Ploche ONE: Cievne CXCR4 Expression - román antiangiogenetické Target v rakoviny žalúdka?

abstraktné

Pozadie

receptory G-proteínom spriahnuté (GPCR) sú hlavnými kandidátmi na nových stratégií prevencie a liečby rakoviny. Hľadali sme rozdielne vyjadrené GPCR v uzlových pozitívnych karcinómov žalúdka.

Metodické /hlavných zistení

Diferenciál expresie GPCR v troch uzla pozitívny versus tri uzlín negatívny črevnej typ žalúdočné karcinómy bola analyzovaná pomocou génovej poľom technológie. Kandidátnych génov CXCL12 a jeho receptor CXCR4 boli overené v reálnom čase s reverznej transkripčný PCR v samostatnej sade 37 žalúdočných karcinómov. Preklad bola študovaná imunohistochemicky v 347 žalúdočných karcinómov použitie tkanivových mikročipov, rovnako ako v 61 zodpovedajúcich metastáz lymfatických uzlín. Expresia proteínov bola korelované s klinicko-charakteristiky pacienta a prežitie. 52 GPCR a GPCR súvisiace gény boli up- alebo down-regulované v uzle pozitívnom karcinómom žalúdka, vrátane CXCL12. Diferenciálnej expresie CXCL12 bola potvrdená pomocou RT-PCR a korelované s lokálnym rastu nádoru. CXCL12 immunopositivity bol negatívne spojená s vzdialenými metastázami a grade tumoru. Iba 17% žalúdočných karcinómov ukázal CXCR4 immunopositive nádorové bunky, ktorá bola spojená s vyšším lokálnym rozsahu tumoru. 29% žalúdočných karcinómov ukázal CXCR4 pozitívne nádorové vlásočníc. Vaskulárne CXCR4 expresia bola významne spojená s vyšším lokálnym rozsahu tumoru, ako aj vyššiu UICC etáp. Pri vyjadrení oboch CXCL12 v nádorových bunkách a CXCR4 v nádorových mikrocievkach, tieto nádory boli tiež veľmi významne spojené s vyššou T- a UICC-fáz. Tri metastázy do lymfatických uzlín ukázalo, cievne CXCR4 expresiu, zatiaľ čo nádorové bunky úplne chýbala CXCR4 vo všetkých prípadoch. Expresie CXCL12 a CXCR4 nemala žiadny vplyv na prežitie pacienta.

Závery /Význam

Naše výsledky doložiť význam GPCR o biológii žalúdočných karcinómov a poskytujú dôkaz, že CXCL12-CXCR4 cesta môže byť nový sľubný cieľ pre antiangiogenetické liečbu žalúdočných karcinómov

Citácia :. Ingold B, Simon E, Ungethüm u, Kuban RJ, Müller BM, Luppi A, et al. (2010) Cievne CXCR4 Expression - román antiangiogenetické Target v rakoviny žalúdka? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10,1371 /journal.pone.0010087

Editor: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong

prijatá: 22.září 2009; Prijaté: 16. marca 2010; Uverejnené: 08.04.2010

Copyright: © 2010 Ingold et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený dotácií z Berliner Krebshilfe (Berlín Canceraid). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je jedným z najčastejších nádorových ochorení na svete, zaujíma štvrté miesto v celkovom frekvenciu a účtovania pre viac ako 650.000 úmrtí ročne [1]. Úmrtnosť na rakovinu žalúdka je vynikal iba rakoviny pľúc. Predčasné rakovina žalúdka často spôsobuje žiadne špecifické príznaky. Nedostatok skoré príznaky oneskoruje diagnózu. V dôsledku toho 80 až 90% západných pacientov s rakovinou žalúdka darček s pokročilými nádormi pri lokálnej alebo vzdialenej metastázy už [1] došlo. Stav lymfatických uzlín, najmä pomer metastáz pozitívnych /negatívnych metastáz lymfatických uzlín, je najsilnejší prognostický faktor karcinómu žalúdka [2]. Miera prežitia 5 rokov u pacientov s 1 až 6 lymfatických uzlín, je 44% a končiac u pacientov s iba 11% s viac než 15 pozitívnych lymfatických uzlín. Čiastočné alebo úplné gastrektómii, v kombinácii s adjuvantnej rádioterapii a /alebo chemoterapii, ako je uvedené, sľubuje úplné vyliečenie len u pacientov so skorými štádiu ochorenia. V metastatického ochorenia, v súčasnej dobe používa rádioterapeutickej a chemoterapeutickej režimy majú zlú účinnosť a choroby odolné ošetrenie postup vedie k smrti v priebehu niekoľkých mesiacov [3]. K dnešnému dňu neexistuje žiadna konkrétna prediktívneho markeru ako HER2 u karcinómu prsníka, EGFR v non-malobunkovým karcinómom pľúc alebo K-RAS v kolorektálnym karcinómom, ktorý umožňuje väčšiu individuálnu liečebnú stratégiu. Preto sú potrebné nové molekulárno-cielené liečebné prístupy.

