PLoS ONE: Overekspression af receptoren for fremskreden glycosylering slutprodukter (RAGE) er forbundet med dårlig prognose i Gastric Cancer

Abstrakt

Baggrund

receptoren for avancerede glykering slutprodukter (RAGE) er en onkogent tværfaglig trans-membranøs receptor, som er overudtrykt i flere humane kræftformer. For nylig er det blevet vist, at RAGE også er involveret i carcinogenese og tumorinvasion. I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionsniveauerne og prognostisk værdi RAGE i primære gastrisk kræft (GC).

Metoder

Vi undersøgte RAGE udtryk i den primære GC og parret normalt gastrisk væv ved real- time kvantitativ RT-PCR (n = 30) og Western blotting-analyse (n = 30). Derudover udførte vi immunhistokemi på 180 paraffinindstøbte GC prøver, 69 matchede normale prøver.

Resultater

RAGE blev overudtrykt i GC i forhold til de tilstødende noncancerous væv ( P
<0,001), og højere RAGE udtryk signifikant korreleret med den histologiske bedømmelse ( P
= 0,002), nodal status ( P
= 0,025), metastaser status ( P
= 0,002), og amerikanske Blandede Udvalg om kræft scene ( P
= 0,020). Desuden opregulering af RAGE udtryk er en uafhængig prognostisk faktor i multivariat analyse ved hjælp af Cox-regressionsmodel ( P
= 0,001).

Konklusioner

RAGE Overekspression kan være et nyttigt markør til at forudsige GC progression og dårlig prognose

Henvisning:. Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, Mou T, et al. (2015) Overekspression af receptoren for fremskreden glycosylering slutprodukter (RAGE) er forbundet med dårlig prognose i Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10,1371 /journal.pone.0122697

Academic Redaktør: Valli De Re, IRCCS National Cancer Institute, ITALIEN

Modtaget: November 22, 2014 Accepteret: 13 Februar 2015; Udgivet: April 10, 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Program for National specielle Key Clinical Medical, forskningsfonden of Public velfærd i Health Industry (No.201402015), Major Program for Videnskab og Teknologi Program for Guangzhou (No.201300000087), og The National Key Technology R & D Program (No.2013BAI05B00). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

receptoren for fremskreden glycosylering slutprodukter (RAGE), en celleoverflade molekyle udtrykkes i en række celletyper, er et multiligand medlem af immunoglobulin-superfamilien [1]. RAGE er blevet impliceret i et bredt spektrum af patologiske reaktioner, herunder inflammation og cancer, baseret på forskellige dets ligander [2]. Som et nyligt anerkendte onkogent trans-membranøs receptor, er det blevet vist at være involveret i flere humane cancere stimulerer vækst, overlevelse og metastatisk spredning [3]. Flere undersøgelser har vist, at RAGE opreguleres og mister sin karakteristiske granulære mønster i primære tumorer [4]. AGE-RAGE interaktion spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​prostatakræft, og hæmme dette samspil har potentiale som en ny molekylær mål for forebyggelse eller terapi kræft [5]. Co-ekspressionen af ​​RAGE og High-mobilitet gruppe protein B1 (HMGB1) er blevet væsentligt forbundet med kolorektal cancer invasion og metastase [4,6,7]. Derudover RAGE udtryk korrelerer med angiogenese og tumor metastase i mundtlig planocellulært karcinom (OSCC) og kan være en uafhængig prognostisk faktor for tilbagefald og prognose i OSCC patienter [8,9]. Endvidere kan genetisk polymorfi af RAGE gen være en prædiktiv biomarkør anvendes til screening for patienter følsomme overfor termoterapi og vurdere prognosen for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter [10].

rolle dog af RAGE i gastrisk cancer (GC) er forblevet undvigende. RAGE har tidligere været indikeret tæt forbundet med invasion og metastase i gastrisk kræft [11]. Endvidere blev det rapporteret, at blokade af RAGE signalering undertrykkes væksten og metastaser af gastriske cancerceller [12]. I en undersøgelse af roller RAGE i GC patogenese og progression og virkningerne af dens gen-polymorfier på receptor funktion, Gu og kolleger [13] har vist, at RAGE Gly ^{82Ser polymorfi kan være forbundet med en øget risiko for initiering eller progression af gastrisk karcinom. Men så vidt vi ved, er forholdet mellem RAGE-ekspression og GC patient prognosen er ukendt.}

I denne undersøgelse analyserede vi RAGE ekspressionsniveau i GC ved anvendelse real-time kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR), Western blotting og immunhistokemi (IHC). Vi identificerede en sammenhæng mellem RAGE udtryk og de klinisk-patologiske træk af GC, og derefter evaluerede den prognostiske værdi af RAGE udtryk for postoperative overlevelse GC patienter.

