Plos ONE: Čezmerno izražanje receptorja za napredno Glycation končnih proizvodov (RAGE) je povezana s slabo prognozo želodčnega raka

Povzetek

Ozadje

receptor za napredne Glycation končnih proizvodov (bes) je onkogeni multidisciplinarni trans-membranska receptor, ki se prekomerno v več oblikah raka. Nedavno je bilo dokazano, da je RAGE vključen tudi v karcinogeneze in tumorske invazije. V tej študiji smo raziskovali raven izražanja in napovedno vrednost RAGE v osnovnih želodčnega raka (GC).

Metode

smo preiskali RAGE ekspresijo v primarnem GC in v parih normalno želodcu tkivo, ki ga v realnem čas kvantitativno RT-PCR (n = 30) in blotting analizo zahod (n = 30). Poleg tega smo izvedli imunohistokemično 180-parafin vgrajeni GC osebkov, 69 ujema normalnih osebkov.

Rezultati

RAGE je prekomerno v GC v primerjavi s sosednjimi noncancerous tkiv ( P
<0,001) in višje RAGE izraz bistveno povezana s histološko razredu ( P
= 0,002), vozla stanja ( P
= 0,025), status metastaz ( P
= 0,002), in Skupni odbor ameriške na odru raka ( P
= 0,020). Poleg tega Povecanje od RAGE izražanja je neodvisen napovedni dejavnik multivariatne analize z uporabo regresijski model Cox ( P
= 0,001).

Sklepi

RAGE Čezmerno lahko koristno dvojno podajo napovedati napredovanje GC in slabo prognozo

Navedba. Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, Mou T, et al. (2015) Čezmerno izražanje receptorja za napredno Glycation končnih proizvodov (RAGE) je povezana s slabo prognozo želodčnega raka. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10,1371 /journal.pone.0122697

Akademska Urednik: Valli De Re, IRCCS National Cancer Institute, ITALIJA

Prejeto: 22. november 2014; Sprejeto: 13. februar 2015; Objavljeno: 10 april 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v prispevku

Financiranje:. To delo je bilo podprto s programom državnega Key medicinska klinična Specialty, raziskovalnega sklada za javno blaginjo v industriji zdravje (No.201402015), največjega programa za znanost in tehnologijo Program Guangzhou (No.201300000087) in The National Key Technology R & D Program (No.2013BAI05B00). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

receptorja za napredno glikacije končnih izdelkov (Rage), celično površinsko molekulo, izraženo v različnih vrstah celic, je multiligand član imunoglobulina naddružina [1]. RAGE je bil vpleten v širokem spektru patoloških odzivov, vključno vnetja in raka, ki temeljijo na različnih njegovih ligandov [2]. Kot novo priznani onkogenih trans-membranskih receptorjev, je bilo dokazano, da sodeluje pri različnih človeških rakih, ki spodbujajo rast, preživetje in metastaze [3]. Številne študije so pokazale, da je RAGE molekul in izgubi svojo značilno zrnat vzorec, v primarnih tumorjih [4]. interakcija AGE-RAGE igra ključno vlogo pri razvoju raka na prostati, in oviranja te interakcije ima potencial, da postane nov molekularno tarčo za preprečevanje raka ali terapijo [5]. Co-izraz RAGE in High-mobilnosti skupino beljakovin B1 (HMGB1) je bila bistveno povezana s kolorektalnim invazijo raka in metastaz [4,6,7]. Poleg tega RAGE ekspresijo korelira z angiogenezo in tumorske metastaze v ustnem skvamoznih celic karcinoma (OSCC) in je lahko neodvisen prognostični faktor ponovitve in prognozo pri bolnikih OSCC [8,9]. Poleg tega lahko genetski polimorfizem od RAGE gena je napovedni biološki marker uporablja za zaslon za bolnike, občutljiv na termoterapiji in oceniti prognozo nedrobnoceličnim rakom pljuč (NSCLC) bolnikov [10].