G-proteínom spriahnuté receptory (GPCR) predstavujú zďaleka najväčšiu rodinu bunkových povrchových molekúl, ktoré prenášajú signály cez GTP-väzbové proteíny (G-proteínom ) -initiated druhého posla kaskád do bunky [4]. GPCR sú regulované mnohými agonistov, ale všetci zdieľajú charakteristický jadro zložené zo siedmich transmembránových alfa-skrutkovíc, ktoré sú napojené cez tri vnútri aj tri extracelulárnej slučky. Tieto receptory Ovládacie tlačidlo fyziologických funkcií, vrátane neurotransmisie, hormónov a uvoľnenie enzýmu z endokrinné a exokrinné žľazy, imunitných reakcií, svalové kontrakcie a regulácii krvného tlaku aby sme vymenovali aspoň niektoré [4].

Zhubné bunky často uniesť fyziologickom funkcie GPCR prežiť, množiť autonómne a vyhnúť sa imunitný systém. Ďalej GPCR hrajú ústrednú úlohu v angiogenézu indukovanú nádorom a nádorových metastáz. Mnoho solídne nádory spolieha na GPCR k vyvolaniu angiogénny odozvy a to buď tým, že pôsobí na endotelových alebo stromálne komponentov priamo alebo prostredníctvom regulácie uvoľňovania alebo pôsobenia iných angiogénnych mediátorov, ako je vaskulárny endotelové rastový faktor (VEGF) alebo bázický fibroblastový rastový faktor (bFGF) o stromálne bunky imunitného systému a [5]. Rakovinové bunky manipulovať s GPCR, aby prilákali endotelové bunky a viesť ich k invázii nádoru, čím sa vytvorí nové plavidlá poskytovať živiny a kyslík. Rad ochorení metastázujú do špecifických orgánov, čo často je spôsobené tým, aberantne expresie GPCR v rakovinových bunkách - predovšetkým chemokinových receptorov - súčasne s uvoľnením chemokiny zo sekundárnych orgánov [6]

pre podanie liečivá, zobrazovanie nádorov. a biomarkery predpovedajúci malignity sú aplikácie GPCR k poukázanie: Radio-značených peptidov, ktoré sa viažu na GPCR môžu mať široké aplikácie pre diagnostiku a liečbu rakoviny [7]. Ligandy, ktoré sa viažu GPCR boli tiež konjugované s cytotoxickými látkami sa špecificky zameriava na malígne bunky, ktoré nadmerne exprimujú tieto receptory, čím sa znižuje vedľajšie účinky, [8]. Okrem toho, GPCR môže byť cennými markery pre diagnózu rakoviny, čo bolo preukázané štúdiami pri karcinóme prostaty [9].

Preto sme sa zamerali na (i) vyhodnotenie rozdielne exprimovaných GPCR v uzlových záporná proti uzlového pozitívny intestinálneho typu karcinómu žalúdka u GeneChip poľa technikou. (Ii) Transkripcia kandidátnych génov bola overená v reálnom čase s reverznej transkripcie PCR v reálnom čase (RT-PCR). Hodnotili sme preklady a histoanatomical rozdelenie chemokiny CXCL12 a jeho zodpovedajúce receptor chemokínu CXCR4 vo veľkých sérií 347 vzoriek karcinómu žalúdka imunohistochemicky s využitím mikroskopické sústavy tkanív-technológiu, rovnako ako v 61 zodpovedajúcich metastáz do lymfatických uzlín na konvenčných sklíčka (III). korelované sme translačný expresné vzorce s bohatou sadou klinicko-charakteristiky pacienta, vrátane prežitie pacienta (iv).

Výsledky

diferenciálnej génovej expresie v uzle negatívne a pozitívne uzol rakovina žalúdka tkanivo

Najprv sme študovali diferenciálnej expresiu mRNA v sérii typu 6 črevnej pacientov s rakovinou žalúdka (3 s a 3 bez metastáz lymfatických uzlín), za použitia GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array od Affymetrix, ktorý detekuje 47.000 prepisy a varianty rovnako ako 38.500 dobre charakterizuje ľudské gény. mRNA bola extrahovaná a prepíše sa len z tkanivových vzoriek získaných z primárnych nádorov. Zistilo sa celkom 115 transkriptov byť hore a 219, že je down-regulovaná v uzle pozitívneho karcinómu žalúdka v porovnaní s negatívnymi uzlov karcinómov žalúdka (tabuľka S1). Ďalej sme hľadali odlišne exprimovaných GPCR. Identifikovali sme 52 GPCR a GPCR súvisiace gény, ktoré boli up- alebo down-regulovaná s násobnou zmenu faktora >. 1.5 (tabuľka S2)