Materialer og metoder

Etik redegørelse

Denne undersøgelse blev godkendt af Nanfang Hospital Etisk Udvalg og skriftligt informeret samtykke blev opnået ved alle disse patienter involverede.

patienter og vævsprøver

Thirty parret frisk frosset gastrisk kræft og tilsvarende noncancerous slimhinde væv (udskåret > 10 cm fra kanten af ​​GC) prøver blev indsamlet fra GC patienter inden for 30 minutter efter resektion og straks opbevaret i flydende nitrogen indtil brug. En anden 180 paraffin indlejret GC væv blokke og 69 kontrolprøver fra matchede normale gastriske væv taget fra den distale resektion marginen blev indhentet fra de lagrede filer af Department of General Surgery, Nangfang Hospital, Southern Medical University, blev indsamlet kirurgisk fra januar 2007 og december 2008. De 180 patienter inkluderet 120 mænd og 60 kvinder i alderen 22-78 år (gennemsnit, 55,62 år). Ingen af ​​disse patienter blev behandlet med strålebehandling eller kemoterapi før kirurgi. Den histopatologiske type og stadium af resektion prøver blev bestemt i henhold til kriterierne i World Health Organization klassifikation og det fælles udvalg amerikanske on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual (7. udgave, 2010). Blandt dem, 125 Fase I-III patienter modtog radikal resektion (19, 25 og 81 for trin I, II og III, henholdsvis), og 55 Stage-IV patienter fik palliativ kirurgi og /eller kemoterapi. Metastasen-ramte fjerntliggende organer i Stage-IV inkluderede patienter peritoneum, fjernt lymfeknude, lever, tværgående tyktarm, ovarie eller æggeleder, bugspytkirtel, tarm, knogle, lunge, hjerne og nedre vena cava. Patienterne blev fulgt indtil døden eller den sidste opfølgende date (30 december 2013). Den mediane follow-up tid var 48 måneder (fra 2 til 82 måneder).

Total RNA ekstraktion og real-time kvantitativ RT-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra hakket Væv med TRIzol reagens (Takara, Japan) og revers transkriberet til første streng cDNA med TaqMan Reverse Transcription Kit (Takara, Japan). Derefter blev 0,5- til 1-ul portioner af cDNA bruges som skabeloner til at forstærke RAGE fragment (fremad: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3; omvendt: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) under følgende betingelser: 95 ° C i 30 s; 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder; 60 ° C i 30 s; og smeltning ved 95 ° C i 5 sekunder, efterfulgt af 60 ° C i 1 min, og afkøling ved 50 ° C i 30 sek. PCR og indsamling af data blev udført på LightCycler480 System (Roche, Schweiz) med 2 × SYBR Green Master mix (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA). RAGE-ekspression blev normaliseret med den for GAPDH.

Western blotting-analyse

Western blotting blev udført ifølge standardmetoder som tidligere beskrevet [14]. Kort beskrevet væv blev formalet og lyseret med RIPA lysebuffer og lysaterne blev høstet ved centrifugering (12.000 rpm) ved 4 ° C i 30 minutter. Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af bicinchoninsyre Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Ca. 50 ug prøver blev derefter separeret elektroforetisk på 10% natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamidgeler og overført til en polyvinylidendifluoridmembran. Efter blokering af de ikke-specifikke bindingssteder blev membranen inkuberet med et kanin polyklonalt anti-RAGE-antistof (Santa-Cruz, CA, USA) ved en 1: 1000-fortynding ved 4 ° C natten over. Efter tre vaske med TBST (Tris-bufret saltvand med Tween-20) i 10 minutter, blev membranerne inkuberet med et sekundært antistof ved en fortynding på 1: 3000 ved stuetemperatur i 60 min. Proteiner blev påvist med et forstærket kemiluminescens-system (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA), og normaliseret til p-actin detekteret under anvendelse af et muse-anti-humant β-actin-antistof (1: 1000 fortynding; Sigma, St. Louis, MO , USA).

