Plos ONE: Vascular CXCR4 Expression - roman antiangiogenetsko Target želodčnega raka

Povzetek

Ozadje

G-protein-vezanih receptorjev (GPCRs) so glavni kandidati za nove strategije za preprečevanje in zdravljenje raka. Iskali smo različno izraženih GPCRs v vozliščnih pozitivnih želodčnega karcinoma.

Metodologija /Glavne ugotovitve

diferenciala izraz GPCRs v tri vozlišča pozitivno vs tri vozlišča negativna črevesne tipa želodčni karcinomi so bili analizirani z gensko zaporedje tehnologijo. Kandidatke geni CXCL12 in njegov receptor CXCR4 bili potrjeni s sprotnim obratno prepisovanje verižni reakciji s polimerazo v samostojni sklop 37 želodčnega karcinoma. Prevod je raziskoval imunohistokemijo na 347 želodčnih karcinomov z uporabo tkiv mikromrež kot tudi v 61 ujemanja bezgavkah. Protein izraz je bila povezana z clinicopathological značilnosti bolnikov in preživetje. 52 GPCRs in povezane z GPCR geni so bili navzgor ali navzdol, urejena v vozlišču pozitivnega raka želodca, vključno CXCL12. Diferencialna ekspresija CXCL12 smo potrdili z RT-PCR in korelaciji z lokalnimi rast tumorja. CXCL12 immunopositivity je negativno povezano z oddaljenimi metastazami in tumorjev razredu. Samo 17% želodčnih karcinomov pokazala CXCR4 immunopositive tumorske celice, ki je bila povezana z večjo lokalno tumorja obsegu. 29% želodca karcinomov pokazala CXCR4 pozitivne tumorske microvessels. Vascular CXCR4 izraz je značilno povezana z večjo lokalno tumorja obsegu, kot tudi višje UICC-fazah. Ko se izraža tako, CXCL12 v tumorskih celicah in CXCR4 v tumorskih microvessels, ti tumorji so bili tudi zelo močno povezana z višjo T in UICC-fazah. Tri bezgavkah pokazala žilno CXCR4 medtem tumorske celice popolnoma manjkalo CXCR4 v vseh primerih. Izraz CXCL12 in CXCR4 ni vplivala na preživetje bolnikov.

Sklepi /Pomen

Naši rezultati utemeljiti pomen GPCRs o biologiji želodčnih karcinomov, in predložiti dokaze, da CXCL12-CXCR4 pot lahko nova obetavna antiangiogenskega tarča za zdravljenje želodčnih karcinomov

Navedba. Ingold B, Simon E Ungethüm U, Kuban RJ Müller BM, Lupp A, et al. (2010) Vascular CXCR4 Expression - roman antiangiogenetsko Target želodčnega raka? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10,1371 /journal.pone.0010087

Urednik: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong

Prejeto: 22. september 2009; Sprejeto: 16. marec 2010; Objavljeno: 8. april 2010

Copyright: © 2010 Ingold et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprta s sredstvi iz Berliner Krebshilfe (Berlin Canceraid). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden najpogostejših rakov po svetu, razvrstitev četrti celotne pogostosti in predstavljajo več kot 650.000 smrti vsako leto [1]. Umrljivost zaradi raka želodca se odlikuje samo s pljučnim rakom. Zgodnji rak želodca pogosto povzroča nobenih posebnih simptomov. Pomanjkanje zgodnjih simptomov zamude diagnoze. Zato je 80-90% zahodnih bolnikov z razjedo Trenutno raka z naprednimi tumorjev pri lokalnih ali oddaljenih zasevkov je že prišlo do [1]. Stanje bezgavko, zlasti razmerje metastaz pozitivnih /metastazami negativni bezgavke, je najmočnejši napovedni dejavnik za nastanek raka želodca [2]. Stopnja preživetja 5-letno pri bolnikih z 1-6 bezgavkah je 44% in se konča s samo 11% pri bolnikih z več kot 15 pozitivnih bezgavk. Delna ali popolna želodca, v kombinaciji z adjuvantno radioterapijo in /ali kemoterapijo, kot je navedeno, obljublja popolno ozdravitev le pri bolnikih z boleznijo v zgodnji fazi. V metastaz, ki se trenutno uporablja radioterapevtskih in kemoterapevtiki režimi imajo slabe učinkovitosti in zdravljenje odporne bolezni napredovanje povzroči smrt v nekaj [3] mesecev. Do sedaj, ne obstaja posebno predvidevanjem marker kot HER2 pri karcinoma dojke, EGFR v nedrobnocelični pljučni karcinom ali K-RAS v kolorektalnim karcinomom, ki omogoča bolj individualno terapevtsko strategijo. Zato so potrebne nove ciljno molekularno-terapevtskimi pristopi.