In silico analýza

potom sme prehľadali Entrez
dátová základňa z " National Center for Biotechnology Information (NCBI)
" Žiadosť o zápisy týchto GPCR a GPCR ligandov a ich domnelej úlohu v nádorovej biológii , Význam pre angiotenzín II typu 1 receptora v karcinómu žalúdka bol predtým overená našej skupiny [10]. Niekoľko štúdií ukázalo, že expresia receptora chemokiny Duffy krvné skupiny (DARC) koreluje nepriamo úmerne s prevahou a prognózu rakoviny prostaty [11] - [13]. Vo zvieracom modeli rakoviny prsníka je expresia EDG2 koreluje s výskytom pľúcnych metastáz [14]. FPRs sprostredkovávajú účinok annexin 1 na bunkovú pohyblivosť a invázie, ktoré sú dôležité pre metastatického potenciálu nádorových buniek [15]. LGR5 bolo v poslednej dobe dokázané, že kmeňová bunka marker buniek tenkého čreva a hrubého čreva a kmeňových buniek špecifickú stratu výsledkov APC v postupne rastúcich neoplázie [16]. Kolektívne, tieto údaje poskytujú dôkaz, že náš prístup identifikované GPCR a GPCR ligandy, ktoré môžu byť zapojené do žalúdka biológii rakoviny. Pokiaľ ide o receptor chemokínu a chemokiny, expresie chemokiny CCL2 a CXCL12 boli v uzlových pozitívnom karcinómom žalúdka vyššia v porovnaní s uzlových negatívnych prípadoch (doplňujúce tabuľke S2). Vzhľadom na to, že os CXCL12-CXCR4 hrá významnú úlohu v tumorogenézy podporu angiogenézy a migráciu nádorových buniek do metastatických miest [17] - [19], sme vybrali CXCL12 a jeho receptor CXCR4 pre ďalšie analýzy

Transkripcia. CXCL12 a CXCR4 u karcinómu žalúdka

diferenciálnej expresie CXCL12- a CXCR4-mRNA bola overená v reálnom čase RT-PCR v samostatnej sade vzoriek karcinómu žalúdka 37 črevnej typu. Porovnávali sme nenádorových sliznice sa primárneho nádoru, rovnako ako primárne nádory uzla negatívny primárnych nádorov pozitívnych nádorov uzlín.

CXCL12 Expresia bola významne zvýšená v karcinómu žalúdka v porovnaní s non-neoplastických sliznice (p = 0,033 ). Potvrdenie dátumu poľa, CXCL12 výraz bol tiež up-regulovaná v uzlových pozitívneho karcinómu žalúdka v porovnaní s uzlovými negatívnych prípadoch. Avšak, tento rozdiel nedosiahol štatistickú významnosť (p = 0,132; obrázok 1a). Pokiaľ ide o miestnu rast nádoru, nebol zistený žiadny významný rozdiel v expresii v CXCL12 PT1 /T2 štádiu nádoru v porovnaní s PT3 /T4 nádorov. Ale je zaujímavé, CXCL12 výrazom ukázala významný vzťah v pt1 /pT2a proti pT2b /T3 /T4 (p = 0,049; obr 1b)

K dispozícii nebol ani rozdiel CXCR4 prejavu v karcinómu žalúdka v porovnaní s non-neoplastické tkaniva. (p = 0,229), ani v uzlových záporná proti uzlového pozitívneho karcinómu žalúdka (p = 0,22; obrázok 1C). Porovnanie CXCR4 výraz s miestnym rozsahu tumoru, hladiny CXCR4-mRNA zvýšená s miestnou rastu nádoru. (P = 0,079; Obrázok 1d)

Preklad CXCL12 v karcinómu žalúdka, korelácia s klinicko-parametrami a prežitie analýzy

