Plos ONE: Sonic ježa posreduje širjenju in zaposlovanje preoblikovanega mezenhimskih matičnih celic v želodec

Povzetek

Študije, ki uporabljajo Helicobacter
okuženimi miši kažejo, da kosti mezenhimskih matičnih celic-mozga izvira (MSC) repopulate želodčne epitelij in spodbuja želodčne napredovanje raka. Znotraj tumorja mikrookolja v želodcu, so pro-vnetnih citokinov interferon-gama (IFNy) in Sonic Hedgehog (Shh) dvignjen. IFNy je vpleten v proliferacijo tumorja prek aktivacije signalne poti Pst v različnih tkivih, ampak ali podoben mehanizem v želodcu obstaja neznan. Testirali smo hipotezo, da IFNy poganja MSC orožja in zaposlovanje, odgovor ki jo posreduje ššš signalizacijo. Sedanja študija uporablja transplantacijo vitro
preoblikovala mezenhimskih matičnih celic iz linije (stMSC ^{vect), ki prekomerno izraža Hedgehog signalizacijo, v primerjavi z MSC niso spremenili divjega tipa (wtMSCs), wtMSCs transficirali na več-express SHH (wtMSC Tiho), in stMSCs transduciramo z lentivirusni konstrukti, ki vsebujejo shRNA ciljanje Pst gen (stMSC ShhKO). Učinek IFNy na MSC orožja je bila ocenjena z analizo celičnega cikla in vitro
uporabo celic, zdravljenih z rekombinantnim IFNy (rmIFNγ) sam ali v kombinaciji z anti-Pst 5E1 protitelesa in in vivo
pri miših presaditev z MSC, zdravljenih s PBS ali rmIFNγ. vitro
, IFNy znatno povečala MSC orožja, odziv posreduje Pst, ki je bil blokiran z 5E1 protitelesa. MSC populacija zbrani iz kostnega mozga PBS- ali IFNy zdravljenih miših so pokazali, da IFNy znatno povečala odstotek vseh linij MSC celic v S fazi, z izjemo stMSCs ShhKO celic. Medtem ko so celične linije MSC z nepoškodovano Pst izražanja zaposli v želodčni sluznici, kot odgovor na IFNy, stMSCs ShhKO ni bilo. Ježek signalizacija je za MSC orožja in zaposlovanja v želodec v odgovor na IFNy potrebno}

Navedba. Donnelly JM, Chawla A, Houghton J, Zavros Y (2013), Sonic Hedgehog posreduje širjenju in zaposlovanje preoblikovala mezenhimskih matičnih celice v želodec. PLoS ONE 8 (9): e75225. doi: 10,1371 /journal.pone.0075225

Urednik: Jorge Sans Burns, bolnišnica Univerze v Modeni in Reggio Emilia, Italija

Prejeto: 24. januar, 2013; Sprejeto: 14. avgust 2013; Objavljeno: 19. september 2013

Copyright: © 2013 Donnelly et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bil podprt s strani American Cancer Society Research Scholar nagrado 119072-RSG-10-167-01-MPC (Y. Zavros), Albert J. Ryan Foundation Fellowship (J. Donnelly) in delno iz prebavnega Health Center Cincinnati Otroški medicinski zdravje center (DHC: Bench na postelji raziskave v Pediatrični prebavnih bolezni) CHTF /SUB DK078392. Avtorji se želi zahvaliti za pomoč upravljavca Monica zamude raziskave pretočno citometrijo Core v oddelku za revmatologijo v Cincinnatiju Otroški Hospital Medical Center, podprto delno National Institutes of Health (NIH) AR-47363. Vse teče citometrije Podatki so bili pridobljeni z uporabo opreme, ki jih raziskave pretočno citometrijo Core v oddelku za revmatologijo vzdržuje v Cincinnatiju v otroški bolnišnici Medical Center, podprto delno NIH AR-47363. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Obstaja jasno določena vloga Sonic Hedgehog (SHH) signalizacijo v razvoj raka [1], [2], [3]. Rast celic pri tumorjih prebavnega trakta, ki vključujejo požiralnik, želodec, žolčnega trakta in trebušno slinavko ureja endogene izražanje ježek ligande kot Pst [1]. Vezava ježa ligand na njegov receptor, zakrpati (Ptch), ima za posledico odstranitev inhibicije Ptch na zglajena (SMO). To odstranitev inhibicije o SMO posledico aktivacijo Gli-družino ježek transkripcijskih faktorjev in nato rasti tumorja, ki se lahko blokira Hedgehog nevtralizacijskih protiteles [1]. Medtem ko je povezava med Tiho in želodčnega raka jasno, funkcionalna vloga SHH pri razvoju in napredovanju raka želodca, je v veliki meri neznan. Poleg tega je mehanizem, ki uravnava nastajanje Pst v mikrookolje tumorja je treba še določiti.