G-protein povezan receptorjev (GPCRs) predstavljajo daleč največji družino celični površini molekule, ki prenašajo signale preko GTP veže beljakovine (G-protein ) -initiated drugega obveščevalca kaskad v celici [4]. GPCRs so urejene številne agonisti, ampak vsi delijo značilno jedro sestavljeno iz sedmih transmembranski alfa-vijačnic, ki so povezane s tremi znotraj in tri zunajcelični zank. Ti receptorji nadzorujejo ključne fiziološke funkcije, vključno nevrotransmisije, hormonov in encimov, izpustitvi iz endokrinih in žleza z zunanjim izločanjem, imunski odziv, krčenje mišic in regulacijo krvnega tlaka, če naštejemo le nekatere [4].

Maligni celice pogosto vdora normalne fiziološke funkcije GPCRs za preživetje, razmnožujejo samostojno in se izognejo imunski sistem. Poleg GPCRs igrajo osrednjo vlogo pri tumorsko povzročene angiogenezo in raka metastaz. Mnogi solidni tumorji sklicevati na GPCRs da izzove angiogenski odziva, bodisi z delovanjem na endotelnih ali stromalnih komponent neposredno ali preko regulacije sproščanja ali aktivnosti drugih angiogenskih mediatorjev kot vaskularni endotelijski rastni faktor (VEGF) ali bazičnega fibroblastnega rastnega faktorja (bFGF), ki ga stromalni in imunske celice [5]. Rakave celice manipulirati GPCRs, da bi pritegnili endotelijske celice in jih vodijo na invazijo mase tumorja, pri čemer se tvori nova plovila, da zagotovi hranila in kisik. Veliko raka metastaze na določene organe, kar je pogosto, ki jih zmotno izražanje GPCRs povzročijo rakave celice - zlasti kemokine receptorjev - sočasno z izdajo Kemokini iz sekundarnih organov [6]

dobave drog, tumor slikanje. in biomarkerjev napovedovanje malignosti so aplikacije GPCRs ugotovijo: Radio-označenih peptidov, ki se vežejo na GPCRs bi lahko imela širše aplikacije za diagnosticiranje raka in zdravljenja [7]. Ligande, ki se vežejo GPCRs so konjugirana tudi citotoksini posebej ciljajo malignih celic, ki prekomerno teh receptorjev, torej zmanjšuje stranske učinke [8]. Poleg tega bi GPCRs dragoceni biomarkerjev za diagnozo raka, ki jih študij dokazano pri raku prostate [9].

Zato smo želeli (i) oceni različno izražene GPCRs v vozla negativen v primerjavi vozlišča pozitivne črevesne vrsta želodčnega raka, ki ga GeneChip matrika tehniko. (Ii) Transkripcija kandidatnih genih so potrdili v realnem času obrnjene transkripcijo verižne reakcije s polimerazo (real-time RT-PCR). Smo ocenili prevajanje in histoanatomical distribucijo kemokin CXCL12 in njegovo ustrezno kemokinom receptor CXCR4 na velike serije 347 želodca vzorcih karcinoma imunohistokemicno z uporabo tkiv mikromrež-tehnologijo, kot tudi v 61 ujemanja bezgavkah na običajnih diapozitive (iii). korelaciji smo translacijskih ekspresijskih vzorcev z obilno sklop clinicopathological značilnosti bolnikov, vključno preživetja bolnikov (iv).

Rezultati

diferenciala izražanje genov v vozlišču negativni in pozitivni vozlišče želodčni rak tkiva

Najprej smo raziskali diferencialno izražanje mRNA v seriji tipa 6 črevesne bolnikov želodca z rakom (3 s in 3 brez bezgavkah) z GeneChip® človeškega genoma U133 Plus 2.0 Array iz Affymetrix, ki zazna 47.000 prepisov in variant kakor tudi 38.500 dobro opisane človeške gene. mRNA smo ekstrahirali in prepišejo samo iz vzorcev tkiva, pridobljene iz primarnih tumorjev. Skupaj 115 transkriptov je bilo ugotovljeno, da je navzgor in 219, da bi navzdol regulirano v vozlišču pozitivnega raka želodca v primerjavi z vozlišči negativnimi želodca raka (tabela S1). Nato smo iskali različno izraženih GPCRs. Identificirali smo 52 GPCRs in povezane z GPCR genov, ki so bili gor ali dol, urejena s kratnim faktorjem spremembe na >. 1.5 (tabela S2)

