PLoS ONE: Sonic Hedgehog Pathway er afgørende for vedligeholdelse af Cancer Stem-lignende celler i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Unormal aktivering af Sonic pindsvin (SHH) vej er blevet beskrevet i en lang række humane kræftformer og i cancer stamceller (CSCS) har dog ikke været rapporteret rolle SHH vej i gastrisk CSCS. I denne undersøgelse undersøgte vi muligheden for, at unormal aktivering af SHH-vejen fastholdt karakteristika gastriske CSCS. Først identificerede vi cancer stamceller-lignende celler (CSLCs) fra humane gastrisk cancer cellelinier (HGC-27, MGC-803 og MKN-45) ved hjælp af tumorsphere kultur. Sammenlignet med adhærente celler, de flydende tumorsphere cellerne havde mere selvfornyende kapacitet og kemoresistens. De celler, der udtrykker CSCS markører (CD44, CD24 og CD133) var også signifikant mere i tumorsphere celler end i adhærente celler. Endnu vigtigere, viste in vivo xenografundersøgelser at tumorer kan genereres med 2 × 10 ^{4 tumorsphere celler, hvilket var 100 gange mindre end dem, der kræves for tumorer seeding af klæbende celler. Næste RT-PCR og Western blot viste, at ekspressionsniveauerne af ptch og Gli1 (SHH pathway målgener) var signifikant højere i tumorsphere celler end i adhærente celler. Resultaterne af kvantitative real-time PCR, var de samme som RT-PCR og Western blot. Yderligere analyse viste, at SHH vej blokeret af cyclopamin eller 5E1 forårsagede en større reduktion i selvfornyende kapacitet HGC-27 tumorsphere celler end det klæbende celler. Vi fandt også, at SHH pathway blokerer stærkt forbedret effektiviteten af ​​kemoterapeutiske lægemidler i HGC-27 tumorsphere celler in vitro og in vivo, men havde ingen signifikant virkning i adhærente celler. Endelig har vi isoleret de tumorspheres fra mavekræft prøve, disse celler havde også kemoresistens og tumorigen kapacitet, og SHH vej fastholdt mavens CSLCs karakteristika tumorsphere celler fra primær tumor prøver. Som konklusion vores data antydede, at SHH-vejen var essentiel for opretholdelse af CSLCs i human gastrisk cancer}

Henvisning:. Song Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog Pathway er afgørende for vedligeholdelse af Cancer Stem-lignende celler i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10,1371 /journal.pone.0017687

Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: November 27, 2010; Accepteret: 10. februar, 2011; Udgivet: 4 marts 2011

Copyright: © 2011 Song et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National High Technology Research and Development Program Kina (È6AA402A04,È6AA02A107), Major State Basic Research Program Kina (È9CB521704), og National Nature Science Foundation of China (.872.468,.873.031). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CSCS spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft, denne delpopulation inden tumor besidder de karakteristika selvfornyende kapacitet, kemoresistens og tumorigen kapacitet derfor kan spille en afgørende rolle i initiering, progression og gentagelse af kræft. Undersøgelse og manipulere biokemiske veje involveret i disse kendetegn er en af ​​de bedste måder at bidrage til CSCS, der fører til udvikling af nye lægemidler og behandlingsmetoder. SHH vej spiller en afgørende rolle i mange CSCS, såsom glioblastoma stamceller [1], [2], CD34 + leukæmiceller [3], [4] og bryst CSCS [5], ud over, er det afgørende for udviklingen og homeostase af gastrisk kirtel [6], kan unormal aktivering af SHH pathway resultere i gastrisk cancer [7], [8], men rolle SHH pathway i gastrisk CSCS er ikke klart.

