Genetický oscilátor zachytáva zmeny v vzorcoch rastu črevných mikrobiómov

Napriek všetkej pozornosti, ktorej sa ľudským mikrobiómom v posledných rokoch venuje, jeden aspekt takéhoto výskumu len zriedka uvádza titulky:obtiažnosť pozorovať, ako sa v priebehu času mení v reakcii na rôzne podnety. Najbežnejšou analytickou metódou je extrakcia baktérií z fekálnych vzoriek a následné sekvenovanie ich genómov, ale tento prístup, minimálne invazívne, stráca zásadné informácie o tom, kde a kedy sa v čreve vyskytujú bakteriálne zmeny, poskytuje vedcom neúplný obraz o dynamike mikrobiómu.

Teraz, nový nástroj vytvorený výskumníkmi z Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering na Harvardskej univerzite a Harvard Medical School (HMS) poskytuje riešenie tohto problému vo forme súboru bakteriálnych génov, ktoré boli navrhnuté tak, aby detegovali a zaznamenávali zmeny v rast rôznych populácií baktérií v čase v črevách živých myší s jednobunkovou presnosťou, a môže slúžiť ako platforma pre komplexné diagnostika a terapeutika založená na syntetickej biológii pre rôzne aplikácie v čreve. Štúdia je publikovaná v Prírodné komunikácie .

Dodržiavanie času

Systém používa oscilačný génový obvod, nazývaný represor, ako druh genetických hodín na meranie rastu baktérií. Represilátor sa skladá z troch bakteriálnych génov, ktoré kódujú tri proteíny (tetR, cl, a lacI), každý z nich blokuje expresiu jedného z ďalších proteínov. Gény sú prepojené do slučky negatívnej spätnej väzby, takže keď koncentrácia jedného z represorových proteínov klesne pod určitú úroveň, je vyjadrený proteín, ktorý potláčal, ktorý blokuje expresiu tretieho proteínu, a proces sa cyklicky opakuje.

Keď sú všetky tri gény vložené do plazmidu a zavedené do baktérií, počet dokončených cyklov slučky negatívnej spätnej väzby môže slúžiť ako záznam o tom, koľko bunkových delení baktérie podstúpili. Zakaždým, keď sa baktérie rozdelia, všetky represorové proteíny prítomné v ich cytoplazme sa zriedia, takže ich koncentrácia postupne klesá a spúšťa expresiu ďalšieho proteínu v represorovom cykle. Podstatné je, cyklus represora sa opakuje po 15,5 generáciách baktérií bez ohľadu na to, ako rýchlo alebo pomaly baktérie rastú. Vďaka tomu môže pôsobiť ako objektívne meranie času, podobne ako hodinky alebo hodinky.

„Predstavte si, že by ste mali dvoch ľudí na sebe dve rôzne hodinky, a sekundová ručička na hodinkách jednej osoby sa pohybovala dvakrát rýchlejšie ako hodinky druhej osoby, “vysvetlil prvý autor David Riglar, Ph.D., bývalý postdoktor z Wyss Institute a HMS, ktorý teraz vedie výskumnú skupinu ako člen Sir Henry Dale na Imperial College London. „Ak ste po jednej hodine zastavili obe hodinky, nezhodli by sa na tom, koľko je hodín, pretože ich meranie času sa líši v závislosti od rýchlosti pohybu druhej ruky. Naproti tomu náš represor je ako hodinky, ktoré sa vždy pohybujú rovnakou rýchlosťou, bez ohľadu na to, koľko rôznych ľudí nosí jedného, všetky poskytnú konzistentné meranie času. Táto kvalita nám umožňuje presnejšie študovať správanie baktérií v čreve. “

Vedci spojili každý z troch represorových proteínov s rôzne sfarbenou fluorescenčnou molekulou, a vyvinul zobrazovací pracovný postup s názvom RINGS (Inferencia rastu na báze represora na úrovni jednej bunky) na sledovanie, ktorý proteín je exprimovaný v rôznych časových bodoch počas rastu baktérií. „Ako kolónia baktérií rastie smerom von, obvod represora vytvára tieto rôzne fluorescenčné, signatúry podobné stromovým prstencom, na základe ktorých bol represorový proteín aktívny v jedinej baktérii, ktorá začala kolóniu, "povedal Riglar." Vzor fluorescenčných krúžkov zaznamenáva, koľko cyklov represora nastalo od začiatku rastu, a môžeme tento vzorec analyzovať, aby sme zistili, ako sa miery rastu líšia medzi rôznymi baktériami a v rôznych prostrediach. "