V silicij
analize

potem smo iskali ENTREZ
bazo podatkov o " Nacionalni center za biotehnologijo informacije (NCBI)
" za vnosov za GPCRs in GPCR-ligandov in njihovi domnevni vlogi pri tumorski biologiji . Pomen angiotenzin tipa II 1-receptorja pri raku želodca je bila prej preveril naše skupine [10]. Številne študije so pokazale, da je izraz kemokinski receptorja Duffy krvnih skupin (DARC) obratno povezana z razširjenostjo in prognozo raka prostate [11] - [13]. V živalskem modelu raka dojke izraz EDG2 korelaciji s pojavnostjo pljučne metastaze [14]. FPRs posredujejo učinek aneksina 1 na celični gibljivost in invazije, ki so pomembne za metastatskega potenciala tumorskih celic [15]. LGR5 je bil pred kratkim pokazalo, da označevalec izvornih celic iz celic tankega in debelega črevesa in matičnih celic specifično izgubo rezultatov APC na postopno naraščajočih neoplazij [16]. Kolektivno, ti podatki predložiti dokaze, da je naš pristop prepoznavanje GPCRs in GPCR-ligande, ki lahko sodelujejo pri želodčnem biologije raka. V zvezi kemokina receptorje in kemokinov, so izraz Kemokini CCL2 in CXCL12 v vozlišča pozitivnega raka želodca poveča v primerjavi z vozliščih negativnih primerov (dodatna tabela S2). Ker CXCL12-CXCR4 os igra pomembno vlogo pri tumourigenesis, spodbuja angiogenezo in migracijo tumorskih celic metastatskih mest [17] - [19], smo izbrali CXCL12 in njegov receptor CXCR4 za nadaljnje analize

Transkripcija. CXCL12 in CXCR4 raka želodca

razlika izraz CXCL12- in CXCR4-mRNA so potrdili v realnem času RT-PCR v samostojni sklop 37 črevesne tipa vzorcih karcinoma želodca. Primerjali smo non-neoplastični sluznico s primarnega tumorja, kot tudi primarne tumorje vozlišča negativna s primarnimi tumorji vozlišča pozitivnih raka.

CXCL12 izraz je pomembno pri karcinomu želodca poveča v primerjavi z ne-neoplastične sluznice (p = 0,033 ). Potrjevanje podatkov matrike, je bil tudi CXCL12 izraz up-urejena v vozlišča pozitivnega raka želodca v primerjavi z vozliščih negativnih primerov. Vendar pa ta razlika ni dosegla statistične značilnosti (p = 0,132; slika 1a). Kar zadeva lokalno rast tumorja, ni bilo pomembne razlike v CXCL12 izražanja v PT1 /T2 stadiju tumorja v primerjavi PT3 /T4 tumorjev. Ampak zanimivo, CXCL12 izraz pokazala pomembno združenje v PT1 /pT2a primerjavi pT2b /T3 /T4 (p = 0,049; slika 1b)

Ni bilo niti razlika CXCR4 želodčnega raka v primerjavi z ne-tumorska tkiva. (p = 0,229), niti v vozla negativnega primerjavi vozlišča pozitivni želodčnega karcinoma (p = 0,22; slika 1c). Primerjava CXCR4 z lokalno tumorja meri raven CXCR4-mRNA povečala z lokalno rast tumorja. (P = 0,079; slika 1d)

Prevod CXCL12 pri karcinomu želodca, korelacija s clinicopathological parametri in preživetje analize