SHH vej hos pattedyrceller medieres af ligander Shh [9]. I fravær af Shh, det transmembrane receptor patched (ptch) hæmmer aktiviteten af ​​et andet transmembrant protein, smoothened (Smo), hvilket resulterer i inaktivering af SHH pathway [9], [10]. Binding af Shh til ptch ophæver den inhibitoriske virkning af ptch, og Smo er derepresseret, for derved at aktivere transkriptionsfaktor Gli (Gli1, Gli2 og GLI3) [9], [10]. Gli1 er en stærk positiv aktivator af nedstrøms målgener og er i sig selv en transskriptionel mål på SHH pathway [11]. Derfor er Gli1 betragtes som en markør for SHH pathway unormal aktivering [10], [12]

For nylig har flere typer af CSCS eller CSLCs blevet identificeret og isoleret fra maligne tumorer [13] -. [25]. I mavekræft, metodisk, er det vanskeligt at isolere og forstærke CSCS fra cellelinier eller tumor vævsprøver. På nuværende tidspunkt, CD44 synes at være den mest nyttig markør for potentiel oprensning af gastriske CSCS, er det imidlertid ikke yderst specifik for gastriske CSCS [26].

I denne undersøgelse har vi isoleret CSLCs fra human gastrisk cancercellelinier (HGC-27, MGC-803 og MKN-45) under anvendelse tumorsphere dyrkning i serumfrit medium og identificeret selvfornyelse kapacitet, kemoresistens og tumordannende kapacitet af tumorsphere celler; Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​SHH pathway-relaterede molekyler, herunder Shh, ptch, Smo, Gli1 og Gli2 i tumorsphere celler og adhærente celler, især ekspressionen af ​​ptch og Gli1.Then, vi blokeret SHH pathway ved cyclopamin eller kontrol tomatidine, 5E1 eller kontrol PBS at undersøge, om de særlige kendetegn ved CSLCs i tumorsphere celler blev holdt ved unormal aktivering af SHH-vejen. Endelig har vi udnyttet primære gastrisk cancer prøver at analysere de funktionelle aspekter af SHH pathway i gastriske CSLCs.

Cyclopamin er en celle-permeabelt steroide alkaloid. Det forstyrrer kolesterol bio-syntese og specifikt antagoniserer SHH signalvejen gennem direkte vekselvirkning med Smo (smoothened), en fjern slægtning til G-protein-koblede receptorer. Det er et værdifuldt værktøj til undersøgelse af inddragelse af SHH signalering i udviklingen af ​​forskellige tumorer. Tomatidine er et steroidt alkaloid, der strukturelt ligner cyclopamin, men mangler evnen til at inhibere SHH signalering. Det kan anvendes som en negativ kontrol. 5E1 er en anti-Hh monoklonalt antistof, som neutraliserer den SHH og IHH aktivitet.

Resultater

1. Tumorsphere celler besad karakteristika CSLCs Salg

Vi voksede HGC-27, MGC-803 og MKN-45 adhærente celler i serum-frit medium beskrevet i metodeafsnittet. Efter 7 dage blev tumorspheres bestående af ca. 50 til 100 celler observeret (fig. 1A).

selvfornyende kapacitet i disse tumorspheres blev vurderet ved at dissociere dem i enkelt celle og vokser med en klonal densitet på 1,000 milliliter. Efter 2 uger, enkelt celle afledt fra HGC-27 tumorsphere celler genereret sub-tumorspheres på 41,83% ± 3,13% sammenlignet med 8,17% ± 2,40% af adhærente celler, i øvrigt, i MGC-803 og MKN-45, den sub-tumorspheres dannelse hastighed på tumorsphere celler var også højere end for adhærente celler. (Fig. 1B). Disse data antydede, at selvfornyende kapacitet tumorsphere celler var signifikant højere end for adhærente celler. Tumorsphere celler viste også en øget evne til at danne kolonier under forankringsuafhængige betingelser i et standard blød agar-assay efter 14 dage i HGC-27 og MKN-45 (fig. 1C).

Vi udførte også en begrænsende fortynding assay for sfæroider dannelse under anvendelse HGC-27 tumorsphere celler og adhærente celler. Som vist i tabel S1, kunne ca. 27-35% af tumorsphere celler producerer sfæroider, mens mindre end 5% af adhærente celler kunne generere sfæroider efter 3 ugers dyrkning. Derfor, i de HGC-27 tumorsphere celler, kunne vi vurderer, at sfæroiderne-dannende celler population bestod et maksimum på 35%.

kemoresistens er en anden karakteristisk for CSCS, så vi undersøgt, om en forskel i kemoresistens eksisterede mellem tumorsphere celler og adhærente celler. Resultaterne viste, at efter 48 timer, tumorsphere celler demonstrerede signifikant større resistens over for lægemidler sammenlignet med adhærente celler under de samme betingelser (fig. 1d). Vi vurderede også kemoresistens af HGC-27 tumorsphere celler og adhærente celler til forskellige koncentrationer af lægemidler, men begge tumorsphere celler og adhærente celler viste ikke signifikant kemoresistens over for lægemidler på en dosis-afhængig måde (Fig. S1).

Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​CD44 i dissocierede tumorsphere celler og adhærente celler under anvendelse immunofluorescens assay og western blot. Resultaterne viste, at celler, der udtrykker CD44 var signifikant mere i tumorsphere celler end i adhærente celler (Fig. 2A). Endvidere blev ekspressionen af ​​andre CSCS markører (CD24 og CD133) i tumorsphere celler og adhærente celler undersøgt ved Western blot, sammenlignet med tumorsphere celler, ekspression af CD24 var signifikant lavere i adhærente celler, mens ekspressionen af ​​CD133 var ens (fig . 2B). Endvidere har vi fraktioneret HGC-27 celle ved FACS sortering for CD44, fandt vi, at CD44 (+) cellefraktion kunne generere flere sfæroide kolonier sammenlignet med CD44 (-) cellefraktion, Desuden er størrelsen af ​​kugleformede kolonier fra CD44 (+) celler var større end dem fra CD44 (-) (. figur 2C). celler

2. Tumorsphere celler kunne generere tumorer upon xenotransplantation

For xenografundersøgelser, lige antal (2 × 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) af frisk dissocierede tumorsphere celler eller kontrol adhærente celler blev injiceret sc i hver mus (6 mus pr gruppe). Resultaterne viste, at tumorer blev genereret med 2 × 10 4 tumorsphere celler, som var 100 gange mindre end dem, der kræves for tumor podning af adhærente celler (tabel 1). Endvidere genererede tumorsphere celler subkutane tumorer med større volumen og kortere tid sammenlignet med dem, der frembringes fra adhærente celler (fig. 3A, B). Således subkutan injektion af lave antal tumorsphere celler bekræftede, at sfæroide-celler bibeholdt stærkere tumorigene kapacitet i nøgne mus end adhærente celler}

H &. E undersøgelse af xenotransplantater afledt af HGC-27 tumorsphere celler viste, at disse tumorer nøje lignede den oprindelige human tumor, der hovedsagelig indeholder differentierede celler (fig. 3C). Vigtigt er det, tumorspheres kunne re-afledt af de xenotransplanted tumorer (fig. 3D), og de kunne danne tumor igen (fig. 3E). Disse data indikerer derfor, at tumorsphere cellerne repræsenterede CSLCs der havde tumorigen kapacitet.

3. SHH vej blev højere udtrykt i tumorsphere celler end i adhærente celler

For at undersøge sammenhængen mellem SHH pathway og CSLCs karakteristika tumorsphere celler, vi først undersøgt mRNA'erne ekspressionen af ​​SHH pathway-relaterede molekyler, herunder Shh, ptch, smo, Gli1 og Gli2 ved RT-PCR. Resultaterne viste, at alle mRNA'erne blev højt udtrykt i HGC-27 tumorsphere celler. Sammenlignet med tumorsphere celler, ekspressionsniveauerne af Shh, ptch, Smo og Gli1 var signifikant lavere i adhærente celler, mens ekspressionsniveauerne af Gli2 lignede tumorsphere celler. I MGC-803 og MKN-45, ekspressionsniveauerne af Shh, ptch og Gli1 var også signifikant lavere i adhærente celler end i tumorsphere celler, mens ekspressionsniveauerne af Smo og Gli2 havde ingen signifikant forskel mellem adhærente celler og tumorsphere celler (Fig . 4A).

I SHH vej, ptch og Gli1 er målgener, de betragtes som vigtige markører af SHH pathway unormal aktivering. Så vi undersøgte yderligere ekspressionsniveauerne af ptch og Gli1 ved Western blot og kvantitativ real-time PCR.

Ved brug Western blot, fandt vi, at ekspressionsniveauerne af ptch og Gli1 var også højere i tumorsphere celler end i adhærente celler (fig. 4B). Vi vurderede næste ekspressionsniveauerne af ptch og Gli1 i xenotransplantater fra HGC-27 ved kvantitativ realtids-PCR. Kvantitativ realtids-PCR-analyser af SHH målgener (ptch og GLI1) viste de samme resultater af ovennævnte semi-kvantitativ RT-PCR (fig. 4C).