Helicobacter pylori (H. pylori)
bakterijska kolonizacija povzroča kronično vnetje, ki je stalno povezan z napredovanje raka želodca [4]. Najpogostejši in škodljivo imunski odziv vključuje Th1 pro-vnetnih citokinov, najodmevnejši IFNy od celic T in IL-1β in TNFa iz tkiva ali preplavljajo makrofagov [5] [6] [7] [8], [ ,,,0],9]. Dejansko je vnetna citokin IFNy Dokazano je, da prispevajo k patogenezi in razvoju želodca metaplazijo [5], [9], [10] in raka [10]. V raka, vnetje povzročeno se signalne poti Ježek posreduje IFNy induciran tumor razvoj [11], [12] [13]. Še posebej, Tiho je ciljni gen IFNy in Jež signalizacija mediator IFNy sproženo orožja [12].

Med Helicobacter
okužba, kronično vnetje sovpada z zaposlovanjem kostnega mozga, ki izhajajo mezenhimske matične celice (BM-jem) [14], [15]. V kronično vname želodcu so BM-jem zaposleni iz kostnega mozga v želodec in se diferencirajo v povezanimi z rakom fibroblastov (KGZS), ki so ključnega pomena pri usmerjanju razvoja raka [14]. Čeprav je očitno vpleteni v razvoj raka želodca, je mehanizem, ki ureja širjenje in zaposlovanje maligno transformacijo BM-MSC v želodcu med kronično vnetje, je v veliki meri neznan. Zanimivo je, da Pst poročajo, da inducira proliferacijo in diferenciacijo BM-MSC [16]. Tiho je bila tudi priznana kot potencialno chemoattractant za celice kostnega mozga izhaja, ko poveča v odziv na kronično vnetje [17], [18].

Na podlagi povezave med IFNy in Tiho smo hipotezo, da IFNy povzroča Pst signalizacijo v MSC olajšajo migracijo celic na želodcu. Da bi to hipotezo preverili, trenutna študija primerja vivo
BM-MSC novačenju želodčne sluznice v odgovor na IFNy uporabo v primerjavi z nespremenjenih BM-MSC spontano preoblikuje mezenhimskih matičnih celic linije (stMSC). V kulturi, BM-jem so nagnjeni k mutacije z staranja in razstavne klinično pomembnih mutacij v p53 gena [19]. Z dolgoročno kulture BM-MSC "spontano preoblikujejo" (stMSCs), se lahko razmnožujejo in vitro za dalj časa in kažejo raku spodbujanje fenotip [19]. Sedanja študija uporablja tako stMSCs in nepretvorjenih BM-jem (wtMSCs), ki prekomerno eksprimira Hedgehog signalizacijo. Uporaba celičnih linij wtMSC in stMSC tako in vivo
in in vitro
smo dokazati, da širjenje in zaposlovanje MSC celičnih linij, v želodcu je IFNy inducirane odgovor, ki je posredovana s SHH izločanje in signalizacija.

materiali in metode

Živali

C57BL /6 (sev�664) in IRG (sev705) miših, ki se uporabljajo za te študije so bili kupljeni od Jackson Laboratories. Vse študije miške so bili potrjeni s strani Univerze v Cincinnati institucionalnega varstva živali in uporabo odbor (IACUC), ki vodi ameriško združenje oceno in akreditacijo skrbi za laboratorijske živali (AAALAC) objekta.

kostnega mozga, ki se pridobiva spontano preoblikovala mezenhimskih matične celice (stMSC) in Non-preoblikovala BM-jem (wtMSC) Kultura in nega