Vendar pa je vloga od RAGE raka želodca (GC) je ostala nedosegljiva. RAGE je že bilo rečeno, je tesno povezana z invazijo in metastaz pri raku želodca [11]. Poleg tega so poročali, da blokada signalizacijo RAGE zatreti rast in metastaze želodčnih rakavih celic [12]. V preiskavi v vlogi RAGE v GC patogenezo in napredovanje ter učinke svojih genskih polimorfizmov na delovanje receptorjev, Gu in sodelavci [13] so pokazale, da RAGE Gly ^{82Ser polimorfizem lahko povezano s povečanim tveganjem za začetek ali napredovanje raka želodca. Kljub temu, da nam je znano, je razmerje med RAGE izražanja in GC prognozo bolnikov ni znana.}

V tej študiji smo analizirali RAGE nivo izražanja v PK z realnem času kvantitativne RT-PCR (QRT-PCR), Western blot in imunohistokemija (IHK). Identificirali smo razmerje med RAGE izražanja in clinicopathological značilnosti GC, in nato ocenili napovedno vrednost RAGE izražanja pooperativnem preživetje bolnikov GC.

izjava Etika materiale in metode

Ta študija je bila odobrena s etični odbor bolnišnice Nanfang in pisno privolitev je bila pridobljena v vseh teh bolnikov, ki sodelujejo.

Bolniki in vzorci tkiva

Trideset paru sveže zamrznjene želodca rakavi in ustreza noncancerous sluznico tkivo (izrezali > proč od roba GC 10 cm) vzorce smo zbirali od bolnikov GC v 30 minutah po resekcijo in takoj shranimo v tekočem dušiku do uporabe. Druga 180 parafin vgrajeni GC bloki tkiva in 69 kontrolnih vzorcev iz izravnanih normalnih želodca tkiv odvzetih iz oddaljenega resekcijo marže so bili pridobljeni iz shranjenih datotek Oddelka za splošne kirurgije, Bolnišnica Nangfang, Southern Medical University, so kirurško zbrani med januarjem 2007 in decembrom 2008. 180 bolnikov, vključenih 120 moških in 60 žensk, starih od 22-78 let (pomeni, 55.62 let). Nobeden od teh bolnikov so zdravili z obsevanjem ali kemoterapijo pred operacijo. Histopatološke vrsto in fazo odstranjenimi vzorcev so bili določeni v skladu z merili iz klasifikacije Svetovne zdravstvene organizacije in skupnega odbora ameriškega raka (AJCC) Rak Uprizoritev Manual (7. izdaja, 2010). Med njimi je 125 bolnikov Stage I-III prejel radikalno resekcijo (19, 25 in 81 za Faze I, II in III, v tem zaporedju), in 55 bolnikov Stage-IV prejete paliativno operacijo in /ali kemoterapijo. V-metastaze prizadela oddaljene organe pri bolnikih Stage-IV vključeni trebušne votline, oddaljeno bezgavko, jetra, prečno debelo črevo, jajčnikov ali jajcevodu, trebušno slinavko, črevesje, kosti, pljuča, možgane in slabše vena cava. Bolniki so sledili do smrti ali zadnjega spremljanja dan (30. december 2013). Mediana spremljanja, ko je bil 48 mesecev (od 2 do 82 mesecev).

Total ekstrakcijo RNA in v realnem času kvantitativne RT-PCR

Total RNA je bila vzeta iz mletega tkiv s TRIzola reagent (Takara, Japonska) in reverzno prepisana na prvi sklop cDNA z reverzno transkripcijo TaqMan Kit (Takara, Japonska). Nato smo 0.5- do 1-ul alikvotov cDNA uporabljene kot predloge za pomnoževanje RAGE fragment (naprej: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3; reverzne: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) pod naslednjimi pogoji: 95 ° C za 30 sekund; 40 ciklov 95 ° C 5s; 60 ° C 30 sekund; in se tali pri 95 ° C za 5 sekund, nato pa pri 60 ° C 1 min in hlajenju pri 50 ° C za 30 sekund. PCR in zbiranje podatkov smo izvedli na LightCycler480 sistema (Roche, švicarski) z 2 x SYBR Green master mix kit (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA). RAGE ekspresijo normalizirana tistemu GAPDH.

Western blot analizo

Western blot smo izvedli po standardnih metodah, kot je opisano predhodno [14]. Na kratko so tkiva tleh in liziramo z RIPA liznega pufra in lizate požanjemo s centrifugiranjem (12.000 rpm) pri 4 ° C 30 minut. koncentracije proteina smo se izračuna z uporabo Bicinchoninic Acid Protein testom Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Približno 50 ug Vzorce nato elektroforetsko ločili na 10% natrijevega dodecil sulfata (SDS) -polyacrylamide geli in prenesemo na poliviniliden difluorid membrano. Po blokiranje non-specifična vezavna mesta smo membrano inkubirali s kunčje poliklonalno proti RAGE protitelesa (Santa Cruz, CA, USA), pri razredčenju 1: 1000 pri 4 ° C preko noči. Po treh izpiranjih s TBST (tris pufrom s Tween-20) za 10 minut, smo membrane inkubirali s sekundarnim protitelesa pri razredčenju 1: 3000 pri sobni temperaturi 60 minut. Proteine ​​smo zaznali z izboljšano kemiluminiscentnim sistema (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA) in normalizirajo na P-aktina zazna s pomočjo miške beta-aktina protitelesa anti-humanega (1: 1000 razredčenja; Sigma, St. Louis, MO , ZDA).