4. SHH pathway blokering reducerede selvfornyende kapacitet og kemoresistens af HGC-27 tumorsphere celler

For at teste for en mulig rolle SHH vej i selvfornyende kapacitet tumorsphere celler, vi brugte cyclopamin eller kontrol tomatidine, 5E1 eller kontrol PBS for at blokere vejen.

resultaterne viste, at cyclopaminbehandling førte til en signifikant reduktion i kapacitet til dannelse af sub-tumorspheres i HGC-27 tumorsphere celler på en dosisafhængig måde, men ingen sådan virkning blev observeret i adhærente celler (fig. 5A). Vi yderligere vurderet, om behandling med cyclopamin ville påvirke kolonier dannelse kapacitet HGC-27 tumorsphere celler ved forankring -uafhængig vækst assay. Tilsvarende blev evnen til at danne kolonier mere i tumorsphere celler reduceret på en dosis-afhængig måde i forhold til de adhærente celler (Fig. 5B).

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​SHH pathway på kemoresistens af HGC -27 tumorsphere celler behandlede vi de dissocierede celler med cyclopamin eller kontrol tomatidine i 48 timer, og derefter lægemiddelresistens af tumorsphere celler blev evalueret. Når cyclopamin blev efterfulgt af lægemidler, behandling resulterede i en væsentlig forbedret samlet celledød sats. De bedste resultater blev opnået, når cyclopamin blev kombineret med Oxaliplatin plus Mitomycin (fig. 5C). Ingen sådan synergistisk virkning blev observeret i adhærente celler efter eksponering for lægemidler med cyclopamin i 48 timer (Fig. 5D).

Vi analyseret også virkningen af ​​forskellige koncentrationer af cyclopamin (2,5 pM, 5 pM, 10 uM) på celledød. Resultaterne viste, at cyclopamin alene at tumorsphere celler kunne gøre en lille, men konsekvent fald i antallet af levedygtige celler. Sammenlignet med HGC-27 tumorsphere celler, virkningen af ​​cyclopamin på celledød til adhærente celler var mere signifikans (fig. 5C, D).

Når SHH pathway blev blokeret af 5E1 eller kontrol PBS, resultaterne af self -renewing kapacitet og kemoresistens af tumorsphere celler og adhærente celler svarede til dem blokeret af cyclopamin eller kontrol tomatidine (fig. S2).

5. SHH pathway blokerer forbedret tumor respons på lægemidler in vivo

For at teste denne hypotese in vivo, vi analyseret, om SHH pathway blokerer forbedret kemoterapi effektivitet, cyclopamin eller kontrol tomatidine blev brugt til at hæmme SHH pathway svar. HGC-27 tumorsphere Cellerne fik lov at vokse til begge baghjul flanker af nøgne mus, indtil den større diameter af tumor nåede ca. 2 mm. Mus blev derefter behandlet to gange om ugen i 3 uger med cyclopamin eller kontrol tomatidine 24 timer før oxaliplatin levering. I alle behandlede mus, tumorer behandlet med Oxaliplatin var signifikant mindre end de ikke behandlet med oxaliplatin. Desuden viste tumorer signifikant større tumorvækstinhibering når de blev behandlet med Oxaliplatin i kombination med cyclopamin, blev tumoren reaktion på kemoterapeutisk lægemiddel forøget ved cyclopamin (fig. 6A, B). Vi undersøgte også, om SHH pathway blokeret af 5E1 eller kontrol PBS forbedret kemoterapi effektivitet in vivo, viste resultaterne, at 10 ug /ml 5E1 behandling førte til en signifikant større tumorvækstinhibering end dem kun behandlet med Oxaliplatin (fig. 6A, B).

Disse data tydede på, at selv om standard kemoterapeutiske lægemidler forsinket tumor udvækst under behandlingen, da de blev kombineret med cyclopamin eller 5E1, blev effekten af ​​kemoterapi væsentligt forbedret, og også mere vedvarende efter afbrydelse af behandlingen.