celične linije wtMSC so bili ugotovljeni iz celega kostnem mozgu IRG miši in kultivirani za prehod 5 pred transfekciji s kasnejšim vzdrževanjem pri nizki številka prehod (< P10) pred eksperimentalno uporabo. Celoten kostnega mozga speremo z stegnenice in golenice miši za nadaljnjo kulturo in prehod plastičnega pripadajočo MSC prebivalstva [20]. so bili uporabljeni spontano transformirane kosti mezenhimskih matičnih celic-mozga izvira (stMSCs) transficirane z pDsRed-Hyg-C1 plazmida izraža rdeči fluorescentni protein [21]. Vse celice kultiviramo s pomočjo Hyclone DMEM kulturni medij, dopolnjen s 10-15% fetalnega telečjega seruma in 1% penicilin-streptomicin pod normalnimi pogoji. MSC kultivirani za zdravljenje zasadimo v 6 vdolbinicami in pustimo, da rastejo do 70-80% konfluence v običajnih medijih nato stradamo seruma preko noči. Po širitvi kulture, je miška multipotentne mezenhimskih stromalni Cell Marker protiteles plošča se uporablja za označevanje celičnih linij MSC za SCA-1, CD106, CD105, CD73, CD29, CD44 in obtočil označevalce CD45 in CD11b (R &D Systems, SC018). Celice smo suspendirali v koncentraciji 1 x 10 ^{6 celic /ml in obarvajo v skladu s protokolom proizvajalca. Celice smo nato inkubirali z AlexaFluor 488 pri redčenju 1:100 30 minut pri 4 ° C. Fiksacija smo izvedli 15 minut pri sobni temperaturi z uporabo komercialno na voljo reagenta (Invitrogen GAS001S5). Intenziteta fluorescence je izmerjen s pretočnim citometrom uporabo programske opreme BD FACSCalibur in CellQuestPro. wtMSCs in stMSCs so bili zdravljeni z vozilom, rekombinantni miške interferona gama (rmIFNγ, 100 nM, R & D Systems) ali anti-Pst protitelesa 5E1 (predhodno obdelani za 6 ur) ter rmIFNγ 24 ur. Obdelane celice smo nato analizirali spremembe v celičnem ciklu s pretočno citometrijo.}

Sonic Hedgehog (Pst), ki ga lentivirusom posredovano kratkih Ostra RNA (shRNA) rasklapanje uporabo stMSCs

RFP z oznako stMSCs bilo transduciramo s petimi različnimi MISSION lentivirusni transdukcija delcev klonov, ki vsebujejo različne sekvence shRNA za SHH in pLKO.1-puro komponenta, ki daje odpornost na puromicina (Sigma Aldrich). RFP-označeni stMSCs inkubiramo z lentivirusni delcev z ExpressMag magnetnih kroglic (Sigma-Aldrich) na magnet (Oz Biosciences Super magnetna plošča, MF10000) za 15 minut, smo celice odstranimo iz magneta, inkubirali nadaljnjih 16 ur, nato pa pod izbira puromicina (DMEM kultura Media, ki vsebuje 10% fetalnega telečjega seruma, 1% penicilin /streptomicin, 10 mg /ml puromicina) 7 do 10 dni. Efektivna doza puromicin potrebni za odpravo nahajajo-transduciramo celic je bila prej določena z puromicin ubiti krivuljo, ki testirane koncentracije od 0 do 50 ug /ml (podatki niso prikazani). Transducirani celice so bile označene z edinstveno klon identifikacijsko številko, s celičnih linijah transduciranih z shRNA za SHH (stMSC ^{ShhKO) oštevilčena 59-63. PLKO.1-puro vektor transduciramo celične linije RFP-MSC (stMSC vect) služi kot kontrola za endogenega ravni Pst genske ekspresije. Western blot analiza je bila uporabljena za potrditev Pst rasklapanje in RFP izraz.}

Transfekcija wtMSCs Over-express Pst

plazmid (Origene CW101340) smo združili z reagentom Origene Turbofectin na razmerij 0 :1, 01:01, 02:01, 03:01 in 04:01 in inkubirali 15 minut pri sobni temperaturi. Transfekcijski reagent Nato dodamo po kapljicah wtMSCs na 70% konfluence in pustimo inkubirati 24 ur preden smo celice čaka na podlagi izbora v običajnem mediju z puromicina. Efektivna doza puromicin potrebni za odpravo netransfektiranih celic je bila prej določena s koncentracijami testne krivulja puromicin ubiti od 0 do 10 ug /ml (podatki niso prikazani). Najnižja koncentracija, ki je ubil vse netransficirane celice na 3-4 dni po zdravljenju je bila ustanovljena kot 2 ig /ml.