za prevod in histoanatomical distribucija CXCL12 je bil nato preučevali imunohistokemijo na 347 želodca vzorcih karcinoma. V 291 primerih je bila CXCL12 radioinkorporacijo ovrednotiti. Rakave celice izražena CXCL12 v 244 od 291 (84%) vzorcev. Močna citoplazemskega in membranska imunoreakcija opazili pri 143 (49%) primerih in šibko obarvanje v 101 (35%). 47 tumorji (16%) ni imela CXCL12-radioinkorporacijo. Vsi vzorci tumor pokazal izrazito CXCL12 pozitivnost od žilnih endotelijskih celicah, ki je služila kot notranja pozitivno kontrolo (slika 2a-c). Statistične analize so pokazale močno korelacijo med ekspresijo CXCL12 v tumorskih celicah in oddaljenih metastaz (p = 0,043), kot tudi tumorjev razred (p = 0,0064). Vsi drugi clinicopathological parametri pokazala nobene povezave z CXCL12 izražanja v tumorskih celicah (tabela 1). Ko deljenjem kohorte v dve skupini, tj črevesno tipa in karcinoma želodca difuzna tipa, ni bilo ugotovljeno korelacija med CXCL12 izražanja in katerikoli clinicopathological parameter nobeni skupini (podatki niso prikazani). Izraz CXCL12 v tumorskih celicah ni vplivala na preživetje bolnikov (celotna skupina: p = 0,830; črevesne vrsta raka: p = 0,766; difuzni tip raka: p = 0,817).

Prevod CXCR4 pri karcinomu želodca, korelacija z clinicopathological parametri in preživetje analize

Prevod CXCR4 smo preučevali tudi z imunohistokemijo. Radioinkorporacijo v tumorskih celicah je mogoče oceniti na 293 tumorskih vzorcev, od katerih je le 6 (2%) so pokazali nedvoumno membranskih obarvanje (kategorija 2+; slika 2d). Večina CXCR4 pozitiven tumorskih vzorcev je pokazala le šibek citoplazemske CXCR4 radioinkorporacijo (kategorija 1+, 44 primerov, 15%; slika 2e). Jedrska CXCR4 radioinkorporacijo niso opazili v vsakem primeru in vsak tip celic. Splošno za 83% (243 od 293) od želodca karcinomov so immunonegative za CXCR4, večina od njih prikazuje sočasno CXCR4 pozitivne levkocitov kot notranjo pozitivno kontrolo (slika 2f). Zanimivo je, kot smo že prej opazili kolorektalnih karcinomov, 86 293 želodčnih karcinomov (29%) je pokazala, CXCR4 pozitivne microvessels v strome tumorja z močnim CXCR4 radioinkorporacijo endotelijskih celic (slika 3a). Žilne narava teh občutljivih struktur je bila potrjena s CD34 imunskim barvanjem (3b slika).

Ko korelacijo CXCR4 v tumorskih celic z različnimi clinicopathological parametrov, je CXCR4 izraz značilno povezana z večjo lokalno tumorja obsegu (statusom T p = 0,030). Vendar pa ni bilo več združenja tumorskemu CXCR4 in drugih clinicopathological spremenljivk je pokazala (tabela 2). Pri analizi podskupino črevesnih vrste želodčnih karcinomov, niso bile združenja ugotovljeno z nobenim clinicopathological parameter (podatki niso prikazani).

Potem smo proučevali povezavo med CXCR4 v endotelijskih celicah (vaskularno CXCR4, vCXCR4) tumorja microvessels in različne clinicopathological parametri. Zanimivo je, da izraz CXCR4 v microvessels povezana zelo pomembno z lokalno rast tumorja (T-skupino; p = 0,0001), kot tudi s stopnjo UICC-tumor (p = 0,0059). Tudi v podskupinah črevesne vrste in razpršenega karcinom želodca tipa, je vCXCR4 izraz značilno povezana z lokalno tumorja obsegu (črevesne tip: p = 0,004; difuzna tipa: p = 0,030) in fazo UICC tumorja (intestinalnega tipa: p = 0,020) . Nadalje je vCXCR4 izraz značilno povezana s starostjo bolnikov (p = 0,0148) v celotni skupini (tabela 3).

analiza preživetja je pokazala, da je imel CXCR4 izraz v tumorskih celicah raka želodca kot tudi tumorskih microvessels nikakršnega vpliva . o preživetju

Sočasno CXCL12 /vCXCR4 izražanja v želodčni karcinom

Ker osi CXCL12-CXCR4 je bilo dokazano, da sodelujejo pri napredovanja tumorja [17] - [19], smo raziskovali povezavo sočasne izražanja CXCL12 in vCXCR4 z clinicopathological parametri. Dejansko je bila CXCL12-vCXCR4 pozitivni tumorji povezan z večjo lokalno tumorja mere (p = 0,0014) in višjih stopenj UICC (p = 0,017). Vendar pa ni vplivala na preživetje bolnikov, tudi v podskupinah črevesne in razpršeni raka tipa želodca.