Dernæst at undersøge, om blokering af SHH vej in vivo havde en specifik virkning på HGC-27 tumorsphere celler. Mus blev kun behandlet cyclopamin på det rigtige bageste flanke eller kontrol tomatidine ved venstre bageste flanke (to gange om ugen i 3 uger), når tumorer fra HGC-27 tumorsphere celler nåede ca. 2 mm, efter 3 uger, udførte vi en begrænsende fortynding assay for sfæroider formation under anvendelse tumorceller behandlet med cyclopamin og behandlet med tomatidine hhv. Som vist i tabel S2, kunne ca. 9-15% af celler fra xenotransplanted tumor behandlet med tomatidine producere sfæroider, mens mindre end 2,5% af celler fra xenotransplanted tumor behandlet med cyclopamin kunne generere sfæroider. Derfor blokerer SHH pathway in vivo kan reducere antallet af gastrisk CSLCs.

6. SHH vej fastholdt mavens CSLCs karakteristika tumorsphere celler fra primær tumor prøver

For at afgøre, om SHH vej kunne være involveret i mavens CSCS karakteristika tumorsphere celler fra mavekræft væv, vi udnyttet primære mavekræft prøver at analysere funktionelle aspekter af SHH pathway i gastriske CSLCs.

først voksede vi frisk dissocierede bulk-celler fra mavekræft prøver i serum-frit medium beskrevet i afsnittet metoder, efter 10 dage, blev der observeret tumorspheres (fig. 7A, B). Derefter undersøgte vi kemoresistens og tumorigen kapacitet i tumorsphere celler fra mavekræft væv. Resultaterne viste, at tumorsphere celler fra mavekræft væv viste signifikant større resistens over for lægemidler end bulk-celler under de samme betingelser (Fig. 7C). Endvidere frisk dissocierede bulk-celler fra mavekræft prøver injiceret ved 2 × 10 ^{7 celler per mus var i stand til oprettelse subkutane tumorer, mens så lidt som 2 × 10 4 af de tumorsphere celler fra mavekræft prøver kunne danne tumorer (tabel 1), xenotransplantaterne tumorer, der førte fra injektion af tumorsphere celler præsenterede de samme histopatologi funktioner som deres respektive menneskelige tumor (fig. 7F). Disse resultater viste, at tumorsphere celler fra gastrisk cancer væv besad karakteristika CSLCs. Dernæst observerede vi effekten af ​​SHH pathway blokering på kemoresistens af tumorsphere celler in vitro og tumor respons på lægemidler in vivo. Resultaterne viste, at cyclopamin eller kunne 5E1 resulterede i en signifikant forbedret samlet celledød sats (fig. 7D) og tumor respons på lægemiddel (fig. 7E).}

Discussion

CSCS deler mange egenskaber med væv stamceller, såsom selvfornyelse, spredning, kemoresistens og er hovedansvaret for at opretholde væksten af ​​tumorer [27], [28]. Mange forskere har anvendt fluorescensaktiveret cellesortering at identificere og isolere CSCS og fastslået, at disse celler kan danne sfærer i specialiserede serum-frit medium. I denne undersøgelse tog vi den modsatte vej ved at udvikle tumorsphere celler og derefter bestemmes, om disse celler erhvervet CSCS egenskaber.

Vi anvendte en defineret serumfrit medium bestående af EGF, FGF-2, B-27 supplement og N-2 supplement til at opretholde gastriske cancercellelinier. Disse betingelser var blevet brugt før til at opretholde endogene neurale stam- /progenitorceller og tumor stamceller fra humane tumorer og tumorcellelinier. For eksempel Kondo et al. [24] karakteriserede C6 rotte tumorcellelinie in vitro og in vivo og observeret en lille population af stamceller-lignende celler afledt fra velkarakteriserede side population. Setoguchi et al. [29] viste kræft stilk-lignende potentiale celle i andre cancer cellelinjer, herunder MCF7 brystcancer linje, B104 neuroblastom, og HeLa adenocarcinom.

På vores eksperiment, vi brugte tre gastrisk cancer cellelinjer (HGC- 27, MKN-45 og MGC-803) til kultur tumorspheres. HGC-27-cellelinje blev etableret af kulturen i metastatisk lymfeknude fra en mavekræft patient diagnosticeret histologiske som udifferentierede karcinom. MKN-45 blev etableret fra dårligt differentieret adenocarcinom i maven af ​​en 62-årig kvinde. MGC-803 er en epitelial dårligt differentieret human gastrisk mucokutant-adenocarcinom cellelinje fra en 74-årig mand.