Použitie PRSTENOV, tímu sa podarilo úspešne sledovať delenie buniek u niekoľkých rôznych bakteriálnych druhov pestovaných in vitro, a pozorovali, že dĺžka cyklu represora baktérií zostala konzistentná, keď boli pestované na extrahovaných vzorkách myšieho čreva (na simuláciu komplexného mikroprostredia) alebo vystavené pôsobeniu antibiotika (na simuláciu stresových podmienok a nekonzistentných rastových vzorcov).

Sledovanie zmeny

Aby sa vyhodnotila výkonnosť represora in vivo, tím podal myšiam orálne E. coli obsahujúci represorový obvod, potom analyzovali baktérie extrahované zo vzoriek stolice. Represilátor zostal aktívny až 16 dní po zavedení, ukazuje, že dlhodobú expresiu oscilačného génu je možné udržať v črevných baktériách u živých cicavcov. Analýza RINGS úspešne detekovala zmeny v modeloch bakteriálneho rastu, a baktérie, ktorých represorové okruhy boli v rôznych fázach, bolo možné "synchronizovať" tak, že sa myšiam v ich pitnej vode podala zlúčenina, ktorá v danom štádiu zastavila represorový cyklus.

Nakoniec, vedci testovali schopnosť represora odhaliť rozdiely v rýchlosti rastu baktérií, ktoré boli pozorované v dôsledku zápalu čriev. Myšiam bola podaná zlúčenina vyvolávajúca zápal, nasledované baktériami nabitými represorom. Po 15 hodinách, Analýza RINGS ukázala, že baktérie zo myší so zápalom mali represory v širšom spektre fáz v porovnaní s baktériami z kontrolných myší, čo naznačuje, že zápal vytvára prostredie, ktoré spôsobuje nezrovnalosti v raste baktérií, potenciálne vedie k nerovnováhe v črevnom mikrobióme.

Tento represor nám umožňuje skutočne skúmať zložitosť bakteriálneho správania v živom čreve, nielen v zdravom, ale aj v chorobnom stave ale aj priestorovo a časovo. Skutočnosť, že môžeme znova synchronizovať represor, keď je už v čreve, udržiavať ju bez nutnosti podávať selektívne antibiotiká, tiež to znamená, že môžeme študovať mikrobióm v prirodzenejšom stave s minimálnym narušením. "

Pamela Silver, Ph.D., zodpovedajúci Autor, Člen základnej fakulty Wyss Institute, Elliot T. a Onie H. Adams profesor biochémie a systémovej biológie na HMS

Okrem pochopenia dynamiky mikrobiómu represor odblokuje potenciál pre komplex, diagnostika a terapeutika pre ľudské črevo založená na syntetickej biológii. Medzi potenciálne aplikácie patrí vytvorenie systému, ktorý je naprogramovaný tak, aby inicioval kaskádu transkripcie génov v určitom bode cirkadiánneho rytmu, alebo diagnostika, ktorá zaznamenáva, koľko času uplynulo po detekcii daného biomarkera.

„Tento výskum nerieši iba konkrétny problém súvisiaci s monitorovaním dynamických zmien vo fyziológii mikrobiómov v živom čreve, poskytuje platformu, ktorá by mohla viesť k úplne novým typom diagnostiky a dokonca aj k terapii závislej od času. “povedal zakladajúci riaditeľ Wyss Donald Ingber, M.D., Ph.D., ktorý je tiež Judah Folkman profesorom vaskulárnej biológie na HMS a programe vaskulárnej biológie v detskej nemocnici v Bostone, ako aj profesor bioinžinierstva na Harvardskej škole inžinierstva a aplikovaných vied Johna A. Paulsona.

• Brainový proteín hrá významnú úlohu pri udržiavaní chronickej bolesti
• Nový nástroj zaznamenáva a sleduje rast mikrobiómov