Izražanje vzorec CXCL12 in CXCR4 pri prilagajanju bezgavkah

osi CXCL12-CXCR4 poročali so, da se vključijo v metastatskih procesov v različnih subjektov tumorjev. Zato smo preverili, CXCL12 in CXCR4 radioinkorporacijo v podskupini 61 ujemanja bezgavkah. CXCL12 izraz Pri vzorcu je bila na voljo za 46 metastaz. Na splošno so bili 4 bezgavkah CXCL12 negativno kot njihovo ustrezno primarnega tumorja. 40 bezgavkah jasno pokazala CXCL12 pozitivnosti po primarnega tumorja. Intenzivnost obarvanja je bilo zelo heterogeno kaže močno pozitivne tumorske celice, ki mejijo na rahlo obarvajo grozde tumor celic. Vendar dva metastaze pokazala CXCL12 radioinkorporacijo čeprav ni bil CXCL12 izraz odkriti v primarnega tumorja.

CXCR4 radioinkorporacijo je bila ocenjena na 54 bezgavkah. Zanimivo je, da nihče od njih ni kazala CXCR4. Tudi ti tumorji (n = 6), ki kaže tih CXCR4 pozitivnosti primarnega tumorja, manjkalo CXCR4 v ustreznih metastaz bezgavk. Vendar pa vsi bezgavkah jasno pokazala CXCR4 pozitivnih limfocitov, ki so služili kot notranji pozitivno kontrolo. Zanimivo je, da so bili intratumoural CXCR4 pozitivne microvessels v treh primerih zaznati.

Pogovor

G-protein-skupaj receptorji predstavljajo največji družino transmembranskih receptorjev. Pet odstotkov vseh človeških genov kodo za več kot 800 različnih GPCRs in približno 80 različnih ligandov so bili opredeljeni do zdaj [20]. GPCRs so najpogostejši farmakološke tarče v medicini, to je skoraj 30% vseh zdravil, usmerjena proti GPCRs. Dokazi se povečuje, da je lahko tudi GPCRs obetavne tarče za zdravljenja raka. V tej študiji smo želeli, da bi našli GPCRs, ki so različno izražene v vozliščnih pozitivnih želodčnih raka, zato se lahko štejejo kot prihodnjih ciljev za zdravljenje raka želodca. Našli smo 52 GPCRs in povezane z GPCR gene, ki so navzgor ali navzdol, urejena v vozlišču pozitivni primarni želodčnega tkiva raka v primerjavi z vozliščem negativnim rakom. Več od GPCRs bile prej pokazala, da se vključijo v tumorski biologiji, kot AT1R, EDG2, DARC in FPR1 [10] [11] [14] [15]. Najbolj zanimivo je, da naš seznam tudi LGR5 [16], ki je bil pred kratkim pokazalo, da je matična celica dvojno podajo v tankem črevesu in debelega črevesa. Nadalje, specifična izguba APC v LGR5-pozitivnih celic rezultatov postopoma raste neoplazij. Tako, silico
potrditev naših podatkih podpira hipotezo, da so GPCRs vpletena v tumorsko biologijo raka želodca.

Naša poznejše potrditvene študije z uporabo skupino neodvisnih bolnikov, je pokazala, da GPCR- ligand CXCL12 je izražena v tumorskih celicah večine želodčnih karcinomov. Poleg tega je CXCL12 izraz negativno povezano z oddaljenimi metastazami in tumorjev razredu. Nasprotno, samo 17% želodčnih karcinomov pokazala CXCR4 immunopositive tumorske celice, ki je bila povezana z večjo lokalno tumorja obsegu. Zanimivo je, da približno ena tretjina želodca karcinomov pokazala CXCR4 pozitivne tumorske microvessels. Vascular CXCR4 izraz je značilno povezana z večjo lokalno tumorja obsegu, kot tudi višje UICC-fazah. Ko se izraža tako, CXCL12 v tumorskih celicah in CXCR4 v tumorskih microvessels, ti tumorji so bili tudi močno povezana z višjo T in UICC-fazah, ki podpirajo vlogo osi CXCL12-CXCR4 v neoangiogenesis raka želodca.

