PLoS ONE: Overuttrykte av Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) er assosiert med dårlig prognose i Gastric Cancer

Abstract

Bakgrunn

reseptor for avanserte glycation sluttprodukter (RAGE) er en onkogen tverrfaglig trans-membran reseptor, som er overuttrykt i flere kreft hos mennesker. Nylig har det blitt vist at RAGE er også involvert i kreftutvikling og tumorinvasjon. I denne studien undersøkte vi uttrykket nivåer og prognostisk verdi av RAGE i grunnskolen mage kreft (GC).

Metoder

Vi undersøkte RAGE uttrykk i grunnskolen GC og sammenkoblede normal mage vev av real- tid kvantitativ RT-PCR (n = 30) og Western blotting-analyse (n = 30). I tillegg utførte vi immunhistokjemi på 180 parafininnstøpte GC prøver, 69 matchet normale prøver.

Resultater

RAGE ble overuttrykt i GC sammenlignet med de tilstøtende noncancerous vev ( P
<0,001), og høyere RAGE uttrykk signifikant korrelert med histologisk grad ( P
= 0,002), lymfeknutestatus ( P
= 0,025), metastasestatus ( P
= 0,002), og amerikanske Joint Committee on Cancer scenen ( P
= 0,020). Videre oppregulering av RAGE uttrykk er en uavhengig prognostisk faktor i multivariat analyse ved hjelp av Cox regresjonsmodellen ( P
= 0,001).

Konklusjoner

RAGE Overuttrykte kan være et nyttig markør for å forutsi GC progresjon og dårlig prognose

Citation. Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, Mou T, et al. (2015) Overuttrykte av Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) er assosiert med dårlig prognose i magekreft. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10,1371 /journal.pone.0122697

Academic Redaktør: Valli De Re, IRCCS National Cancer Institute, ITALIA

mottatt: 22 november 2014; Godkjent: 13 februar 2015; Publisert: 10 april 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Program for National Key klinisk medisinsk spesialitet, Forskningsfondet for offentlig velferd i Health Industry (No.201402015), Major Program of Science and Technology program for Guangzhou (No.201300000087), og The National Key Technology R & D program (No.2013BAI05B00). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

reseptoren for erfarne glykerte endeprodukter (RAGE), et celleoverflatemolekyl uttrykt på en rekke celletyper, er et multiligand medlem av immunglobulin super [1]. RAGE har vært implisert i et vidt spektrum av patologiske responser, inkludert betennelse og kreft, basert på variasjonen av sine ligander [2]. Som et nylig anerkjent onkogen trans-membran-reseptorer, har det vist seg å være involvert i mange humane krefttyper stimulerer vekst, overlevelse, og metastatisk spredning [3]. Flere studier har vist at RAGE er oppregulert og mistet sin karakteristiske kornet mønster i primærsvulster [4]. Den AGE-RAGE samhandling spiller en avgjørende rolle i utviklingen av prostatakreft, og hemme dette samspillet har potensial som en ny molekylære mål for kreft forebygging eller behandling [5]. Co-uttrykk for RAGE og High-mobilitet gruppe protein B1 (HMGB1) har blitt betydelig forbundet med tykktarmskreft invasjon og metastase [4,6,7]. I tillegg korrelerer RAGE uttrykk med angiogenese og metastase i muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) og kan være en uavhengig prognostisk faktor for tilbakefall og prognose i OSCC pasienter [8,9]. Videre kan genetisk polymorfisme av RAGE genet være en prediktiv biomarkør brukes til skjermen for pasienter som er sensitive til thermo og å vurdere prognose av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter [10].

Men rollen av RAGE i magekreft (GC) har vært unnvikende. RAGE har tidligere blitt indikert nært forbundet med invasjon og metastasering i magekreft [11]. Videre ble det rapportert at blokade av RAGE signaletrykt vekst og metastaser av magekreftceller [12]. I en undersøkelse i rollene som RAGE i GC patogenesen og progresjon og virkningene av sine gener polymorfismer på reseptor funksjon, Gu og kolleger [13] har vist at RAGE Gly ^{82Ser polymorfi kan være forbundet med en økt risiko for initiering eller progresjon av magekreft. Men til vår kunnskap, er forholdet mellom RAGE uttrykk og GC pasient prognose ukjent.}

I denne studien analyserte vi RAGE uttrykk nivå i GC ved hjelp av sanntids kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR), Western blotting og immunhistokjemi (IHC). Vi identifiserte en sammenheng mellom RAGE uttrykk og clinicopathological funksjonene i GC, og deretter evalueres den prognostiske verdien av RAGE uttrykk for postoperativ overlevelsen av GC pasienter.