Immunhistokemisk assay

IHC-assayet blev udført som beskrevet tidligere [12,14]. Kort fortalt blev objektglassene afparaffiniseret med dimethylbenzen og rehydreret gennem en ethanol-gradient (100%, 95%, 90%, 80% og 70% ethanol) i vand. Efter vask med PBS (phosphatbufret saltvand) i tre gange blev objektglassene kogt i antigen-genvinding puffer, 0,01 M natriumcitrat-saltsyre (pH = 6,0), i 30 minutter i en mikrobølgeovn. Efter endogen peroxidaseaktivitet blev standset med 3% H _{2O 2, efter tre gange vask med PBS, ikke-specifik antistofbinding blev blokeret ved at inkubere objektglassene med 10% normalt gede-immunt serum. Snittene blev derefter inkuberet ved 4 ° C natten over med polyklonalt RAGE antistof (Santa-Cruz, CA, USA) ved en 1: 400 fortynding og efterfølgende inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) ved stuetemperatur i 30 min. Efter vask i PBS blev snittene derefter fremkaldt under anvendelse af 3,3-V-diaminobenzidin (Sigma), vasket i rindende ledningsvand, og let modfarvet med hematoxylin før dehydrering og dækglas montering. eksperimenter Negative kontrol blev udført ved at erstatte det primære antistof med PBS.}

Immunfarvning blev analyseret af to uafhængige observatører (Y.X. og L.Z.), der var blindet til patienternes resultater og andre klinisk-patologiske parametre. Den RAGE detection system har tidligere [12] blevet beskrevet. Alle prøver blev kategoriseret efter omfanget af immunreaktivitet: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. Farvningsintensitet blev scoret som 0, negativ; 1, svag; 2, moderat; 3, stærk. For hvert tilfælde, den samlede immunfarvning score også kendt som farvning (SI), blev beregnet ved at gange procentdelen af ​​positive celler med farvningsintensitet score, hvilket gav en værdi mellem 0 og 12. Til denne undersøgelse en optimal cutoff-værdien var identificeret som følger: SI < 8 blev anvendt til at indikere lav RAGE udtryk og SI≥8 høj RAGE udtryk

statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS statistisk programpakke (SPSS-version 19,0.; SPSS, Chicago, IL, USA). En parrede-prøver t-test blev anvendt til at sammenligne de vrede mRNA og protein niveauer i kræft og tilstødende noncancerous vævsprøver. Mann-Whitney U test eller Pearson Chi-square test blev anvendt til at sammenligne de SI point, som immunhistokemisk analyse af GC og tilsvarende normalt mucosavæv. Forholdet mellem RAGE-ekspression og klinisk-patologiske karakteristika blev analyseret under anvendelse af Pearson Chi-square test. Overlevelseskurver blev beregnet efter den Kaplan-Meier-metoden og analyseret under anvendelse af log-rank test. Cox proportionel risiko regressions model blev brugt til univariate og multivariate analyse for at vurdere hazard ratio (HR) og identificere faktorer, der forudsiger overlevelse. En to-sidet p-værdi. ≪ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Overekspression af RAGE i human GC

For at belyse den rolle RAGE i GC udvikling og progression, vi først analyseret sit udtryk i GC prøver og matches tilstødende noncancerous væv på mRNA niveau. Real-time kvantitativ RT-PCR-analyse viste, at RAGE blev overudtrykt i de fleste GC væv sammenlignet med deres normale modparter (19/30; 63,3%) (figur 1). RAGE blev ligeledes opreguleret på proteinniveauet i GC, som vist ved Western blot og IHC assays. Forhøjet RAGE ekspressionsniveau blev fundet af Western blotting-analyse i 26 af 30 (86,7%) GCS sammenlignet med normale væv (fig 2). Paraffinindlejrede blokke (n = 249) fra 180 GC patienter blev bedømt for RAGE-proteinekspression ved IHC (tabel 1). Fraværende eller lav farvning (SI < 8) med normal gastrisk mucosa blev observeret i 55 af 69 tilfælde (79,7%), hvorimod høj-farvning (SI≥8) blev bemærket i de fleste GC væv (111/180; 61,7%). RAGE udtryk var signifikant højere i GC væv (n = 180; SI = 6.22) sammenlignet med normale gastrisk væv (n = 69; SI = 2,09; P
< 0,001). Repræsentative eksempler på svage, moderate, stærke farvning (mikrografier med 200 × forstørrelse) er vist i figur 3.