med GPCRs, sistem kemokin pomembno prispeva k napredovanja tumorja z modulacijo lokalne vnetne reakcije, proliferacijo tumorskih celic, migracije in preživetje, kot tudi neoangiogenesis [4]. CXCR4 kemokin receptor je bila prvotno ugotovili, da regulira nastanitvi limfocitov pri vnetju in predstavlja co-receptorja za virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV) [21]. Fiziološko je os CXCL12, CXCR4 vključeni v migracijo embrionalnih celic centralnega živčnega sistema, kostnega mozga in srčne [22], [23]. To igra ključno vlogo pri metastatskih procesih, kot je prikazano na prsi [24], [25], jajčnikov [26] in raka prostate [27] in CXCL12 je zelo izražena v organih, ki so pogoste mesta oddaljenih zasevkov, kot pljučih, jetrih in limfa vozlišča [28]. V raka želodca, podatki o CXCL12-CXCR4 poti so redki [29]. Obstaja nekaj dokazov, da CXCR4 izražanje želodčne karcinomov bolj verjetno razvijejo peritonealno širjenje tumorja in maligni ascites vsebuje visoke koncentracije CXCL12 [30].

Če primerjamo naše podatke genskih nizov s tistimi, ki jih RT-PCR in imunohistokemija, da je zanimivo omeniti, da je razlika izraz CXCL12 v vozlišču pozitivnega raka želodca potrjena na transkripcijski vendar ne na translacijskih ravni. Tu je imunohistokemični odkrivanje CXCL12 v tumorskih celicah povezana le z oddaljenimi zasevki in tumorskega razreda, vendar ne z bezgavk širjenja. Vendar pa je bilo ugotovljeno, CXCL12, ne samo v tumorskih celicah, ampak tudi v endotelijskih in stromalnih celic [31], in splošno izražanja v predelu celotnem tkiva je težje oceniti z imunohistokemijo. Nasprotno, naša transkripcijske študije uporabljajo tkivnih homogenatov, ki združujejo vse CXCL12 izraža celice tumorja tkiva. Kljub temu pa je treba hraniti v mislih, da se gen prepis ne ujemajo vedno z mRNA prevajanja in da je tumor biološki učinek CXCL12 je lahko odvisna tudi od prisotnosti in histoanatomical distribucijo CXCR4. V podporo tej trditvi, smo lahko pokazali, da sočasno izražanje CXCL12 v tumorskih celicah in CXCR4 v tumorskih microvessels soodvisnih z lokalno rast tumorjev in fazo UICC tumorja.

Je bilo, da tumoural CXCR4 pozitivnost močno povezana z razvojem peritonealne karcinomatozo [30]. Poleg tega je bila močna CXCR4 izraz značilno povezana z bezgavkah, višjih stopnjah UICC in zmanjšano 5-letno stopnjo preživetja [32]. zdijo naši rezultati razlikujejo od teh prejšnjih študij. Pri ocenjevanju CXCR4 radioinkorporacijo v tumorskih celicah, so opazili nizko stopnjo izražanja. Le 17% vzorcev tumorjev pokazala predvsem šibek CXCR4 radioinkorporacijo. Poleg tega so v vseh 61 ujemanja bezgavkah manjkalo CXCR4. Ta obarvanje vzorec lahko pojasni, zakaj na primer črevesnih tipa želodca karcinomov, CXCR4 izražanje le signifikantno povezana z lokalno rastjo tumorja (T kategorije), vendar ne z drugimi clinicopathological dejavnikov, kot smo že prej opisali. Uporabili smo temeljito značilna CXCR4 protitelesa z večjo specifičnostjo kot komercialno dostopnih protitelesa, kot je prikazano v Fisher in sodelavci [33]. Ta razlika v specifičnosti je lahko podlaga za različne vzorce barvanja. Na primer, CXCR4 izraz jedrsko, ki so poročali, da je povezana z bezgavkah v kolorektalnega raka, ni bila opažena v naši seriji [34]. Poleg tega nikoli ne odkrijejo CXCR4 pozitivnosti v stromalnih celicah, kot je opisano v študiji Saigusa in sodelavci [35]. Da bi razjasnili, če CXCR4-CXCL12 pot v končni fazi prispeva k generacijo metastaz v karcinom želodca, predvsem bezgavkah, so potrebne nadaljnje študije.