Materialer og metoder

Etikk uttalelse

Denne studien ble godkjent av Nanfang Hospital Etisk Komité og skriftlig informert samtykke ble innhentet av alle disse pasientene involvert.

pasienter og prøver vev

Thirty paret fersk frosset mage kreft og tilsvarende noncancerous mucosavev (spaltet > 10 cm fra kanten av GC) prøver ble samlet fra GC-pasienter innen 30 min etter reseksjon og umiddelbart lagret i flytende nitrogen inntil bruk. En annen 180 parafin innebygd GC vevsblokker og 69 kontrollprøver fra matchet normale mage vev tatt fra distal reseksjon margin ble innhentet fra de lagrede filene ved Institutt for generell kirurgi, Nangfang Hospital, Southern Medical University, ble samlet kirurgisk mellom januar 2007 og desember 2008. De 180 pasienter inkludert 120 menn og 60 kvinner i alderen 22-78 år (gjennomsnitt, 55.62 år). Ingen av disse pasientene ble behandlet med strålebehandling eller kjemoterapi før operasjonen. Den histopatologiske type og stadium av resected prøvene ble bestemt i henhold til kriteriene i Verdens helseorganisasjon klassifisering og amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual (7. utgave, 2010). Blant dem, 125 pasienter trinn I-III har mottatt radikal reseksjon (19, 25 og 81 for trinn I, II og III, henholdsvis), og 55 trinn-IV pasienter mottok palliativ kirurgi og /eller kjemoterapi. De metastaserammede fjerne organer i Stage-IV pasienter inkludert bukhinnen, fjernt lymfeknute, lever, tverrgående kolon, eggstokk eller eggleder, bukspyttkjertel, tarm, bein, lunger, hjerne og nedre vena cava. Pasientene ble fulgt inntil død eller siste oppfølgingsdato (30.12.2013). Median oppfølgingstid var 48 måneder (fra 2 til 82 måneder).

Total RNA ekstraksjon og sanntids kvantitativ RT-PCR

Total RNA ble ekstrahert fra hakket Vev med TRIzol reagens (Takara, Japan) og revers transkribert til første-cDNA med TaqMan Reverse Transcription Kit (Takara, Japan). Deretter ble 0,5- til en-ul porsjoner av cDNA brukes som maler for å forsterke RAGE fragment (frem: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3; omvendt: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) på følgende vilkår: 95 ° C i 30 s; 40 sykluser av 95 ° C i 5 s; 60 ° C i 30 s; og smelter ved 95 ° C i 5 sekunder, etterfulgt av 60 ° C i 1 min, og avkjøling ved 50 ° C i 30 sek. PCR og datainnsamling ble utført på LightCycler480 System (Roche, sveitsisk) med 2 × SYBR Grønn mester mix kit (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). RAGE ekspresjon ble normalisert til den for GAPDH.

Western blot-analyse

Western blotting ble utført i henhold til standardmetoder som er beskrevet tidligere [14]. I korthet vev ble malt og lysert med RIPA-lyseringsbuffer, og lysatene ble høstet ved sentrifugering (12.000 rpm) ved 4 ° C i 30 minutter. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Omtrent 50 pg prøver ble deretter separert elektroforetisk på 10% natrium-dodecyl-sulfat (SDS) -polyacrylamide geler og overført til en membran polyvinylidendifluorid. Etter blokkering av ikke-spesifikke bindingsseter, ble membranen inkubert med et kanin polyklonalt anti-RAGE-antistoff (i Santa-Cruz, CA, USA) ved en 1: 1000 fortynning ved 4 ° C over natten. Etter tre vaskinger med TBST (tris-bufret saltvann med Tween-20) i 10 minutter, ble membranene inkubert med et sekundært antistoff i en fortynning på 1: 3000 ved romtemperatur i 60 min. Proteiner ble påvist med en forbedret kjemiluminescens-system (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA), og normalisert til p-actin påvist ved anvendelse av et muse-anti-human β-aktin-antistoff (1: 1000 fortynning, Sigma, St. Louis, MO , USA).