preklad a histoanatomical distribúcia CXCL12 bol následne študoval imunohistochemicky v 347 vzorkách karcinómu žalúdka. V 291 prípadoch, CXCL12 imunoreaktivita bola vyhodnotiť. Nádorové bunky vyjadrené v CXCL12 244 z 291 (84%) vzoriek. Silný cytoplazmatický a membranózna Imunoreakce bolo pozorované u 143 (49%) prípadov a slabé farbenie v 101 (35%). 47 nádorov (16%) chýbalo CXCL12-imunoreaktivitu. Všetky vzorky nádorov vykazovali zreteľnú CXCL12 pozitivitu na bunkách cievneho endotelu, ktorý slúžil ako vnútorný pozitívne kontroly (obrázok 2a-c). Štatistické analýzy ukázali významnú koreláciu medzi expresiou CXCL12 v nádorových bunkách a vzdialených metastáz (p = 0,043), tak aj stupeň nádoru (p = 0,0064). Všetky ostatné klinicko-patologické parametre nevykazovali žiadnu spojitosť s CXCL12 expresiu v nádorových bunkách (tabuľka 1). Pri delení kohortu do dvoch skupín, tj. Črevné typ a difúzny typ karcinóm žalúdka, bola zistená žiadna korelácia medzi expresiou CXCL12 a akékoľvek klinicko parameter oboch skupín (údaje nie sú uvedené). CXCL12 expresie v nádorových bunkách nemala žiadny vplyv na prežitie pacienta (celá skupina: p = 0,830; karcinóm čriev Typ: p = 0,766; difúzny karcinóm typu: p = 0,817).

Preklad CXCR4 v karcinómu žalúdka, korelácie s klinicko-parametrami a prežitie analýzy

Preklad CXCR4 skúmal aj imunohistochemicky. Imunoreaktivitu v nádorových bunkách bolo vyhodnotiť v 293 nádorových vzoriek, z ktorých iba 6 (2%) sa dosiahla jednoznačné membranózna farbenie (kategória 2+, obr 2d). Väčšina pozitívnych nádorových vzoriek CXCR4 len odhalilo slabú cytoplazmatickú CXCR4 imunoreaktivitu (kategória 1+, 44 prípadov, 15%; postavou 2e). Nukleárna CXCR4 imunoreaktivita nebola pozorovaná v žiadnom prípade a každý typ buniek. Celkovo 83% (243 293), žalúdočných karcinómov boli immunonegative pre CXCR4, väčšina z nich ukazuje súbežne CXCR4 pozitívne leukocytov ako vnútorný pozitívne kontroly (obrázok 2f). Zaujímavé je, ako už bolo pozorované u kolorektálny karcinómy, 86 293 žalúdočných karcinómov (29%) ukázala, CXCR4 pozitívne mikrociev v nádorovom stróma so silnou CXCR4 imunoreaktivity endoteliálnych buniek (obrázok 3a). Vaskulárne povaha týchto jemných štruktúr bola potvrdená CD34 imunobarvením (obrázok 3b).

Pri koreláciu CXCR4 expresiu v nádorových bunkách s rôznymi parametrami klinicko, CXCR4 expresia bola významne spojená s vyšším lokálnym rozsahu tumoru (T-stav; p = 0,030). Avšak, žiadne ďalšie združenia nádorové CXCR4 prejavu a ďalších veličín klinicko boli nájdené (tabuľka 2). Pri analýze podskupinu črevných karcinómov žalúdka typu, žiadna asociácie boli nájdené s ľubovoľným klinicko parametra (dáta nie sú uvedené).

Potom sme študovali koreláciu medzi CXCR4 expresiu v endotelových bunkách (vaskulárne CXCR4 prejavu, vCXCR4) nádoru mikrociev a rôzne klinicko-patologické parametre. Je zaujímavé, že expresia CXCR4 v mikrocievkach koreluje vysoko významne s miestnou rastu nádoru (T-skupiny; p = 0,0001), rovnako ako s fáza-UICC nádoru (p = 0,0059). Dokonca aj v podskupín črevnej typu a difúzneho typu karcinómu žalúdka, vCXCR4 expresia bola významne spojená s lokálnym rozsahu tumoru (črevná symbol: p = 0,004; rozptyľovať symbol: p = 0,030) a fázu UICC nádoru (typ trakt: p = 0,020) , Ďalej vCXCR4 expresia bola významne spojené s vekom (p = 0,0148) v celej skupine (tabuľka 3).

Survival analýza ukázala, že CXCR4 expresie v nádorových bunkách karcinómu žalúdka, ako aj v nádorových mikrocievkach nemal žiadny vplyv . o prežitie

Aktuálne CXCL12 /vCXCR4 expresie v karcinómu žalúdka

Vzhľadom k tomu, osi CXCL12-CXCR4 ukázalo sa, že sa podieľa na progresiu nádoru [17] - [19], sme skúmali súvislosť o súčasnom vyjadrenie CXCL12 a vCXCR4 s klinicko-parametrami. V skutočnosti, CXCL12-vCXCR4 pozitívne nádory boli spojené s vyšším lokálnym rozsahu tumoru (p = 0,0014) a vyšším stupňom UICC (p = 0,017). Avšak, to nemá žiadny vplyv na prežitie pacientov, a to aj v podskupín črevné a difúzneho karcinómu žalúdka typu.