Približno ena tretjina pregledanih želodca karcinomov pokazala CXCR4 pozitivno tumorjem okoliško microvessels . Rakave celice potrebujejo ustrezno oskrbo s kisikom in hranilne snovi za ohranitev preživetja. Tudi z genetskimi motnjami, ki dysregulate rast in preživetje posameznih celic, tumorji ne more razširiti onkraj 1-2 mm ^{3 ne pride do vaskularizacijo in hipoksija povzroča celične smrti. Dokazano je, da je CXCR4 izražena z endotelijskih celic in stimulacijo CXCR4 z CXCL12 ima proangiogenic učinek [36]. Poleg tega CXCR4 je hipoksija inducibilni gen, ki ga predlaga, hipoksija povzročena faktorja 1 a (HIF1α) reguliran. Ko je kisik malo kot v hitro rastočih tumorjev, HIF1α povečuje izraz CXCR4 [37]. Povečana ekspresija CXCR4 v endotelialnih celicah opazili v našem tumorja kolektivu lahko del celostnega hipoksične odziva rastočega tumorja, ki dopušča nastanek novih krvnih žil. V naši raziskavi skupini, vaskularne CXCR4 izraz močno povezana z obsegom lokalnega rasti tumorja. V 8% T1 /pT2a tumorjev (4 od 52) in v 34% T2B /T3 /PT4 tumorjev (81 od 239) so bili CXCR4 pozitivne microvessels zaznati. T2B /T3 /T4 faze želodčni karcinomi bolj verjetno pristana hipoksični mikrookolje kot T1 /T2A fazi tumorjev in tako lahko povzročijo CXCR4 izražanje genov in angiogenezo. Odkrivanje CXCR4 pozitivnih microvessels v velikih bezgavkah (> 9 mm v premeru) potrdili te ugotovitve. Poleg tega smo že pokazale primerljive rezultate kolorektalnega raka [38]. Poleg tega, kot je prikazano v glioblastoma multiforme [39], vzorci tumorske razkrivajo tako, CXCL12 pozitivne tumorske celice in CXCR4 pozitivne microvessels bile zelo močno povezana z visoko lokalno tumorja obsegu in visoke stopnje UICC nadalje podpirajo pomen a funkcionalnih osi CXCL12, CXCR4 pri želodca biologija raka}

Če povzamemo, smo pokazali, da so GPCRs različno izražena želodčnega tkiva raka in lahko prispeva k biologije tumorja. tumorji izražajo tako, CXCL12 v tumorskih celicah in CXCR4 v tumorju, ki obdaja microvessels, kažejo zelo pomembna povezava z lokalno rast tumorjev in UICC fazah. Ti rezultati, skupaj z našimi prejšnjimi podatki o kolorektalnega karcinoma, utemeljiti vlogo osi CXCL12-CXCR4 pri tumorja-neoangiogenesis v gastrointestinalnih tumorjev. CXCL12-CXCR4 pot lahko nova obetavna antiangiogenskega tarča za zdravljenje želodčnih karcinomov.

Materiali in metode

tumorjev vzorci

vzorce tkiva raka želodca so bili pridobljeni kirurško na Charité University Hospital Berlin (1995-2008). Sveže zamrznjeno tkivo 6 primerov raka črevesne tipa želodca je bila uporabljena za analizo GeneChip (vozla negativen: 3 bolnikov; vozla pozitivna: 3 bolniki, moški-moški-razmerje: 01:02). Neodvisna serija parnih rakavih in tumorjev, ki meji normalnih tkivih od 37 intestinalnega tipa želodca karcinomov je pregledal v realnem času RT-PCR (vozla negativen: 12 bolnikov; vozla pozitivna: 25 bolnikov;-moški-razmerje ženske: ~1:1 za podrobne karakteristike bolnikov glej tabelo S3). Za Imunohistokemične analize je bila preučena kohorte pacient 347 zaporednih bolnikov z rakom želodca, ki obsega 194 črevesno vrsto in 122 razpršene karcinomov tipa po klasifikaciji Lauren. 31 vzorci so pokazali druge histološke podtipe (npr mucinozni, cevni, nediferenciran). Na kratko, kohorta sestavljena iz 220 moških in 127 žensk. Povprečna starost bolnikov ob diagnozi je bila 64 let. Preživetje podatkov je na voljo od 196 teh bolnikov. Nadaljnji podatki za druge bolnike je manjkal, ker ti bolniki niso bili prebiva v bližini bolnišnice in so bili izgubljeni za spremljanje. Od 196 bolnikov, 124 umrlo med spremljanjem. Mediano spremljanje za tiste bolnike, še živeči na končne analize je bil 33 mesecev. 61 bolnikov, je bilo na voljo tkivo, ki se ujemajo bezgavkah (27 črevesne tip, 26 difuzna tipa, 8 drugih histoloških podtipa). Le pri bolnikih s histološko potrjenega raka želodca in ustrezno tkivo na voljo so bili vključeni. Bolniki z neoadjuvantly obdelanega želodca raka ali drugih znanih malignih obolenj so bili izključeni iz študije. Ta projekt je bil odobren s lokalnih odborov za etiko (ref. Številka EA1 /06/2004).