Imunohistokemijsko test

IHC test izvedemo, kot je opisano prej [12,14]. Na kratko, so drsi deparaffinized z dimetilbenzen in hidracijo skozi etanol naklonu (100%, 95%, 90%, 80% in 70% etanola) v vodi. Po spiranju s PBS (-fosfatom zapufrana fiziološka raztopina soli), trikrat so drsi v vreli antigenov arhiviranje pufru 0,01 M natrijev citrat, klorovodikovo kislino (pH = 6,0), 30 minut v mikrovalovni pečici. Potem ko je bil endogene peroksidaze dejavnost gasili s 3% H _{2O 2, ki sledi treh PBS, nespecifične protiteles Vezavo blokirana z inkubacijo diapozitive z 10% normalna koza neimunsko seruma. Odseki smo nato inkubirali pri 4 ° C preko noči pri zajec poliklonska RAGE protitelesa (Santa-Cruz, CA, ZDA) je v razredčenju 1: 400 in nato inkubirali s hrenovo peroksidazo (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) pri sobni temperaturi 30 min. Po spiranju v PBS, oddelki so se nato razvili s pomočjo 3,3-V-diaminobenzidine (Sigma), speremo pod tekočo vodo iz pipe, in rahlo jih nasprotno s hematoksilinom pred dehidracijo in krovno montažo. Negativne kontrole poskuse smo izvedli z zamenjavo primarnega protitelesa s PBS.}

imunskim barvanjem smo analizirali dve neodvisni opazovalci (Y.X. in L.Ž.), ki so bili zaslepljeni, da izid pacienta in drugih clinicopathological parametrov. Sistem za zaznavanje RAGE je bil prej [12] opisano. Vsi vzorci so bili razvrščeni glede na obseg radioinkorporacijo: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. Obarvanje intenzivnost je dosegel kot 0, negativna; 1, šibek; 2, zmerna; 3, močna. Za vsak primer, skupna ocena imunskim barvanjem znan tudi kot indeks barvanja (SI), je bila izračunana tako, da se odstotek pozitivnih celic z oceno intenzivnosti obarvanja, dobimo vrednost med 0 in 12. V tej študiji je bila optimalna mejna vrednost opredeljena na naslednji način: SI < je 8 uporablja za označevanje nizko RAGE izražanja in SI≥8 visoko ekspresijo RAGE

Statistična analiza

Statistična analiza je bila opravljena s pomočjo statističnega programskega paketa SPSS (SPSS verzija 19.0.; SPSS, Chicago, IL, USA). Seznanjeno-vzorce, t-test smo uporabili za primerjavo bes mRNA in ravni beljakovin v rakavih in sosednjih vzorcev noncancerous tkiva. Test Mann-Whitneyev U ali preskus Pearson Chi-kvadrat smo uporabili za primerjavo SI rezultate, pridobljene z imunohistokemičnim analizo GC in ustrezno normalno sluznice tkivo. Razmerje med RAGE izražanja in clinicopathological značilnosti smo analizirali z uporabo Pearson Chi-kvadrat test. Krivulji preživetja smo izračunali po metodi Kaplan-Meier in analizirali s testom log-rang. Cox sorazmernih tveganj regresijski model je bil uporabljen za univariantne in multivariatne analize za oceno razmerja ogroženosti (HR) in ugotoviti dejavnike, ki napovedujejo preživetje. Obojestranskega p-vrednost. ≪ 0,05, so bile obravnavane statistično značilno