To forskellige tilgange er typisk blevet brugt til at identificere CSCS i offentliggjorte undersøgelser [30], [31] . Den ene er en in vitro-metode kaldes "kugleformet kolonidannelse", og en anden er in vivo metode involverer implantation af kandidat CSCS under huden på immundefekte mus.

Den tidligere metode indebærer dyrkning kandidat CSCS i petriskåle specielt belagt for noncell fastgørelse med serumfrie medier indeholdende epidermal vækstfaktor og basisk fibroblastvækstfaktor. Væksten i sfæriske kolonier efter et par uger er betragtes som vejledende for selvfornyelse evne, og ville være i overensstemmelse med en CSC fænotype. Sidstnævnte metode-vækst af celler i immunsvækkede mus-er nødvendig for at demonstrere ægte tumorigenicitet og er generelt betragtes som den gyldne standard for at bevise eksistensen af ​​CSCS. En række undersøgelser har antydet, at disse to tilgange giver normalt lignende resultater i evalueringen kandidat CSCS for mange solide tumorer.

På nuværende gastrisk CSCS har ikke specifikke overflade beslutningstagere, så udviklede vi tumorsphere celler og derefter afgøres, om disse celler erhvervede CSCS egenskaber, herunder selvfornyende kapacitet, kemoresistens og tumorigen kapacitet.

Vores data viste, at gastrisk cancer cellelinier (HGC-27, MGC-803, MKN-45) dyrkes i en defineret serum- frit medium kunne danne tumorspheres der indeholdt celler opfører sig som CSLCs. In vitro tumorsphere celler viste en øget evne til at danne kolonier i blød agar under forankringsuafhængige forhold og en øget evne til at danne sub-tumorspheres. Vi viste også, at selvfornyelse evne til at danne sub-tumorspheres af HGC-27 tumorsphere celler havde en stigning på passager 2 til 8 (fra 44,5% til 70,5%), og så er det fastholdt en relativ stabil andel efter 8 eller mere Passage ved dyrket ved klonal densitet (fig. S3). Disse data antydede, at det proliferative potentiale tumorsphere celler blev opretholdt efter længere passager. Desuden tumorsphere celler in vitro var mere modstandsdygtige over for oxaliplatin og Mitomycin sammenlignet med vedhængende celler, foreslog disse data, at tumorsphere celler består af berigede antal CSLCs, der potentielt gjorde dem mindre modtagelige for handlinger både Oxaliplatin og Mitomycin. In vivo, kunne tumorsphere celler generere tumorer upon xenotransplantation på et højere tempo end klæbende celler. Desuden genereres tumorsphere celler subkutane tumorer med større volumen og kortere tid sammenlignet med dem der genereres fra adhærente celler, Vigtigere, tumorspheres kunne re-afledt af de xenotransplanted tumorer, og de kunne danne tumor igen, foreslog disse data, at tumorspheres blev beriget i CSLCs .

i vores undersøgelse, adhærente celler formentlig indeholdt en relativt lav procentdel af CSCS, som blev anvendt nogen fremgangsmåde til isolering eller fjernelse af disse celler. Det kan hævdes, at det er denne lille population af CSCS der er ansvarlig for tumordannelse. Uanset, flere CSCS var tydelig i tumorsphere celler, hvilket kan forklare dets mere aggressiv adfærd.