Expression vzor CXCL12 a CXCR4 v zodpovedajúcej metastáz v lymfatických uzlinách

osi CXCL12-CXCR4 bola hlásená byť zapojený do metastatických procesov v najrôznejších nádorových entít. Preto sme skúmali CXCL12 a CXCR4 imunoreaktivitu v podskupine 61 zodpovedajúcich metastáz lymfatických uzlín. CXCL12 výraz vzor bol k dispozícii pre 46 metastáz. Celkovo možno povedať, 4 lymfatických uzlín boli CXCL12 negatívne rovnako ako ich zodpovedajúce primárny nádor. 40 lymfatických uzlín jasne ukazuje CXCL12 pozitivity podľa primárneho nádoru. Intenzita sfarbenia bola veľmi rôznorodá ukazuje silne pozitívne nádorové bunky priľahlé k slabo zafarbia nádorových buniek zoskupení. Avšak dve metastázy vykazovali CXCL12 imunoreaktivitu aj keď bola zistená žiadna expresia CXCL12 v primárnom nádore.

CXCR4 imunoreaktivita bola hodnotená v 54 metastáz lymfatických uzlín. Je zaujímavé, že nikto z nich neprejavili žiadne CXCR4 výraz. Aj tie nádory (n = 6), čo ukazuje slabý CXCR4 pozitivitu na primárnom nádoru, chýbala CXCR4 expresiu v zodpovedajúcich metastáz lymfatických uzlín. Avšak, všetky lymfatických uzlín jednoznačne odhalili CXCR4 pozitívnych lymfocytov, ktoré slúžili ako vnútorná pozitívna kontrola. Je zaujímavé, že v troch prípadoch intratumoural CXCR4 pozitívny mikrociev boli detekovateľné.

Diskusia

G-proteín-receptorov spriahnutých predstavujú najväčšiu rodinu transmembránových receptorov. Päť percent všetkých ľudských génov kódu pre viac ako 800 rôznych GPCR a približne 80 rôznymi ligandmi boli identifikované až doteraz [20]. GPCR sú najčastejšie farmakologické ciele v lekárstve, tj. Takmer 30% všetkých liekov sú namierené proti GPCR. Dôkaz, sa zvyšuje, že GPCR môže byť sľubné ciele pre terapiu rakoviny. V tejto štúdii sme sa zamerali nájsť GPCR, ktoré sú rozdielne exprimované v uzle pozitívnych karcinómov žalúdka, a teda môžu byť považované za budúce ciele pre liečbu rakoviny žalúdka. Zistili sme, 52 GPCR a GPCR súvisiace gény, ktoré sú up- alebo down-regulované v uzle pozitívnej primárnej tkaniva karcinómu žalúdka v porovnaní s negatívnym uzla rakovinou. Niekoľko GPCR bolo skôr preukázané, že je zapojený do nádorovej biológie, ako je AT1R, EDG2, DARC a FPr1 [10], [11], [14], [15]. Veľmi zaujímavé je, náš zoznam tiež LGR5 [16], ktorý bol v poslednej dobe dokázané, že kmeňové bunky markerom v tenkého a hrubého čreva. Okrem toho špecifická strata APC v LGR5-pozitívnych buniek má za následok progresívne rastúci novotvarov. Tak, in silico
validáciu našich dát podporuje hypotézu, že GPCR sú zapojené v nádorovej biológie karcinómu žalúdka.

Naše ďalšie overovacej štúdie využívajúce skupinu nezávislých pacientov ukázali, že GPCR- ligand CXCL12 je exprimovaný v nádorových bunkách väčšiny karcinómov žalúdka. Okrem toho, CXCL12 výraz je negatívne spojené s vzdialenými metastázami a grade tumoru. Naopak, iba 17% karcinómov žalúdka ukázala, CXCR4 immunopositive nádorové bunky, ktorá bola spojená s vyšším lokálnym rozsahu tumoru. Je zaujímavé, že asi tretina z žalúdočných karcinómov ukázalo, CXCR4 pozitívne nádorové mikrociev. Vaskulárne CXCR4 expresia bola významne spojená s vyšším lokálnym rozsahu tumoru, ako aj vyššiu UICC etáp. Pri vyjadrení oboch CXCL12 v nádorových bunkách a CXCR4 v nádorových mikrocievkach, tieto nádory boli tiež významne spojená s vyššou T- a UICC-fáz, podporujúce úlohu osi CXCL12-CXCR4 v patologickej angiogenézu karcinómu žalúdka.