Rezultati

Čezmerno RAGE v človeški GC

Za pojasnitev vloge RAGE v razvoju GC in napredovanje, smo najprej analizirali svoj izraz v vzorcih GC poveže in sosednjih noncancerous tkiva na ravni mRNA. Realnem času kvantitativne RT-PCR analiza je pokazala, da je bila RAGE prekomerno v večini GC tkiv v primerjavi z njihovimi običajnimi kolegi (19/30; 63,3%) (slika 1). RAGE je podobno molekul na ravni proteina v GC, kot je prikazano z Western blot in IHC testih. Povišana raven RAGE ekspresijo je ugotovil, blot analizo Western pri 26 od 30 (86,7%) GK primerjavi z normalnimi tkivi (slika 2). -Parafin vgrajeni bloki (n = 249) od 180 bolnikov GC smo ovrednotili za izražanje RAGE proteina z imunohistokemijo (tabela 1). Odsoten ali nizko obarvanje (SI < 8) normalne želodčne sluznice so opazili pri 55 69 primerih (79,7%), medtem ko je bilo ugotovljeno visoko obarvanje (SI≥8) v večini GC tkiva (111/180; 61,7%). RAGE izraz je bila bistveno višja GC tkiva (n = 180; SI = 6,22) v primerjavi z običajnimi želodčnih tkiv (n = 69, SI = 2,09; P
< 0,001). Reprezentativni primeri šibkih, zmerno močnih obarvanje (posnetki s 200-kratni povečavi) so prikazani na sliki 3.

Združenje RAGE izražanja z clinicopathological značilnosti

Na podlagi kategorij, ki smo jih opredelili v oddelek metode, podatki so pokazali, da je bila visoka izraz RAGE bistveno povezana z histološke ( P
= 0,002), vozla stanja (fazi N, P
= 0,025), statusa metastaze (M faza, P
= 0,002) in faza AJCC ( P
= 0,020), vendar pa ni bilo med spol, starost, velikost tumorja, lokacija tumorja, razvrščanje Lauren ali tumorske invazije (tabela 2).

Korelacija med RAGE izražanja, ki temelji na IHC in preživetju bolnikov

krivulja Kaplan-Meier je pokazala, da so pacienti v high-RAGE skupine precej slabše skupno preživetje kot bolniki v nizko-RAGE skupina ( P
< 0,001; slika 4A). Bolniki z visokim izražanja RAGE je imel tudi precej slabše skupno preživetje kot tisti z nizko izražanje RAGE v fazi AJCC III /IV podskupin (n = 136; P
< 0,001; slika 4C), ne pa tudi v faza AJCC I /II podskupini (n = 44; P
= 0,695; slika 4B).

Univariatne in Multivariatne analize

Univariatna analiza je pokazala pomembno razmerje med splošno preživetje in starost, tumor invazija, vozla stanje, stanje metastaze, AJCC oder in RAGE izraz (glej tabelo 3). Vsi ti dejavniki so vključeni v Večvariantna Cox sorazmernih tveganj modela za prilagoditev učinkov spremenljivk. Na podlagi tega modela, ravni RAGE izraz (razmerje ogroženosti (HR) = 2.143; 95% interval zaupanja (95% CI) = 1,357-3,383; P
= 0,001) in tumorska invazija (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297-96,874; P
= 0,028) je bilo potrjeno, neodvisnih napovednih dejavnikov (tabela 3)

Pogovor

GC ostaja eden od najbolj usodnih človekovih malignih bolezni. , predvsem v vzhodni Aziji. Kljub napredku v diagnostiki in zdravljenju, je prognoza za raka želodca, je še vedno žalostna in je odvisna od niza značilnosti karcinomom, kot so tumorske rasti, diferenciacije, invaziji in oddaljenih metastaz [15]. GC tumorigeneze in napredovanje so slabo razume, kompleksne, večstopenjski procese z notranjo in zunanjo celičnih signalov, ki vključujejo več genov in beljakovin spremembe regulirane. Nujno je treba identificirati in razumeti molekularne mehanizme, na katerem temelji pričetka tumorja in napredovanje za razvoj racionalne in raka specifične pristope k zgodnji diagnozi in zdravljenju GC.

V tej študiji smo raziskovali stanje RAGE izraz v GC na ravni mRNA in koncentracije proteina in ugotovljeno je bilo, da RAGE izredno povečana pri človeških GC tkiva v primerjavi z običajnim želodčnega epitela. IHC analiza je bila opravljena za dodatno potrditev tega uravnavanjem RAGE izražanja v primarnem GC. Opazili smo, da je visoka raven RAGE izražanja značilno povezana z histološke zgradbe, vozlišča statusa, statusa metastaz in AJCC fazi GC, podobno kot v predhodnih ugotovitev v OSCC in NSCLC [9,10]. Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da se RAGE lahko sodelujejo pri napredovanju GC.