Immunhistokjemisk analyse

IHC analysen ble utført som tidligere beskrevet [12,14]. I korthet, ble objektglassene deparaffinized med dimetylbenzen og rehydrert gjennom en etanol-gradient (100%, 95%, 90%, 80% og 70% etanol) i vann. Etter vasking med PBS (fosfatbufret saltløsning) i tre ganger, ble objektglass kokt i antigen gjenfinning buffer, 0,01 M natrium-citrat-saltsyre (pH = 6,0), i 30 minutter i en mikrobølgeovn. Etter endogen peroksidase-aktivitet ble stanset med 3% H _{2o 2, etter at tre PBS-vaskinger, ikke-spesifikk binding ble blokkert ved inkubering av lysbildene med 10% normalt geiteserum ikke-immune. Seksjonene ble deretter inkubert ved 4 ° C over natten med kaninpolyklonalt RAGE-antistoff (i Santa-Cruz, CA, USA) ved en 1: 400-fortynning og deretter inkubert med pepperrot peroksidase (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) ved romtemperatur i 30 minutter. Etter vasking i PBS, ble seksjonene deretter utviklet ved hjelp av 3,3-V-diaminobenzidin (Sigma), vasket i rennende vann fra springen, og lett kontra med hematoksylin før dehydrering og dekkmontering. Negative kontrollforsøk ble utført ved å erstatte den primære antistoff med PBS.}

Farging ble analysert ved to uavhengige observatører (Y.X. og L.Z.) som ble blindet for pasientens utfall og andre clinicopathological parametere. Den RAGE deteksjonssystemet er blitt beskrevet tidligere [12]. Alle prøver ble kategorisert av omfanget av immunreaktivitet: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. Fargeintensitet ble scoret som 0, negativ; 1, svak; 2, moderat; 3, sterk. For hvert tilfelle ble den totale immunfarging stillingen også kjent som den fargeindeks (SI) ble beregnet ved å multiplisere prosentandelen av positive celler med fargingsintensitet, hvilket ga en verdi mellom 0 og 12. For denne studien ble en optimal verdi var cutoff identifisert som følger: SI < 8 ble brukt for å indikere lav RAGE uttrykk og SI≥8 høy RAGE uttrykk

statistisk analyse

statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS statistisk programvare pakken (SPSS versjon 19.0.; SPSS, Chicago, IL, USA). En sammenkoblede-samples t-test ble brukt for å sammenligne raseri mRNA og proteinnivået i kreft og tilstøtende noncancerous vevsprøver. Mann-Whitney U test eller Pearson Chi-Square test ble brukt for å sammenligne SI skårer oppnådd ved immunhistokjemisk analyse av GC og tilsvarende normal mucosavev. Forholdet mellom RAGE uttrykk og clinicopathological egenskaper ble analysert ved bruk av Pearson Chi-kvadrat test. Overlevelseskurver ble beregnet i henhold til Kaplan-Meier-metode og analysert ved hjelp av log-rank test. Den Cox regresjonsmodell ble brukt for univariat og multivariat analyse for å vurdere hazard ratio (HR) og identifisere faktorer som forutsier overlevelse. En tosidig p-verdi. ≪ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant

Resultater

Overuttrykte RAGE i menneskelig GC

For å belyse hvilken rolle RAGE i GC utvikling og progresjon, vi først analysert dens uttrykk i GC prøver og matchet tilstøtende noncancerous vev på mRNA-nivå. Real-time kvantitativ RT-PCR-analyse viste at RAGE ble overuttrykt i de fleste GC vev sammenlignet med sine vanlige kolleger (19/30; 63,3%) (figur 1). RAGE ble på lignende måte oppregulert på proteinnivået i GC, som vist ved Western blot og IHC-analyser. Forhøyet RAGE uttrykk nivået ble funnet ved Western blotting-analyse i 26 av 30 (86,7%) GCer sammenlignet med normalt vev (fig 2). Parafininnstøpte blokker (n = 249) fra 180 GC-pasienter ble evaluert for RAGE-protein ekspresjon av IHC (tabell 1). Fraværende eller lav farging (SI < 8) av normal gastrisk mukosa ble observert i 55 av 69 tilfeller (79,7%), mens høy farging (SI≥8) ble observert i de fleste vev (GC 111/180; 61,7%). RAGE ekspresjon var signifikant høyere i GC vev (n = 180; SI = 6,22) sammenlignet med normal gastrisk vev (n = 69; SI = 2,09; P
< 0,001). Representative eksempler på svake, moderate sterk farging (mikrografer med 200 × forstørrelse) er vist i figur 3.