medzi GPCR, chemokiny systém významne prispieva k progresii nádoru prostredníctvom modulácie lokálne zápalové reakcie, proliferácie nádorových buniek, migrácie a prežitia, rovnako ako patologické angiogenézu [4]. Receptor chemokínu CXCR4 na počiatku bolo zistené, že regulovať homing lymfocytov v zápalu a predstavuje čo-receptor pre vírusom ľudskej imunitnej nedostatočnosti (HIV) [21]. Fyziologicky, os CXCL12-CXCR4 sa zúčastňuje migrácie embryonálnych bunkách centrálneho nervového systému, kostnej drene a srdca [22], [23]. To zohráva kľúčovú úlohu v metastatických procesoch, ako je znázornené na prsníku [24], [25], vaječníkov [26], a rakoviny prostaty [27] a CXCL12 je vysoko exprimovaný v orgánoch, ktoré sú časté miest vzdialených metastáz, ako sú pľúca, pečeň a lymfy uzly [28]. V karcinómu žalúdka, údaje týkajúce sa CXCL12-CXCR4 dráhy sú zriedkavé [29]. Existujú určité dôkazy, že CXCR4 exprimujúce karcinómy žalúdka s väčšou pravdepodobnosťou vyvinúť peritoneálnej šírenie nádoru, a malígne ascites obsahuje vysoké koncentrácie CXCL12 [30].

Porovnanie naše dáta génových poľa s výsledkami získanými pomocou RT-PCR a imunohistochémia, bolo zaujímavé, že diferenciálnej expresie CXCL12 v uzle pozitívneho karcinómu žalúdka bola potvrdená na transkripčný, ale nie na úrovni translácie. Tu je imunohistochemická detekcia CXCL12 v nádorových bunkách koreluje iba so vzdialenými metastázami a grade tumoru, ale nie s uzlového rozpätia. Avšak, CXCL12 bolo zistené, že iba v nádorových bunkách, ale aj v endoteliálnych a stromálnych buniek [31], a celkového výrazu v celom priestore tkaniva je ťažké posúdiť pomocou imunohistochémia. Naopak, naša štúdia transkripčný používa tkanivové Homogenát, ktoré integrujú všetky CXCL12 exprimujúce bunky nádorovom tkanive. Je však potrebné mať na pamäti, že transkripcia génov nie je vždy v korelácii s translácie mRNA a že nádor biologický účinok CXCL12 môže tiež závisieť od prítomnosti a histoanatomical distribúciu CXCR4. Na podporu tohto tvrdenia, sme boli schopní ukázať, že súčasné expresiu CXCL12 v nádorových buniek a CXCR4 v nádorových vlásočníc korelácii s miestnou rastu nádoru a UICC-štádiom nádoru.

Bolo oznámené, že tumoru CXCR4 pozitivita významne koreluje s vývojom peritoneálnej karcinosou [30]. Navyše, silná CXCR4 expresia bola významne spojená s metastáz do lymfatických uzlín, vyšším stupňom UICC a zníženej prežitie 5 rokov [32]. Naše výsledky sa zdajú líšiť od týchto predchádzajúcich štúdií. Pri vyhodnocovaní CXCR4 imunoreaktivitu v nádorových bunkách, bola pozorovaná nízka miera expresie. Iba 17% nádorových vzoriek vykazovali väčšinou slabý CXCR4 imunoreaktivitu. Okrem toho, všetky zodpovedajúce 61 lymfatických uzlín chýbala CXCR4 výraz. Tento vzorec farbenia môže vysvetľovať, prečo sa napríklad v črevných karcinómov žalúdka typu, CXCR4 expresia iba významne spojená s miestnou rastu nádoru (T-kategória), ale nie s inými faktormi, klinicko ako bolo popísané vyššie. Použili sme úplne vyznačujúci CXCR4 protilátka s vyššou špecifickosťou než komerčne dostupných protilátok, ako je znázornené Fisher et al [33]. Tento rozdiel v špecifickosti môže slúžiť pre rôzne vzory farbenie. Napríklad jadrový výraz CXCR4, ktorý bol zaznamenaný byť spájaný s metastáz lymfatických uzlín u kolorektálneho karcinómu, nebola pozorovaná séria [34]. Okrem toho, nikdy detekovaná CXCR4 pozitivity vo stromálne bunky, ako je opísané v štúdii Saigusa et al [35]. Na objasnenie, ak sa CXCR4-CXCL12 cesta v konečnom dôsledku prispieva k tvorbe metastáz pri rakovine žalúdka, a to najmä metastáz lymfatických uzlín, sú potrebné ďalšie štúdie.