In vivo stMSC Zaposlovanje in orožja

C57BL /6 miši presadili z 1 × 10 ^{6 wtMSCs, wtMSCs Tiho, stMSCs vect ali stMSCs ShhKO preko injekcije rep ven. Tri dni po presaditvi, smo miši injiciramo z vozila (sterilnim PBS, i.p.) ali rmIFNγ (1 mg /dan i.p.) 7 ali 21 dni. Mišim vbrizgali 200 ul BrdU označevanje stock reagent (5-bromo-2'-deoksi-uridin označevanja in odkrivanja Kit II, Roche Diagnostics, ip) 24 ur pred analizo, in oddelki želodec, določena v 4% paraformaldehid, parafin, vgrajeni in 3 um oddelki pripravljeni za imunohistokemični in analize imunofluorescenčni. Celoten kostnega mozga smo izolirali tudi iz stegnenic iste miši s PBS splakovanje. Rdeče krvničke smo lizirali s pomočjo rdečih krvnih pufra razpad celic (4,14 g NH _{4Cl, 0,5 g KHCO 3, 0,5 M EDTA v 500 ml, pH 7.2-7,4). Približno 11 × 10 6 celic so bile določene in permeabiliziramo uporabo Caltag Laboratories citometrija Kit, po protokolu proizvajalca (Invitrogen, GAS-004) in obarvajo z uporabo anti-RFP FITC konjugirano protitelesa (1:100, Abcam, ab34764 ) in nato obarvajo z uporabo Vybrant DyeCycle Ruby madež (Invitrogen) po protokolu proizvajalca. Fluorescence smo analizirali z uporabo sistema BD LSRII pretočnim citometrom. Za analizo posebej za RFP-jem, je aktiviranja uporabljena za analizo cikel celic samo pozitivnih celic FITC. Peak fluorescence smo analizirali s programsko opremo ModFitLT za določitev odstotka prebivalstva v vsaki fazi celičnega cikla.}}

pretočno citometrijo in Cell Cycle Analysis

Celice stradamo seruma 16 ur pred analizo . Celice so bile določene z ledeno mrzlo 70% etanol /PBS 15 minut pri -20 ° C, izperemo in nato obarvamo s propidijevim jodidom 45 minut. Izmerjene vrednosti maksimalne fluorescence na skupno število celic dobimo z uporabo programa Cellquest Pro (Becton Dickson). Odstotek celic iz populacije v vsaki fazi celičnega cikla smo izračunali iz meritev vrhov fluorescence s pomočjo analize s programsko opremo ModFit LT. Citometrija uporabo sistema FACSCalibur ™ (Becton Dickson) smo izvedli na vseh transduciranih celic z uporabo miške multipotentne mezenhimskih matičnih celic Marker Protitelo plošča po protokolu proizvajalca (R & D Systems, SC018).

imunoprecipitacije in Western blot Analiza

Mobilni lizate smo pripravili z M-PER ekstrakcije protein reagenta sesalcev (Thermo Scientific, IL), dopolnjen z zaviralci proteaz (Roche) po protokolu proizvajalca. Medijskih vzorcev iz celic so bile koncentrirane uporabo 15 ml Amicon Ultra Centrifugalni Filter naprave (Millipore). Celični lizati (100 mikrogramov celotna proteinska) in mediji smo imunoprecipitirali s pomočjo anti-Pst 5E1 protitelesa (2 ľg) pri 4 ° C 16 ur. Protein A /G agaroza kroglice dodamo (20 ul, Santa Cruz Biotechnology, CA) in vzorce inkubiramo pri 4 ° C 16 ur. Po 16. uri inkubacije smo immunoprecipitates 3-krat sprali z uporabo PBS in ponovno suspendirali v 40 ul Laemmli pufra, ki vsebuje beta-merkaptoetanola (Bio-Rad Laboratories, CA) pred nakladanjem na 4-20% Tris-glicin Gradient geli. Geli so bili izvedeni pri 80 V, 3,5 ure, prenese na nitroceluloza membrane protein pri 105 V, 1-2 ur, nato pa blokirani za 1 uro pri sobni temperaturi z uporabo KPL detektor Block (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.). Membrane smo inkubirali preko noči pri 4 ° C z 1:200 razredčenju Pst protitelesa (N-19, Santa Cruz), čemur sledi 1-urni inkubaciji pri 1:100 redčenjem AlexaFluor anti-kozjega 680 (Invitrogen). Blots so posneli s pomočjo skeniranja denzitometra skupaj s programsko opremo za analizo (Odyssey Infrared Imaging Software System).