Foreningen af ​​RAGE udtryk med klinisk-patologiske karakteristika

Baseret på de kategorier, som vi definerede i afsnittet Metoder, viste data, at høj ekspression af RAGE var signifikant korreleret med histologisk bedømmelse ( P
= 0,002), nodal status (N etape, P
= 0,025), metastaser status (M fase, P
= 0,002) og AJCC fase ( P
= 0,020), men var ikke med køn, alder, tumorstørrelse, tumor placering, Lauren klassifikation eller tumor invasion (tabel 2).

Sammenhæng mellem RAGE udtryk baseret på IHC og patient overlevelse

Kaplan-Meier-kurve viste, at patienter i høj-RAGE gruppe havde en betydeligt værre samlet overlevelse end patienter i lav-RAGE gruppe ( P
< 0,001, fig 4A). Patienter med højt RAGE udtryk havde også et betydeligt værre samlede overlevelse end dem med lav ekspression af RAGE i AJCC stadie III /IV undergruppe (n = 136; P
< 0,001, Fig 4C), men ikke i den AJCC fase i /II undergruppe (n = 44; P
= 0,695, fig 4B).

univariate og Multivariate analyser

univariat analyse viste en signifikant sammenhæng mellem den samlede overlevelse og alder, tumorinvasion, nodal status, metastase status, AJCC fase og RAGE-ekspression (se tabel 3). Alle disse faktorer er medtaget i en multivariat Cox proportionel risiko model til at justere for effekten af ​​de kovariater. Baseret på denne model, RAGE ekspressionsniveauerne (hazard ratio (HR) = 2.143, 95% konfidensinterval (95% CI) = 1,357-3,383; P
= 0,001) og tumor invasion (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297 til 96,874; P
= 0,028) blev bekræftet som selvstændige prognostiske faktorer (tabel 3)

diskussion

GC stadig en af ​​de mest dødelige menneskelige maligniteter. , især i Østasien. Trods fremskridt i diagnose og terapi, er prognosen for mavecancer er stadig dystre og er afhængig af en række carcinom egenskaber, såsom tumorvækst, differentiering, invasion og fjernmetastase [15]. GC tumorigenese og progression er dårligt forstået, komplekse, flertrinsprocesser reguleret af indre og ydre cellulære signaler involverer flere gen og protein ændringer. Det er vigtigt at identificere og forstå de molekylære mekanismer der ligger til grund tumor initiering og progression at udvikle rationelle og kræft-specifikke tilgange til tidlig diagnosticering og behandling af GC.

I denne undersøgelse undersøgte vi RAGE udtryk status i GC på både mRNA og protein niveauer og fandt, at RAGE blev bemærkelsesværdigt opreguleret i humane GC væv sammenlignet med normalt gastrisk epitel. IHC analyse blev udført for yderligere at validere denne opregulering af RAGE udtryk i primær GC. Vi observerede, at et højt niveau af RAGE-ekspression signifikant associeret med den histologiske kvalitet, nodal status, metastaser status, og AJCC etape i GC, svarende til tidligere resultater i OSCC og NSCLC [9,10]. Tilsammen foreslog disse resultater, at RAGE kan være involveret i GC progression.

Vi bestemt også for første gang, at RAGE udtryk er en stærk indikator for dårlig prognose for GC patienter, svarende til fund i kolorektal cancer, hepatocellulært cancer, OSCC og NSCLC [9,10,16,17]. den prognostiske betydning af RAGE udtryk synes imidlertid at variere alt efter kræft fase (figur 4). I den foreliggende undersøgelse overlevelsesanalyse foreslået, at tumorinvasion og RAGE-ekspression uafhængigt forudsagt dårlig samlet overlevelse. De relativt små stikprøvestørrelser af fase I og II gruppe kan være ansvarlig for forskellen. De fleste patienter med GC i Kina er diagnosticeret i de fremskredne stadier på grund af en mangel på effektiv tidlig påvisning. Derudover RAGE-ekspression har et snævrere 95% CI og synes at være aa bedre prædiktor for GC sammenlignet med tumorinvasion i denne undersøgelse.