Približne jedna tretina skúmaných žalúdočných karcinómov ukázal CXCR4 pozitívny tumour- okolité vlásočníc , Nádorové bunky vyžadujú dostatočný prísun kyslíka a živín na udržanie prežitie. Aj s genetickými abnormalitami, že dysregulate rast a prežitie jednotlivých buniek, môže nádory nezväčšuje za 1-2 mm ^{3, bez toho, aby krvné zásobenie a hypoxiou indukovanú bunkovú smrť nastane. Bolo preukázané, že CXCR4 je exprimovaný endotelových bunkami a stimuláciu CXCR4 tým, CXCL12 má proangiogenic účinok [36]. Okrem toho, CXCR4 je hypoxia indukovatelný gén, regulovaný faktora 1α hypoxiou indukovanú (HIF1α). Keď kyslík je vzácny rovnako ako v rýchlo rastúcich nádorov, HIF1α zvyšuje výraz CXCR4 [37]. Zvýšená expresia CXCR4 v endotelových bunkách pozorovaných v našej nádoru kolektíve môže byť súčasťou integrovaného hypoxické reakcii na rastúci nádor, ktorý umožňuje tvorbu nových krvných ciev. V našej študijnej skupine, vaskulárne CXCR4 expresia významne koreluje s rozsahom miestnej rastu nádoru. V 8% nádorov T1 /pT2a (4 z 52), a v 34% T2b /T3 /PT4 nádorov (81 239), CXCR4 pozitívny mikrociev boli detekovateľné. T2b /T3 /T4-predstaviť žalúdočné karcinómy s väčšou pravdepodobnosťou skrývajú hypoxické mikroprostredie než T1 /T2A štádiu nádoru a tým by mohol vyvolať CXCR4 génovú expresiu a angiogenézy. Detekcia CXCR4 pozitívny mikrocievkach vo veľkých lymfatických uzlín (viac ako 9 mm v priemere) potvrdzuje tieto pozorovania. Ďalej sme už skôr preukázané, porovnateľné výsledky v kolorektálnym karcinómom [38]. Okrem toho, ako je znázornené na glioblastoma multiforme [39], nádorové vzorky odhaľujúce obaja, CXCL12 pozitívnych nádorových buniek a CXCR4 pozitívny mikrocievkach boli veľmi významne spojená s vysokou miestnou rozsahu tumoru a vysokých stupňoch UICC, čo ďalej podporuje význam funkčnej osi CXCL12-CXCR4 v karcinómu žalúdka biológie}

v súhrne sme sa ukázať, že GPCR sú odlišne exprimované v tkanive karcinómu žalúdka a môže prispievať k biológii nádoru :. nádory exprimujúce oba, CXCL12 v nádorových bunkách a CXCR4 v nádoru okolitej mikrocievkach, vykazujú vysoko významná súvislosť s miestnou rastu nádoru a fáz UICC. Tieto výsledky, spolu s našimi predchádzajúcimi údajmi o kolorektálnym karcinómom, doložiť rolu osi CXCL12-CXCR4 nádorové-patologické angiogenézu v gastrointestinálnych nádorov. CXCL12-CXCR4 dráha môže byť nový sľubný cieľ pre antiangiogenetické liečbu žalúdočných karcinómov.

Materiály a metódy

Vzorky nádorov

Vzorky tkaniva karcinómu žalúdka boli získané chirurgicky fakultnej nemocnice Charité Berlín (1995-2008). Čerstvé mrazená tkanivo zo 6 prípadov karcinómu žalúdka intestinálneho typu bol použitý pre analýzu GeneChip (uzlový negatívny: 3 pacientov; uzlový pozitívne: 3 pacientov, žena-muž-pomer: 01:02). Nezávislá séria párových rakovinových a nádorových-priľahlé normálne tkanivá od 37 intestinálneho typu žalúdočné karcinómy boli skúmané pomocou real-time RT-PCR (uzlový negatívny: 12 pacientov; uzlový pozitívne: 25 pacientov; samičie samčie pomer: ~ 1: 1 pre podrobnejšie údaje pacientov viď tabuľka S3). Pre imunohistochemických analýz bol skúmaný kohorta pacient zo 347 po sebe idúcich pacientov s rakovinou žalúdka, zahŕňajúce 194 črevnej typ a 122 difúzny karcinómov typu podľa klasifikácie Lauren. 31 vzorky vykázali ďalšie histologické podtypy (tj. Mucinózní, rúrkovité, nediferencovaný). V stručnosti, kohorta obsahuje 220 mužov a 127 žien. Priemerný vek pacientov v čase diagnózy bol 64 rokov. Prežitie dáta boli k dispozícii od 196 týchto pacientov. Nadväzujúce údaje pre ostatných pacientov chýbal, pretože títo pacienti neboli ktorí žijú v blízkosti nemocnice a boli stratení zo sledovania. Zo 196 pacientov, 124 zomrelo počas sledovania. Medián follow-up u pacientov, ktorí stále nažive v koncovom bode analýzy bolo 33 mesiacov. Z 61 pacientov, tkanivo zodpovedajúcich lymfatických uzlín bolo k dispozícii (27 črevnej typ, 26 difúzny typ, 8 ďalších histologické podtypy). Len u pacientov s histologicky potvrdenými žalúdočné rakovinu a dostatok tkaniva k dispozícii boli zahrnuté. Pacienti s neoadjuvantly liečených karcinómu žalúdka alebo iné známe malignity boli zo štúdie vylúčení. Tento projekt bol schválený miestnej etickou komisiou (ref. Číslo EA1 /06/2004).