RNA Isolation in RT-PCR

Total RNA smo izolirali iz želodca tkiva uporabo TRIzola reagenta glede na proizvajalci protokol (TriReagent, Molecular Research Center, Inc.). High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) smo uporabili za cDNA sintezo iz RNA po priporočeni protokola. Za vsak vzorec je bil 60 ng RNK reverzno prepisana, da dobimo približno 2 ug celotno cDNA, ki je bil nato uporabljen za RT-PCR. RFP oligonukleotidov zaporedja, ki se uporabljajo, so bili naslednji: NAPREJ -5 "CCC CGT AAT GCA GAA GAA GA 3", ZADAJ -5 'CTT GGC CAT GTA GGT GGT CT 3'. PCR ojačitve so bile izvedene v celotnem volumnu 20 ul, ki vsebujejo blažilnika, 20 mm naprej in nazaj primerje, Taq polimerazo, RNaze prosto vodo in cDNA predloge. Vsak PCR smo izvedli v dvojnikih vdolbinic v GeneAmp PCR sistem 9700 termostat (Applied Biosystems), z naslednjimi pogoji: 94 ° C 3 minute, 94 ° C 30 sekund, pri 60 ° C 1 minuto in 72 ° C, 1 minuto za 35 ciklov. PCR produkti so bili vizualizirali na 1,5% agaroznem gelu TAE.

Imunohistokemija

Miši smo injicirali 200 ul za BrdU označevanje zalog reagenta (5-bromo-2'-deoksi-uridin Označevanje in zaznavanje Kit II, Roche Diagnostics), 24 ur pred analizo. Želodčne tkiva so bile določene z Carnoy je fiksirjem (60 ml etanola, 30 ml kloroforma, 10 ml ocetne kisline) za 16 ur, parafina vgrajenih in pripravimo 4 um sekcije. Po deparaffinization je pridobivanje antigena izvedli s segrevanjem stekelca za 10 minut pri 100 ° C v 0,01 M natrijevega citratnega pufra (antigen razkrinkanje Solution, Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija). Endogene peroksidaze aktivnost smo nato blokirali z inkubacijo stekelca v 3% vodikovega peroksida /etanol za dodatnih 20 minut. Odseki smo nato blokirali z uporabo 5% BSA /Tris pufer /0,1% Tween 80 (TBS-T) in inkubiramo z 1:20 razredčenju anti-BrdU protiteles (5-bromo-2'-deoksi-uridin označevanje in Detection Kit II, Roche Diagnostics) pri 37 ° C za 30 minut. BrdU razvijanje barve je bila opravljena v skladu s protokolom proizvajalca. Odseki smo nato blokirali z 20% normalne kozji serum za 20 minut in inkubiramo z 1:400 razredčenju biotina-konjugiranim anti-RFP protitelesa (Abcam, ab34771) za 16 ur pri 4 ° C, čemur sledi 1:500 redčenjem anti- kunec IgG za 30 minut in nato vizualizirali z avidinom-biotin kompleksov z uporabo kompleta Vectastain Elite ABC pomočjo diaminobenzidine (DAB) kot substrata (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Kalifornija). Diapozitivi so bili nameščeni s pomočjo Permount.

Za indukcijo adipocitov, so stMSCs zdravljenih z Hyclone DMEM containing10 ^{-8 M deksametazon (Sigma, D4902) in 5 mg /ml insulina (Sigma, I6634). Vse celice so bile določene z uporabo 4% paraformaldehida 20 minut pri sobni temperaturi. Za odkrivanje razlikovanje, je Oil Red O obarvanje izvedli z dodatkom 3,75% Oil Red O rešitev, inkubiranje 5 minut pri sobni temperaturi, nato s spiranjem z vodo pred montažo na diapozitive z uporabo Vectashield HardSet zaščitnim sredstvom. Slike so bile ogledov in zajeti pod svetlobnim mikroskopom z uporabo Olympus BX60 s Diagnostic Instruments "Spot" fotoaparat.}

Imunofluorescenčni

stMSC ^{vect in stMSC ShhKO celice gojili na coverslips do 70-80% konfluentne, fiksno s 4% paraformaldehida 30 minut pri sobni temperaturi, permeabiliziranih s PBS, ki vsebuje 0,5% TritonX-100 in blokirali z 2% osla seruma 1 uro pri sobni temperaturi. Celice smo nato inkubirali z bodisi 1:50 razredčenju anti-CD44 (Abcam ab65829) ali 1:100 razredčenju anti-CD45 (Abcam ab10558) protiteles preko noči pri 4 ° C. Alexa Fluor osel anti-kunčje 488 smo uporabili kot sekundarnega protitelesa na 1:1000 redčenju 1 uro pri sobni temperaturi. Celice smo nato jih nasprotno s 1:2000 razredčenju jedrske madež TO-PRO 3-jodida (Invitrogen, T3605) za 20 minut pri sobni temperaturi pred montažo uporabo Vectashield HardSet zaščitnim sredstvom. Rabbit IgG je bila uporabljena pri razredčitvi 1:25 kot negativno kontrolo pod enakimi pogoji.}