RAGE er en mønstergenkendelse receptor, som binder flere ligander afledt fra en beskadiget celle miljø, og spiller en afgørende rolle i at fremme mave tumorudvikling [18]. Også som en vigtig inflammatorisk mediator, kunne RAGE modulere krydstale mellem overlevelse veje og autofagi i tumorceller og fremme tumor overlevelse via opretholde autofagi og begrænse apoptose [19]. Kuniyasu et al
. [11] har rapporteret, at, RAGE udtryk er tæt forbundet med invasionen og metastaser i GC patienter, som giver os en eksperimentel basis for den funktionelle undersøgelse af RAGE i mavekræft. Efterfølgende Xu og kolleger [12] viste, at knockdown af RAGE reduceret GC celledeling og invasion af mavekræft, nedsat udtryk for AKT, PCNA og MMP-2, og induceret celle apoptose og cyklus anholdelse. Derfor målrettet hæmning af RAGE eller dets ligander kan tjene som nye mål for at forbedre de nuværende behandlinger mod kræft.

Til dato, værdien af ​​at målrette RAGE for mulig tidlig indgriben og forebyggelse i GC er fortsat uklart. Imidlertid har flere undersøgelser viste rolle RAGE i andre typer kræft og har vist, at blokaden af ​​RAGE nedsat vækst og metastaser af både implanterede tumorer og tumorer udvikler spontant i modtagelige mus. Hæmning af RAGE nedsat proliferation i brystkræftceller og induceret celle apoptose og hæmmede prostatakræft vækst [20,21]. RAGE dysfunktion hæmmede også angiogenese og progression af kolorektal cancer, og forlængede overlevelsen i bugspytkirtelkræft [22-24]. Blokade af RAGE med opløselig RAGE (sRAGE) svækket leverskade, og derved forbedre overlevelse, beskyttelse mod hepatocellulær nekrose, og øge ekspressionen af ​​proregenerative cytokin tumornekrosefaktor-a [25]. Desuden Moy et al. [26] fundet et grænsetilfælde statistisk signifikant omvendt sammenhæng mellem kontinuerlig sRAGE eksponering og leverkræft risiko, hvilket tyder på, at sRAGE kan beskytte mod de inflammatoriske virkninger forårsaget af RAGE aktivering. Disse resultater konsekvent angivet, at RAGE kan også fungere som en potentiel terapeutisk mål i GC. I betragtning af dets biologiske karakteristika, RAGE og dets derivater er blevet betragtet som en ny indikator for malignt potentiale, herunder GC. Den RAGE Gly ^{82Ser polymorfi har vist sig at være forbundet med en øget risiko for GC udvikling eller progression på et hospital-baseret case-kontrol undersøgelse [13].}

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at opregulering af RAGE-ekspression blev signifikant associeret med dårlige klinisk-patologiske karakteristika og dårlig samlet overlevelse, hvilket antyder, at det kan bidrage til maligne potentiale GC. Derfor kunne RAGE derfor tjene som en værdifuld roman biomarkør til at forudsige prognosen og et potentielt terapeutisk mål for patienter med GC. Imidlertid er yderligere undersøgelser berettiget til at klarlægge de underliggende mekanismer af RAGE overekspression, hvilket bidrager til en bedre forståelse og videreudvikle dets potentielle anvendelse.

Tak

Vi takker Dr. Yan Xiao og Dr. Liang Zhao fra Institut for Patologi for patologisk diagnose og bekræftelse af IHC resultater.

• PLoS ONE: den prognostiske betydning af Forbehandling Serum CEA Niveauer i Gastric Cancer: En metaanalyse Herunder 14651 Patients
• PLoS ONE: LAPTM4B-35, Er en cancerrelateret gen, associeret med dårlig prognose i TNM Stadier I-III Gastric Cancer Patients