Association of RAGE uttrykk med clinicopathological egenskaper

Basert på de kategoriene som vi definert i metodedelen, viste dataene at den høye uttrykk for RAGE var signifikant korrelert med histologisk grad ( P
= 0,002), lymfeknutestatus (N scenen, P
= 0,025), metastasestatus (M scenen, P
= 0,002) og AJCC scenen ( P
= 0,020), men var ikke med kjønn, alder, tumorstørrelse, tumor beliggenhet, Lauren klassifisering eller tumorinvasjon (tabell 2).

Sammenheng mellom RAGE uttrykk basert på IHC og pasient overlevelse

Kaplan-Meier kurve viste at pasientene i high-RAGE gruppen hadde en signifikant dårligere total overlevelse enn pasienter i lav-RAGE gruppe ( P
< 0,001; figur 4A). Pasienter med høy RAGE uttrykk hadde også en betydelig dårligere total overlevelse enn de med lav uttrykk for raseri i AJCC stadium III /IV undergruppe (n = 136; P
< 0,001; figur 4C), men ikke i den AJCC stadium i /II undergruppe (n = 44; P
= 0,695; figur 4B).

Univariate og Multivariate analyser

Univariat analyse viste en signifikant sammenheng mellom generelle overlevelse og alder, tumorinvasjon, nodal status, status metastase, AJCC stadium og RAGE uttrykk (se tabell 3). Alle disse faktorer er tatt i en multivariat Cox-modellen for å korrigere for effektene av kovariatene. Basert på denne modellen, RAGE uttrykk nivåer (hazard ratio (HR) = 2.143; 95% konfidensintervall (95% KI) = 1,357 til 3,383; P
= 0,001) og tumorinvasjon (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297 til 96,874; P
= 0,028) ble bekreftet som uavhengige prognostiske faktorer (Tabell 3)

Diskusjoner

GC fortsatt en av de mest dødelige menneskelige kreftformer. , spesielt i Øst-Asia. Til tross for fremskritt i diagnose og terapi, er prognosen for magekreft fremdeles sturen og er avhengig av en rekke karsinom egenskaper, slik som tumorvekst, differensiering, invasjon og metastase fjernt [15]. GC tumorigenesis og progresjon er dårlig forstått, komplekse, flertrinnsprosesser regulert av indre og ytre cellulære signaler som involverer flere gen- og protein endringer. Det er viktig å identifisere og forstå de molekylære mekanismene som ligger til grunn tumor initiering og progresjon for å utvikle rasjonelle og kreftspesifikke tilnærminger til tidlig diagnostisering og behandling av GC.

I denne studien har vi undersøkt RAGE uttrykk status på GC på både mRNA og proteinnivåer og funnet ut at RAGE ble bemerkelsesverdig oppregulert i menneskelige GC vev sammenlignet med normal mage epitel. IHC analyse ble utført for ytterligere å validere denne oppregulering av RAGE uttrykk i primær GC. Vi har observert at et høyt nivå av RAGE-ekspresjon ble signifikant assosiert med den histologiske grad, nodal status, status metastase, og AJCC stadium i GC, i likhet med tidligere funn i OSCC og NSCLC [9,10]. Samlet utgjør disse resultatene antydet at RAGE kan være involvert i GC progresjon.