želodcem odseki zbrani PBS ali IFNy zdravljenih miši smo blokirali z 20% normalne kozjim seruma in inkubiramo z 1:400 anti- RFP protitelo (Abcam, ab34771) za 16 ur pri 4 ° C, čemur sledi 1:100 anti-kunčjega Alexa Fluor 488 (Invitrogen) sekundarnega protitelesa za nadaljnjo 1 uro. Ploščice smo potem jih nasprotno s pomočjo anti-E-kadherina (BD pretvorniškim Labs, 610181) protitelesa na 1:200 redčenju 1 uro pri sobni temperaturi, ki mu sledi 1:100 proti mišjim Alexa Fluor 633 (Invitrogen) sekundarnih protiteles. Vsi vzorci so bili nameščeni s pomočjo Vectashield Hardset zaščitnim sredstvom (VectaLabs). Slike so bili pridobljeni z uporabo Zeiss LSM510 META konfokalnim mikroskopom.

kemotaksa Vsebnost

kemotaksa test je bil izveden na podlagi ustaljenih protokolov [22]. Transducirani stMSCs smo nanesli v 24 dobro transwell plošče, ki vsebujejo PET membrane z 8 mikrometrov pore (BD Falcon). 2,5 x 10 ^{4 Celice smo zasejali v koničnem (zgornji) komore v DMEM mediju, ki vsebuje 0,1% BSA. SDF-1α (rmSDF-1α, R &D Systems) dodamo k basolateral (nižji) komore v koncentraciji 0 do 150 ng /ml. Celice inkubiramo 6 ur pri 37 ° C. Po migracij, smo celice določene v 4% paraformaldehida v 30 minutah, nato obarvajo za 10 minut z uporabo Wright-Giemsu. Preostale na vrhu membrane celice smo odstranili z aplikatorjem-bombažno konico in preostale celice prešteli v 5 poljih pri 40-kratni povečavi. Število migrirali celic smo izračunali z deljenjem povprečno število migracijo celic v vsako jamico s povprečnim številom migracijo celic v kontroli dobro.}

Statistična analiza

Rezultate smo analizirali z bodisi Test neparni t študenta ali ANOVA uporabo komercialno dostopne programske opreme (GraphPad Prism, GraphPad programske opreme, San Diego, CA). A P
vrednost < 0.05 je zdelo pomembno

Rezultati

IFNy inducirane stMSC orožja je posredovana s SHH izločanja in signalne

vloga. Ježek signalizacijo kot posrednik IFNy-inducirane stMSC in wtMSC orožja je bila opredeljena s pretočno citometrijo in napredovanju celičnega ciklusa. Po obdelavi smo celice obarvali s propidijevim jodidom in celični cikel analizirajo citometrije toka na izbrani celični populaciji samega (slika S1A). Slika 1 predstavlja srednje vrednosti distribucijskega mobilni odstotek v različnih fazah celičnega ciklusa v skupinah zdravljenja, prikazanih na slikah S1B-E. Številke S1B-E predstavljajo parcele, ki prikazujejo spremembe v fazah celičnega ciklusa. Povprečne vrednosti in statistično značilnih razlik v odzivu na vseh zdravljenja je prikazano v sliki S1F in G. Analiza podatkov surovin fluorescence je pokazala povečano odstotek stMSCs v S fazi in G _{2 /M fazi in zmanjšan odstotek celic v G 0 /G 1 faza odgovor na rmIFNγ v primerjavi s celicami, zdravljenih z nosilcem (slika 1A). Za identifikacijo vloge izločen Tiho kot posrednik IFNy-inducirane proliferacije stMSC smo uporabili anti-jež nevtralizacijskih 5E1 monoklonsko protitelo, ki se veže na Pst ligand in moti protein se veže na receptor Ptch [1]. Proliferativni odziv stMSCs do rmIFNγ je bistveno zaviral z zdravljenjem 5E1 protiteles (slika 1A). V primerjavi z stMSCs, non-transformirane wtMSCs odzvala podobno kot odgovor na IFNy kaže opaženo povečanje orožja ni bil rezultat transformacije sam. IFNy bistveno povzroča odstotek wtMSCs v S fazi, odziv, ki je blokirana z anti-Pst protitelesa (slika 1B). Kolektivno, Slika 1 kaže, da IFNy inducira proliferacijo obeh nespremenjene in spontano pretvorjeni MSC, odziv, ki je posredovano s izločen ššš.}