GeneChip analýza

Celková RNA bola izolovaná s fenol-chloroformom za použitia Mirvana ™ miRNA Isolation Kit ( Ambion, Austin, USA). Kontaminujúce DNA bola odstránená pôsobením DNázy (Turbo DNAfree súpravy; Ambion, Austin, USA) pri teplote 37 ° C počas 30 minút. Použili sme GeneChip® ľudského genómu U133 Plus 2.0 polia (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) podľa protokolu výrobcu analyzovať úrovne expresie mRNA. Affymetrix GeneChip® Operačný systém (GCOS 1.4) automatizuje kontrolu GeneChip® Fluidný staníc a GeneChip® Scanner 3000.

Bioinformatics

Raw Data bola analyzovaná s Affymetrix GeneChip Operačný systém (GCOS 1.4) , P-hodnota detekcia transkriptov určuje detekčný hovor, ktorý označuje, či prepis spoľahlivo detegovať (P 0,05; súčasný) alebo nezistili (chýba). S cieľom umožniť porovnanie medzi čipmi údaje boli zmenšený ku globálnemu intenzite 500. Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) a GeneSpring softvérového balíka 7,2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) boli použité na priemerných výsledkov z rôznych vzoriek a vykonať štatistické analýza porovnávať medzi rakovinou žalúdka s (N1) a bez uzlín (N0) lymfatických. Údaje o šesť polí boli normalizované k účtu pre variabilitu hybridizácia pre páry sond a ďalšie hybridizačné artefaktov. Normalizácia sa skladá z nasledujúcich troch krokov: po prvé, transformácie dát (sada meranie menej ako 300,0 až 300,0); Druhá, na čipe (normalizovať každý čip na 50. percentil hodnôt nameraných z tohto čipu); a za tretie, na gén (normalizovanie každého génu so strednou merania pre tento gén). Prehyb zmena bola vypočítaná pre každý gén ako aritmetický priemer z normalizovaných expresných hodnoty N1 delený aritmetický priemer normalizovaných hodnôt expresie N0. Nespracované dáta z microarray experimentov boli nahrané na génovej expresie Omnibus Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc&acc=GSE17187).

Real-time reverznej transkriptázy PCR

Pre syntézu cDNA, 2 ug celkovej RNA bola reverzne transkribovaných s použitím Omniscript RT Kit (Qiagen). Sú génovo špecifických primerov boli navrhnuté podľa BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Berlín, Nemecko). Sekvencie primérov boli nasledovné: CXCR4 5 'CAG CAG AAG GTA GCA TGA CG, 3' CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 'CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3'CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG; beta 2 mikroglobulínu 5 'ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA, 3' ATC TTC AAA SCS CCA TGA TG. V reálnom čase s reverznej transkriptázy PCR (Real-time RT-PCR) bola vykonaná za použitia QuantiTect ™ SYBR Green PCR Kit (Qiagen) a LightCycler systém (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko). Porovnávacie C _{t hodnoty boli normalizované ako u upratovanie génu beta 2-mikroglobulínu. Žiadna šablóna kontroly (bez cDNA v PCR) boli vykonávané u každého génu pre detekciu nešpecifickej alebo genomické zosilnenie a primeru dimerizáciu.}

histológia

Pre histologickú analýzu boli vzorky tkaniva boli fixované v 10% neutralizované formalínu a vložené do parafínu. Deparafinizovány rezy boli zafarbené pomocou hematoxylínu a eosínu. Karcinóm žalúdka bol klasifikovaný podľa klasifikácie Svetovej zdravotníckej organizácie [1]. Javisko pTNM bola stanovená v súlade s pokynmi UICC.

mikroskopické sústavy tkanív konštrukcie

vzorky parafínu zaliate tkaniva formalínom pevné a boli použité na vytvorenie mikroskopických sústav tkanív, ako bolo opísané skôr [40], [41 ]. Stručne povedané, boli vybrané tri až šesť morfologicky reprezentatívne oblasti blokov parafín "darca".

• Ploche ONE: Gene-expression Signatures možno rozlíšiť Stupne rakovinou žalúdka a Stages
• Ploche Genetika: Mir-218 inhibuje invázie a metastázy z rakoviny žalúdka zacielením Robo1 Receptor