Vi har også bestemt for første gang at RAGE uttrykk er en sterk prediktor for dårlig prognose for GC pasienter, tilsvarende funn i kolorektal kreft, lever kreft, OSCC og NSCLC [9,10,16,17]. Imidlertid synes den prognostiske betydningen av RAGE uttrykk for å variere etter kreft stadium (figur 4). I denne studien, overlevelsesanalyse antydet at tumorinvasjon og RAGE uttrykk uavhengig spådd dårlig total overlevelse. De relativt små utvalg av stadium I og II gruppe kan være ansvarlig for forskjellen. De fleste pasienter med GC i Kina er diagnostisert i de avanserte stadier på grunn av mangel på effektiv tidlig deteksjon. I tillegg har RAGE uttrykk en smalere 95% CI og ser ut til å være aa bedre prediktor for GC sammenlignet med tumorinvasjon i denne studien.

RAGE er et mønstergjenkjenning reseptor som binder flere ligander avledet fra en skadet celle miljø, og spiller en avgjørende rolle i å fremme gastrointestinal tumorgenesen [18]. Også som en viktig inflammatorisk megler, kan RAGE modulere crosstalk mellom overlevelse trasé og autofagi i tumorceller og fremme svulst overlevelse via opprettholde autofagi og begrense apoptose [19]. Kuniyasu et al
. [11] har rapportert at, RAGE uttrykk er nært knyttet til invasjon og metastasering i GC pasienter, noe som gir oss en eksperimentell basis for den funksjonelle studier av RAGE i magekreft. Deretter Xu og kolleger [12] viste at knockdown av RAGE redusert GC celleproliferasjon og invasjon av magekreft, redusert uttrykk for AKT, PCNA og MMP-2, og indusert celle apoptose og syklus arrest. Derfor målrettet hemming av RAGE eller dets ligander kan tjene som nye mål å forbedre dagens kreftbehandlingen.

Til dags dato, verdien av målretting RAGE for mulig tidlig intervensjon og forebygging i GC er fortsatt uklart. Imidlertid har flere studier vist seg rollen som RAGE i andre krefttyper, og har vist at blokaden av RAGE redusert vekst og metastaser av både implantert svulster og svulster utvikler spontant hos følsomme mus. Hemming av RAGE redusert spredning i brystkreftceller og indusert celle apoptose og hemmet prostatakreft vekst [20,21]. RAGE Dysfunction også hemmet angiogenese og progresjon av tykktarmskreft, og forlenget overlevelse i bukspyttkjertelkreft [22-24]. Blokade av RAGE med løselig RAGE (sRAGE) svekket leverskade, og dermed bedre overlevelse, beskytter mot hepatocellulær nekrose, og styrke uttrykk for proregenerative cytokin tumor nekrose faktor-a [25]. Videre Moy et al. [26] fant en border statistisk signifikant invers assosiasjon mellom kontinuerlig sRAGE eksponering og leverkreft risiko, noe som tyder på at sRAGE kan beskytte mot de inflammatoriske effekter forårsaket av RAGE aktivering. Disse funnene indikerer at gående RAGE kan også fungere som et potensielt terapeutisk mål på GC. På grunn av dets biologiske egenskaper, RAGE og dets derivater er blitt betraktet som en ny indikator for maligne potensial inklusive GC. Den RAGE Gly ^{82Ser polymorfisme har vist seg å være assosiert med økt risiko for GC utvikling eller progresjon i en sykehusbasert case-control studie [13].}

I denne studien fant vi at oppregulering av RAGE uttrykk var signifikant assosiert med dårlig clinicopathological egenskaper og dårlig total overlevelse, noe som tyder på at det kan bidra til ondartet potensialet i GC. Derfor RAGE kan derfor tjene som en verdifull roman biomarkør for å forutsi prognose og en potensiell terapeutisk mål for pasienter med GC. Men videre studier garantert å avklare de underliggende mekanismene for RAGE overekspresjon, og dermed bidra til bedre forståelse og videreutvikle sitt potensial bruk.

Takk

Vi takker Dr. Yan Xiao og Dr. Liang Zhao fra Avdeling for patologi for patologisk diagnose og bekreftelse av IHC resultater.

• PLoS ONE: Den Prognostic Betydningen av Forbehandling Serum CEA nivåer i Gastric Cancer: A Meta-Analysis inkludert 14651 Patients
• PLoS ONE: LAPTM4B-35, er en kreft-relaterte Gene, assosiert med dårlig prognose i TNM Stages I-III Gastric Cancer Patients