Utišanje v SHH Gene v kostnem mozgu, ki izhajajo stMSCs

Za celovito preuči vlogo ježa signalizacije v BM-MSC orožja in zaposlovanje in vivo
, wtMSCs so transfektirane prekomerno izražajo Pst, medtem ko stMSCs so transduciramo z lentivirusni shRNAs proti ššš. Uporabljena je bila pLKO.1-puro baza lentivirusni vektor izraža kratek Ostra zaporedje proti prepisa gena ššš. celične linije Control MSC so bile določene s pomočjo wtMSC z endogenim izražanje Tiho in transfekciji stMSCs z pLKO.1-puro baza lentivirusni vektor (stMSC ^{vect). Pet lentivirusni kloni, vsak klon izraža drugačno kratek Ostra zaporedje, so bili analizirani (stMSC ShhKO59-stMSC ShhKO63). Rasklapanje za SHH je bil potrjen z Western analizo blot, ki je pokazala 100% rasklapanje za SHH beljakovin izražanja v vseh klonov v primerjavi z untransduced celic (wtMSCs) in Psst pretirano izražanje celičnih linij (wtMSC Tiho in stMSC vect) ( slika S2A). Clone stMSC ShhKO59 je bila uporabljena za nadaljnjih poskusih in se imenuje stMSC ShhKO. Izražanje pDsRed-Hyg-C1 plazmida izraža rdeči fluorescentni protein (RFP), je bila potrjena z imunoblot uporabo celični lizat, zbrane iz transduciranih stMSCs (Slika S2A). Pomembno je, da wtMSCs stabilno transfektirali na več-express Pst beljakovin, izražena Pst na podobni ravni kot v stMSCs (slika S2A).}

Da bi preverili rasklapanje za SHH v MSC brez spreminjanja diferenciacijo celic, izraz vzorec za klasične označevalcev CD (CD29, CD106, CD105, CD44 in CD73) in SCA-1 uporabljajo citometrijo pretoka je bilo izvedeno z uporabo kultivirani stMSC ^{vect (Slika S2) in stMSC celice ShhKO (Slika S2C). Oba stMSC vect in stMSC celice ShhKO so bili negativni za CD45 (Slika S3). Poleg tega sta bila oba stMSC celične linije sposobni razlikovati na adipocitov fenotipa, ki temelji na pozitivni Oil Red O barvanjem lipidnih kapljic proizvedenih (Slika S3). Kolektivno, ti podatki kažejo, da rasklapanje od SHH beljakovin v stMSCs ni spremenila diferenciacijo teh celic.}

IFNy povzroča širjenju wtMSCs in stMSCs v kostnem mozgu

Da bi ugotovili vpliv IFNy na wtMSC in stMSC širjenje in vivo
, so miši presadili z-RFP označena wtMSC, wtMCS ^{Tiho, stMSC vect ali stMSC ShhKO celice in se zdravijo z rmIFNγ za 21 dni. Po zdravljenju IFNy je kostnega mozga odvzamejo in analizirajo spremembe v celični cikel in števila RFP-pozitivnih celic z citometrije toka. IFNy povzroča znatno povečanje števila RFP pozitivnih celic v kostnem mozgu vseh poskusnih skupin, razen za tiste živali, presajenih s stMSC ShhKO celice (Slika 2A, B). Imunofluorescenca kostnega mozga je pokazala, da je prišlo do znatnega povečanja posebej števila razmnoževanih RFP pozitivnih celic v odzivu na IFNy kot so-lokalizira BrdU imunskim barvanjem (slika 2C, D). To je še dodatno podprta z Slika S4A, B in C, ki prikazuje reprezentativno analizo lahkih razpršeni razkrivajo prebivalcev stMSCs, ki so bili pozitivni na RFP in sestavljali približno 0,1% celotnega kostnega mozga celične populacije. RFP-pozitivne celice odvisnih za celično populacijo samega (slika S4C) in celični cikel analizirani. Celice zbrani iz kostnega mozga miši presajenih z stMSC vect celice, ki se zdravijo z rmIFNγ imeli bistveno večji odstotek celic v S-fazi (55,5 ± 2,82%), v primerjavi s tistim miših, zdravljenih s PBS (32,9 ± 5,14%, P
< 0.05 v primerjavi z stMSC transplantiranih miših vect zdravljenih s PBS) (Slika S4F). Odstotek celic v S-fazi, zbranih iz kostnega mozga miši presajenih z stMSC ShhKO zdravljenih z rmIFNγ niso bistveno razlikovali (32,9 ± 2,64%), v primerjavi s tistimi miših, zdravljenih s PBS (38,4 ± 1,47%, P
> 0.05 v primerjavi s presajenimi miših stMSC ShhKO zdravljenih s PBS) (Slika S4I). Številke S4D, E, G in H predstavljajo parcele, ki prikazujejo spremembe v fazah celičnega ciklusa. Tako IFNy inducira proliferacijo obeh wtMSCs in stMSCs in vivo
v kostnem mozgu, odgovor, da se zdi, da se posreduje ššš signalizacijo.}