Dernæst undersøgte vi, hvorvidt forholdene på CSLCs i tumorspheres blev opretholdt ved unormal aktivering af SHH-vejen. Først demonstrerede vi, at mRNA ekspressionsniveauer af SHH pathway-relaterede molekyler (Shh, ptch og Gli1) var signifikant højere i tumorsphere celler end i adhærente celler, mens Gli2 var høj udtrykt i begge celler. Gennemgået yderligere ekspressionsniveauerne af SHH pathway målgener (ptch og Gli1) ved Western blot og kvantitativ real-time PCR, var resultaterne de samme som RT-PCR. For det andet, hæmning af SHH pathway aktivitet ved cyclopamin eller 5E1 medførte nedsat selvfornyelse kapacitet og øget følsomhed over for narkotika i HGC-27 tumorsphere celler, men disse effekter blev ikke udtalt i klæbende celler. In vivo, i alle behandlede mus, tumorer behandlet med Oxaliplatin var signifikant mindre end de ikke behandlet med Oxaliplatin, efter behandling med cyclopamin eller 5E1, blev tumoren reaktion på kemoterapeutiske lægemidler forbedres. Disse data tydede på, at selv om standard kemoterapeutiske lægemidler forsinket tumor udvækst under behandlingen, da de blev kombineret med cyclopamin blev effekten af ​​kemoterapi væsentligt forbedret, og også mere vedvarende efter afbrydelse af behandlingen.

Endelig har vi udnyttet primær mavekræft prøver at analysere de funktionelle aspekter af SHH pathway i gastriske CSLCs. Resultaterne viste, at tumorsphere celler fra mavekræft eksemplar havde også kemoresistens og tumorigen kapacitet øvrigt SHH pathway blokering reducerede kemoresistens af tumorsphere celler og øget tumor respons på lægemidler in vivo.

Som for kemoresistens, flere funktioner i CSCS kan gøre dem svære at fjerne. CSCS er relativt inaktiv og dette giver dem mulighed for at flygte fra kemoterapeutiske regimer, der typisk er målrettet aktivt cykler celler. Som vist for deres normale modstykke, er blevet foreslået CSCS at udvise højniveauekspression af multilægemiddeltransportøren familie gener, sandsynligvis resulterer i mere effektiv udstrømning af kemoterapeutiske lægemidler og medfødte multilægemiddelresistens desuden signalveje, såsom Wnt, pindsvin eller Notch er dysreguleret i CSCS fører til tumorudvikling. Udviklingen af ​​en effektiv terapeutisk tilgang ville derfor kræve identifikation af karakteristiske molekylære veje er aktive i CSCS og identificering af midler, der kan enten blokere CSC proliferation eller fremkalde CSC differentiering og dermed øge følsomhed over for kemoterapeutiske stoffer. Så vigtige faktorer, der påvirker kemoresistens af CSCS er iboende faktorer. Den mikromiljø, eller niche, kan påvirke evnen til CSCS at formere sig, migrere eller invadere. Den niche er en forankring site for CSCS og adhæsionsmolekyler eller microenvironmental opløselige molekyler, herunder vækstfaktorer og cytokiner, kan bidrager betydeligt til at ildfasthed til terapi. Selvom hæmning af SHH vej ved cyclopamin eller 5E1 ville være en nyttig strategi, i vores undersøgelse, vi viste, at receptor-komponent ptch og transskription faktor Gli1 også høj blev udtrykt i tumorsphere celler. Så ptch eller Gli1 kan være et alternativ mål for behandling af mavekræft. En mulig strategi er at bruge små interfererende RNA (siRNA) eller shRNA specifikt for ptch eller Gli1, men gastrisk CSLCs i tumorsphere celler har ikke været helt renset, er vi nødt til yderligere at rense mavens CSLCs, så dette arbejde vil ske i vores videre undersøgelse.

som konklusion, viste vi, at SHH vej kunne være involveret i selvfornyelse, spredning, lægemiddelresistens og tumorigen af ​​tumorsphere celler og foreslå, at strategier, der tager sigte på at hæmme SHH veje repræsenterer et rationale terapeutisk tilgang til at målrette gastrisk CSCS.

Materialer og metoder

Dyreetiske Statement

Mand atymiske nøgne mus (nu /nu), 6 til 8 uger gamle, blev opnået fra Beijing Vital-floden Lab Animal Technology Co Ltd (SCXK JING 2007-0001) og blev opstaldet under patogenfrie forhold i barrieren dyr facilitet. Alle mus blev udført under godkendte retningslinjer for Laboratory Animal Center of Academy of Military Medical Sciences (SYXK juni 2002 til 001).

