеток, что предполагает, что генная терапия может быть выполнена с использованием достаточно высокие дозы, чтобы полностью уничтожить GC клетки, даже те, устойчивые к цисплатину, в оккультном PD. Вполне вероятно, что комбинированная терапия, EIPL и IIPC, а затем HSVtk /GCV терапии с использованием лентивирусов вектор, улучшит прогноз оккультной PD более существенно, чем EIPL и IIPC комбинированной терапии в одиночку. Мы считаем, что этот режим заслуживает того, чтобы быть размещены на клинических испытаниях. Хотя кажется, что GSDMB
энхансер не работает в некоторых GC клетках, необходимы дальнейшие исследования, направленные на выявление дополнительных усилителей GC-специфических, позволит решить эту проблему.
Выводы
The GSDMB
управляемом обществом выражение HSVtk вектор имел терапевтический эффект на оккультных PD модели мышей. Эта стратегия потенциально может быть использован для предотвращения пациентов от заражения GC PD, а также используется для лечения пациентов с БП GC.
Декларациях
Выражение признательности
Данное исследование было поддержано Grants-in-Aid научных исследований (C .) Японским обществом содействия развитию науки (ЯОРН KAKENHI Грант Номер 23501322)
Дополнительные файлы для дополнительного файла 1: Таблица S1. Десятка зондов наборов, обнаруживающих экспрессию, специфичную для диффузного типа рака желудка. Дополнительный файл 2: Рисунок S1. MYH11
не выражается в желудочном линиях раковых клеток. Промотор область как CXCR4
и CXCR7
генов показывает транскрипционную активность в обоих 60As6 и Met-5A клеток. Конкурирующие интересы
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Взносов Авторского
NS и HS разработаны и направлены данное исследование. NS проводили биологические анализы и эксперименты на животных, при поддержке со стороны РК, FC и Кентукки. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Рак желудка в университетской больнице на северо-западе Танзании: ретроспективный обзор 232 cases
• Влияние приема диагноза на опорожнение желудка в критическом состоянии patients