Ugotovili smo tudi prvič, da RAGE izraz je močan napovednik slabo prognozo pri bolnikih, GC, podobna ugotovitev v kolorektalnim rakom, jetrnih celic rak, OSCC in pljuč [9,10,16,17]. Vendar pa se zdi, da napovedni vpliv RAGE izražanja razlikujejo glede na stopnjo raka (slika 4). V tej študiji, analiza preživetja predlagal, da tumor invazija in RAGE izraz neodvisno napovedano slabo splošno preživetje. Relativno majhne velikosti vzorcev v fazi I in skupine II je lahko odgovoren za razliko. Večina bolnikov z GC na Kitajskem so bile ugotovljene v v poznejših fazah zaradi pomanjkanja učinkovitega zgodnjega odkrivanja. Poleg tega RAGE ekspresijo ima ožji 95% CI in zdi se, da je aa boljši napovednik za GC primerjavi s tumorsko invazijo v tej študiji.

RAGE priznanje receptor vzorec, ki se veže več ligande, ki izhajajo iz okolja poškodovanega celic, in igra ključno vlogo pri spodbujanju prebavila tumourigenesis [18]. Tudi kot pomemben vnetno posrednika, lahko RAGE modulirajo presluha med poti preživetja in avtofagija v tumorskih celicah in spodbujanje preživetje tumorja po ohranjanju avtofagija in omejevanje apoptozo [19]. Kuniyasu et al
. [11] so poročali, da je RAGE izraz tesno povezana z invazijo in metastaz pri bolnikih GC, ki nam zagotavlja eksperimentalno osnovo za funkcionalno študija RAGE raka želodca. Kasneje, Xu in sodelavci [12] je pokazala, da je rasklapanje za RAGE zmanjša GC celično proliferacijo in invazijo na raka želodca, zmanjšana ekspresija Akt, PCNA in MMP-2 in inducira apoptozo celic in aretaciji cikla. Zato ciljno zaviranje RAGE ali njegovih ligandov lahko služi kot nove cilje za izboljšanje trenutne terapije raka.

Do sedaj je vrednost ciljanje RAGE za morebitno zgodnje ukrepanje in preventivo v PK ostaja nejasna. Vendar pa so številne študije pokazale vlogo RAGE pri drugih vrstah raka in so dokazali, da je blokada RAGE zmanjšala rast in metastaze obeh vsajenih tumorjev in tumorjev spontano v razvoju pri dovzetnih miših. Zaviranje RAGE zmanjšal proliferacijo rakavih celic dojke in povzročeno apoptozo celic in zavrla rast raka prostate [20,21]. RAGE disfunkcija zaviral tudi angiogenezo in napredovanje raka na debelem črevesu, in podaljša preživetje pri raku trebušne slinavke [22-24]. Blokada RAGE s topnim RAGE (sRAGE) oslabljen poškodbe jeter, s čimer se izboljša preživetje, zaščito pred jetrnih nekrozo in krepitev izražanje proregenerative citokinov faktorja tumorske nekroze-a [25]. Poleg tega Moy sod. [26] ugotovila mejno statistično značilno inverzno povezavo med neprekinjeno izpostavljenostjo sRAGE in tveganje za raka na jetrih, kar kaže, da se lahko sRAGE zaščiti pred vnetnih učinkov z aktivacijo RAGE povzročajo. Te ugotovitve dosledno kažejo, da RAGE lahko deluje tudi kot potencialnega terapevtskega cilja v PK. Glede na svoje biološke lastnosti, RAGE in njeni derivati ​​so bile upoštevane kot novega kazalnika malignega potenciala, vključno z GC. Bes Gly ^{je 82Ser polimorfizem pokazala, da je povezana s povečanim tveganjem za razvoj GC ali napredovanje v študiji, ki temelji na bolnišničnih primerov in kontrol [13].}

V tej raziskavi smo ugotovili, da Povecanje za RAGE izražanja je bila značilno povezana s slabimi clinicopathological lastnosti in slabe celokupno preživetje, kar pomeni, da lahko prispeva k maligni potencial GC. Zato bi RAGE zato služi kot dragocena nova biomarker za napoved prognoze in potencialno terapevtski cilj pri bolnikih z GC. Vendar pa so nadaljnje študije upravičeno razjasniti temeljne mehanizme RAGE prekomerno, kar bo prispevalo k boljšemu razumevanju in nadaljnji razvoj možno uporabo.

Priznanja

Zahvaljujemo se dr Yan Xiao in dr Liang Zhao iz oddelka za patologijo za patološko diagnozo in potrditev rezultatov IHC.

• Plos ONE: napovednih Pomen Predhodna obdelava Serum CEA ravneh želodčnega raka: metaanalizi Z 14.651 Patients
• Plos ONE: LAPTM4B-35, Rak-Related Gene, je povezana s slabo prognozo na TNM Faze I-III želodca Rak Patients