V vivo
Zaposlovanje wtMSCs in stMSCs do želodčne sluznice kot odgovor na IFNy

za opredelitev vloge ježa signalizacije kot posrednik IFNy povzročene stMSC službo do želodca epitela, miši presajene z stMSC ^{vect in stMSC ShhKO celice so bili zdravljeni s PBS ali IFNy za 21 dni. Želodci so se nato zbrali in zaposlovanje, RFP označena stMSC vect in stMSC ShhKO celice, analizirani z imunohistokemijo (slika 3). stMSC vect so celice zaposli v želodčni sluznici miših vbrizgali IFNy (slika 3C, D) v primerjavi z odsotnostjo-RFP označena stMSC vect celic v želodcih iz PBS-vbrizgali mišim (slika 3A, B ). stMSC celice ShhKO presajeni v miši vbrizgali IFNy niso bili zaposleni zaradi želodčne sluznice (Slika 3E, F). Izražanje-RFP označena stMSC vect so celice z zdravljenjem IFNy potrjena z RT-PCR (slika 3G). Ugotoviti, ali je bila zaposlitev MSC do želodčne sluznice v odgovor na IFNy edinstven na stMSCs je bil poskus ponovimo z uporabo bodisi wtMSCs ali wtMSCs prekomerno izražanje SHH (wtMSC ššš). Čeprav sta bili obe wtMSC in wtMSC Pssst celic odkrite v želodcih iz IFNy zdravljenih miših, je bilo precej višje številke wtMSC Tiho in stMSC vect celicah v želodčni sluznici v primerjavi z wtMSC celice presadijo skupino (slika 3H). Kolektivno, ti podatki kažejo, da je verjetno, da posredovanje zaposlitev MSC do želodčne sluznice v odgovor na IFNy Pst signalizacijo.}

Prišlo je do znatnega povečanja števila razraščajo celic v želodčni sluznici kot odgovor na IFNy zdravljene wtMSC ^{Tiho in stMSC vect presajene miši v primerjavi s PBS-vbrizgali mišim (slika 4A-D, slika S5A-F) na. Vendar so jem BrdU negativna (slika 4B, C in Slika S5A-D). Čeprav stMSC ShhKO celice presajeni v miši vbrizgali IFNy niso bili zaposleni na želodčne sluznice, je bil v tej poskusni skupini ni razlike epitelija orožja med PBS in IFNy zdravljenja, kar kaže na povečano MSC-izpeljano Tiho se lahko zahteva, da podpira to povečano proliferacijo (slika 4D). Poleg tega, čeprav je bilo wtMSCs zaposlujejo za želodčne sluznice v odgovor na IFNy, ni bilo razlike v epitela orožja med PBS in IFNy zdravljenja (Slika 4D). Ti podatki kažejo, da Pst signalizacijo v wtMSCs Tiho in stMSCs odgovor na IFNy inducira proliferacijo v želodcu epitela. IFNy sam, v odsotnosti stMSCs, ne inducira proliferacijo v želodčni sluznici, ki potrjuje ta učinek ni povezana s samim vnetjem.}

Da bi ugotovili, ali je zmanjšala stMSC širjenja po zaposlitvi, je bila povezana z adhezijo celic znotraj želodca epitelij, želodci so se nato sočasno obarvamo za E-kadherina in RFP (Slika 4G-I). PBS, zdravljenih miši, ki so bile presaditev z-RFP označena stMSC ^{vect celice niso pokazale zaposlovanje celic želodčne sluznice (slika 4G). Skladno s sliko 3, IFNy vbrizgom miši, ki so bile presajenih S RFP označila stMSC vect celice pokazal izrazito rekrutiranjem celicah želodčne sluznice (slika 4H). RFP-označil stMSC Vect celice, co-lokalizirano z E-kadherina (slika 4G, I), ki podpirajo, da so zaposleni celice so engrafted v želodcu epitela.}

Ježek signalizacija posreduje izražanju kontaktne adhezije proteina pri odzivanju da SDF-1 a kemokin

smo se odločili, da razišče SDF-1α /CXCR4 signalno os, kot je bilo ugotovljeno, da je ta signalizacija pot spodbuja MSC zaposlovanje [23], [24].

• Plos ONE: Unexpected brez glave in brezrepo Ribe v želodcu Vsebina mako Isurus oxyrinchus
• Plos ONE: žužkojede netopirje Digest hitina v želodcu Uporaba kisla sesalce Chitinase