Kultur af vedhæftende celler, tumorspheres og sub-tumorspheres

Menneskelig mavekræft cellelinier (HGC-27, MGC-803 og MKN-45) opnået ved Peking Union Medical College blev dyrket i 1640 medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og udpladet med en densitet på 1 x 10 ^{6 levende celler pr 75 cm 2 kolbe. Når cellerne fæstnet, vi passeret dem ved konfluens. Tumorspheres blev afledt ved at placere adhærente celler i serumfrit 1640 dyrkningsmedium indeholdende 1% N-2 Supplement (Invitrogen), 2% B-27 supplement (Invitrogen), 1% antibiotisk blanding (Gibco), 20 ng /ml humant FGF -2 (Chemicon), og 100 ng /ml EGF (Chemicon), og de adhærerende celler blev udpladet i 24 brønde med ultralav fastgørelsesplade (Corning) ved 500 celler per brønd. 2 uger senere blev pladerne analyseret for tumorspheres dannelse og blev kvantificeret under anvendelse af et omvendt mikroskop (Olympus) ved 40 × og 100 × forstørrelse.}

Efter primære tumorspheres nåede størrelse på cirka 200-500 celler pr kugle, den tumorspheres blev dissocieret med en densitet på 1.000 celler per milliliter og 100 pi enkelt cellesuspension blev podet i hver brønd af 24-brønds ultralave fastgørelsesplade (Corning) i serum-frit medium beskrevet ovenfor. Hver brønd blev undersøgt for enkelt celle, og kun de brønde, der indeholdt enkelt celle blev markeret. 2 uger senere blev brøndene analyseret for sub-tumorspheres formation. Normale adhærente celler blev anvendt som kontrol for evnen til at danne undergrupper tumorspheres. For at teste forbindelsen mellem SHH pathway og dannelsen af ​​sub-tumorspheres behandlede vi de dissocierede celler med cyclopamin (2,5 pM, 5 pM, 10 pM) eller kontrol tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) eller kontrol PBS og iagttaget formationen af sub-tumorspheres.

mavekræft vævsprøve

de menneskelige friske, sterile gastrisk cancer vævsprøver blev opnået i overensstemmelse med de etiske standarder i institutionelle udvalg om menneskelige eksperimenter fra 15 patienter (alder interval 70-85 år) gennemgår en gastrisk kræft resektion, efter at have indhentet informeret samtykke fra patienterne (tabel S3).

Så prøverne blev nedsænket i 95% ethanol i 2-3 sek for at undgå forurening, og vaskes med phosphatbufret saltvand (PBS) og antibiotika adskillige gange for at fjerne blodet. Efter disse, blev overfladen af ​​cancer vævsprøver fjernet og de indre dele blev skåret i 1-3 mm ^{3-store stykker. Derefter blev de fordøjet i collagenase og dispase opløsning ved 37 ° C, efter 4 timers inkubation blev opløsningen indeholdende de fordøjede væv centrifugeres for at fjerne collagenaseopløsningen. Cellepelleten blev vasket en gang med 1640 medium før bliver suspenderet i serumfrit 1640 medium indeholdende 1% N-2 supplement, 2% B-27 supplement, 1% antibiotisk blanding, 20 ng /ml humant FGF-2, 100 ng /ml EGF og udpladet i 24-brønds fastgørelsesplade ultralav. Alle kulturer blev inkuberet ved 37 ° C i inkubatorer følger med befugtet luft og 5% CO _2.}

forankringsuafhængig vækst assay

I observere selvfornyende kapacitet yderligere, blød agar-assay blev anvendt til bestemmelse af kolonier dannelsen af ​​tumorsphere celler og adhærente celler under forankringsuafhængige betingelser. Hver brønd i en plade med seks brønde blev overtrukket med 1 ml 10% FBS 1640 medium med 1% agarose. Efter 20 minutters inkubation ved 37 ° C blev lige antal (500) af tumorsphere celler eller adhærente celler tilsat i 1 ml 10% FBS 1640-medium med 0,5% agarose. For at teste forbindelsen mellem SHH pathway og kolonier formation under forankringsuafhængige betingelser, behandlede vi de dissocierede celler med cyclopamin (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) eller kontrol tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) eller kontrol PBS.

• PLoS ONE: Wnt /β-Catenin Signaling Forbedrer cyclooxygenase-2 (COX2) transkriptionsaktivitet i Gastric Cancer Cells
• PLoS ONE: En Computational Metode til Forudsigelse af ekskretionsorganerne Proteiner og Ansøgning til Identifikation af gastrisk kræft markører i urin