GeneChip analiza

Total RNA smo izolirali s fenolno-kloroformom uporabo mirVana ™ Mirna Izolacija Kit ( Ambion, Austin, ZDA). Kontaminira DNA smo odstranili z obdelavo DNaze (turbo DNAfree kit; Ambion, Austin, ZDA) pri 37 ° C za 30 minut. Uporabili smo GeneChip® človeškega genoma U133 Plus 2.0 nizi (Affymetrix, Santa Clara, CA, ZDA) v skladu s protokolom proizvajalca za analizo raven izražanja mRNA. Affymetrix GeneChip® Operacijski Software (GCOS 1.4) avtomatizira nadzor GeneChip® Fluidics postaje in GeneChip® Scanner 3000.

Bioinformatika

Neobdelani podatki so bili analizirani z Affymetrix GeneChip operacijski programski opremi (GCOS 1.4) je . Odkrivanje p-vrednost prepis določa klic odkrivanja, ki označuje, ali je prepis zanesljivo odkriti (p < 0,05; to) ali ni zaznal (odsoten). Da bi omogočili primerjavo med čipi so bili podatki stehtajo na globalni intenzivnosti 500. Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) in GeneSpring programski paket 7.2 (Silicon genetika, Redwood City, CA) so bile uporabljene za povprečne rezultate iz različnih vzorcev in opraviti statistično analiza za primerjavo med rakom želodca s (N1) in brez vozlov metastaz (N0) bezgavk. Podatki šest nizov smo normalizirali, da se upošteva spremenljivost hibridizacije za parih sonde in drugih hibridizacije artefaktov. Normalizacija je sestavljen iz naslednjih treh korakih: prvič, transformacije podatkov (set meritev manj kot 300,0 do 300,0); drugič, na čipu (normalizira vsak čip do 50. percentila opravljenih meritev iz tega čipa); in tretjič, na gen (normalizira vsak gen z mediano meritev za ta gen). Pokrovček sprememba je bila izračunana za vsak gen kot aritmetična sredina normaliziranih izražanja vrednosti N1, deljeno s aritmetična sredina normaliziranih izražanja vrednosti N0. Neobdelani podatki iz mikromrež poskusi so bili naloženi na Gene Expression Omnibus podatkovni (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc&acc=GSE17187).

Real-time reverzne transkriptaze verižno reakcijo s polimerazo

Za sintezo cDNA, 2 ig celotne RNA je bila reverzno prepisana z Omniscript RT Kit (Qiagen). Genov, specifičnih primerji je zasnoval BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Berlin, Nemčija). Primer sekvence so bile: CXCR4 5 'OAS CAG GTA GCA AAG TGA CG, 3' CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 'CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3'CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT OAS; beta-2 mikroglobulin 5 'ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA, 3' ATC TTC AAA SCT CCA TGA TG. Realnem času obratno transkriptaze verižna reakcija s polimerazo (Real-time RT-PCR) je bila izvedena s pomočjo kompleta QuantiTect ™ SYBR® Green PCR (Qiagen) in LightCycler sistem (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemčija). Primerjalne C _{t vrednosti so bile normalizirana tistemu v gospodinjstvu genov Beta2-mikroglobulin. Ni predloge nadzor (ni cDNA v PCR) smo izvedli za vsak gen za ugotavljanje nespecifično ali genomske pomnoževanja in premaz, dimerizacijo.}

Histologija

Za histološke analize vzorcev tkiva so bile določene v 10% nevtralizirani formalina in vdelali v parafin. Deparaffinized sekcije smo obarvali s hematoksilinom in eozinom. Želodčni karcinom je bil razvrščen v skladu s klasifikacijo Svetovne zdravstvene organizacije [1]. Oder pTNM je bila določena v skladu s smernicami UICC.

Tissue mikromrež gradnja

formalin-fiksno in vzorce tkiva, parafinske vgrajeni so bili uporabljeni za pridobivanje tkiv mikromrež kot je opisano prej [40], [41 ]. Na kratko, so bile izbrane tri do šest morfološko reprezentativne regije blokov parafin "darovalec".

• Plos ONE: Gene-Expression Podpisi lahko razlikujemo Rak želodca razredov in Stages
• Plos Genetics: MIR-218 zavira invazijo in metastaze želodca raka z usmerjanjem Robo1 Receptor