Abstrakt
mavekræft er en af de mest almindelige årsager til kræft dødelighed på verdensplan. Ekspression af tumor suppressor, promyelocytleukæmi (PML) protein, nedsættes eller afskaffes i gastriske carcinomer i samarbejde med et forhøjet niveau af lymfatisk invasion, udvikling af højere pTNM iscenesættelse, og ugunstige prognose. Heri undersøgte vi forholdet mellem omfanget af tumor-infiltrerende lymfocytter og status for PML proteinekspression i fremskreden gastrisk carcinoma. Vi observerede højere antal infiltrerende T-celler i gastriske carcinoma væv, hvori PML ekspression blev reduceret eller afskaffet, sammenlignet med væv positive for PML. Omfanget af T-celle-migrering til kultursupernatanter opnået fra interferon-gamma (IFN-γ-stimulerede gastrisk karcinom cellelinjer blev yderligere påvirket af ekspression af PML in vitro Henvisning: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Tab af promyelocytleukæmi Protein i Gastric Cancer: Konsekvenser for IP-10 Expression og tumorinfiltrerende lymfocytter. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264 Redaktør: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), USA Modtaget: April 21, 2011; Accepteret: September 23, 2011; Udgivet: 12 oktober 2011 Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Research Program Basic Science gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2010 til 0.015.506) til Y-HC, af National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Korea regering (MEST) (2010 til 0.029.353) til JLK og ved RO1 NS50665 til ENB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion mavekræft er en af de hyppigste årsager til cancerrelaterede dødsfald på verdensplan. Nylige fremskridt i genetik har lettet detektion af hændelser, der opstår under forløbet af gastrisk carcinogenese, herunder aktivering af onkogener, silencing af tumorsuppressorgener, og mutation af gener involveret i DNA-reparation [1]. Blandt disse genetiske begivenheder, er det kendt, at tumor suppressor promyelocytisk leukæmi (PML) proteinekspression nedsættes eller afskaffes i gastrisk cancer, og at dette er forbundet med mere omfattende lymfatisk invasion, højere pTNM mellemstationer, og ugunstig prognose, hvilket antyder, at PML tab er knyttet til carcinogenese og gastrisk karcinom progression [2]. Tidligere undersøgelser impliceret Pml Pml Progressiv mutation af og genetiske ændringer i flere tumorsuppressorgener fremme tumorudvikling og progression [18]. Foruden genetiske ændringer inden tumorceller, både inflammatoriske celler og mediatorer bidrager til dannelsen af bestemte tumor mikromiljøer [19], [20]. Tumorassocierede fibroblaster (TAF'er) og makrofager (TAM'er) er også involveret i modulering af tumormikromiljøet via TAM'er findes at korrelere med angiogenese og en ugunstig prognose i flere typer af kræft, herunder gastrisk kræft [22], [28]. Mastcelle producerer mange angiogene faktorer og en række cytokiner, og dens densitet er blevet rapporteret til stærkt korrelerer med omfanget af tumoren neoangiogenese og dårlig prognose [29], [30]. CD4 + og CD8 + -lymfocytter findes også i en række solide cancervæv. Indtil nu er de præcise molekylære mekanismer, som typen og antallet af tumorinfiltrerende celler er reguleret er stort set ukendte. Der er flere kontroversielle rapporter med hensyn til antallet og funktionen af tumor-infiltrerende lymfocytter. Især CD8 + T-lymfocytter, mens deres funktion er kendt for at eliminere vordende transformerede celler og bidrage til immunosurveillance [31], er det rapporteret, at CD8 + tumorinfiltrerende T-celler er defekte i effektorfasen funktion ved kontakt med tumorceller [32], og deres infiltration er forbundet med ugunstig prognose i visse typer af cancer, såsom ikke-småcellet lungekræft og nasopharyngeal carcinom [33], [34]. Salg Kemokiner udskilt af stromale celler eller tumor celler indflydelse tumorcellemigration, invasion, proliferation, angiogenese og immun celleinfiltration i tumormassen [35]. IFN-γ-inducerbart protein-10 (IP-10, CXCL10) er en af de CXC chemokiner som spiller flere roller i inflammatoriske sygdomme og cancer [36], [37]. Da IP-10 præferentielt fremmer Th1 immunresponser ved robust tiltrækker NK og T-celler, foreslås det som en af mulige mekanismer for T-celle-infiltration til tumorer. Uanset om tab af tumorsuppressorgener i tumorceller inducerer rekruttering af lymfocytter og modulering af funktionerne af sådanne celler i tumor mikromiljøer er endnu uklart. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi PML funktion med hensyn til rekruttering af lymfocytter og modulering af ekspressionen af tumorafledte faktorer. Ekspression af PML blev omvendt korreleret med omfanget af infiltration af CD8 + T-celler i gastriske carcinomer. PML tab blev yderligere forbundet med forøget ekspression af IP-10, en af de lymfocyt-tiltrækkende CXC chemokiner, i gastriske carcinomceller og væv. PML knockdown fremmes IFN-γ-medieret STAT-1-binding til IP-10-promotoren, resulterer i forøget transkription af undersøgelsesperioden-10-genet. Vore data understøtter den opfattelse, at PML er involveret i rekrutteringen af lymfocytter til tumorer, via Resultater Tab af PML protein er forbundet med øget infiltration af CD8 + T-celler i fremskreden gastrisk karcinom væv Immunohistokemisk farvning for PML og CD8 blev udført for at undersøge, om omfanget af lymfocytinfiltrering var forbundet med PML ekspression status i fremskreden gastrisk cancer. CD8-immunpositive celler blev optalt som beskrevet i Materialer og Metoder. I alt 35 prøver (71,4%) viste delvis-til-fuldstændigt tab af PML i tumor cellekerner i fase IV avancerede gastriske carcinomer. Prøver fra 14 avancerede gastriske carcinoma patienter var diffust positive for PML, og indeholdt et gennemsnit på 32,7 CD8 + T-celler pr felt (figur 1A). Vi identificerede 19 tilfælde af fremskreden gastrisk karcinom udviser omdrejningspunkt positivitet for PML, med et gennemsnit på 47,2 CD8 + T-celler pr felt. Desuden blev fuldstændig tab af PML observeret i 16 avancerede gastrisk karcinom patienter; prøverne indeholdt et gennemsnitligt antal 52,8 CD8 + T-celler pr. Prøver viser omdrejningspunkt positivitet eller fuldstændig tab for PML viste en mere markant stigning i CD8 + T-celletal end prøver gjorde udstille diffus positivitet for PML. Repræsentative billeder er vist i figur 1B. Selvom PML-protein-ekspression blev reduceret eller afskaffet i tumorceller, alle normale gastriske mucosale kirtler, stromale væv og lymfoide celler, udviste diffus moderat til stærk nuklear immunopositivitet for PML. i betragtning af tabet af PML protein-ekspression og stigningen i infiltration af CD8 + T-lymfocytter i avancerede gastrisk karcinom væv, vi hypotese, at PML bidrog til T-celleinfiltration /migration i gastrisk cancer. At undersøge, om PML niveau i gastriske cancerceller påvirket T-celle-migration, konditionerede medier fra SNU-638 celler transient transficeret med enten Pml kemokiner, en familie af kemotaktiske cytokiner, fremme migrering af cirkulerende leukocytter /lymfocytter til steder med inflammation og skade. At undersøge, om kemokinniveauer påvirket af Pml Dernæst undersøgte vi sammenhængen mellem IP-10 og PML proteinekspression i avanceret gastrisk karcinom væv. Cancervæv blev immunhistokemisk farvet for PML og IP-10, og intensiteten af IP-10 immunopositivitet blev målt som beskrevet i Materialer og Metoder. Den gennemsnitlige intensitet IP-10 var 1,2 i 14 prøver, der viser diffuse positivitet (DP) for PML, 2,2 i 19 tilfælde af fokal positivitet (FP), og 2,0 i 16 prøver, hvor der var fuldstændig tab (CL) af PML udtryk ( Figur 4A, venstre panel). Betydelige stigninger i IP-10-ekspression blev observeret i prøver viser omdrejningspunkt positivitet for PML ( P Som SNU-638- PML PML knockdown forbedrer IP-10 promotoraktivering Som IP-10-ekspression blev øget i PML knockdown celler, vi nærmere om PML proteinekspression påvirkede IP-10-promotor-aktivitet. Det murine IP-10-promotoren indeholder et formodet GAS element ligger mellem nts -246 og -238 (TTN 5AA) (figur 6A). Vi har tidligere rapporteret, at PML negativt regulerer den transskriptionelle aktivitet af STAT-1 [17]. For at undersøge, om PML påvirkede IFN-γ-induceret IP-10 genekspression via effekten af PML på IFN-γ-induceret STAT-1 DNA-binding til IP-10-promotor blev undersøgt yderligere. PML-protein-overekspression i NIH3T3-celler, efter transient transfektion med PML IV ekspressionsvektoren, delvist blokeret IFN-γ-induceret STAT-1-DNA-binding til IP-10-promotoren, herunder en sekvens på -246 til -238 (figur 7A, sammenlign bane 3 og 5). Konkurrence anvendelse af en 100-molært overskud af umærket oligonukleotid, der koder IP-10-promotoren ophævet kompleksdannelse (bane 6). Niveauerne af PML og STAT-1 protein-ekspression i helcellelysater (WCL) og omfanget af STAT-1-tyrosinphosphorylering i kerneekstrakter (NE) blev verificeret ved immunoblotting. Ved hjælp NE fra NIH3T3- Pml Histopatologiske undersøgelser har vist, at den inflammatoriske mikromiljø af tumorer er kendetegnet ved tilstedeværelsen af mononukleære celleinfiltrater, både i de understøttende stroma og tumor regioner. Men de præcise mekanismer, hvormed mononukleære celler infiltrere og vedvarende indenfor kræft væv er i øjeblikket ikke fuldt forstået. I den foreliggende undersøgelse, tilbyder vi bevis for, at tab af ekspression af tumor-suppressor protein, PML, bidrager til en forbedring af lymfocytinfiltrering i gastrisk cancer væv, via Vi undersøgte funktionen af PML med hensyn til lymfocyt rekruttering ved hjælp af humane gastrisk cancer vævsprøver, Pml IP-10, en lymfocyt-targeting CXC-kemokin induceret af type i og II IFN'er, spiller en vigtig rolle i lymfocyt rekruttering under flere inflammatoriske tilstande [41]. IP-10 udskilles af tumor-infiltrerende immunceller, og også af tumorale og parenchymceller i en interferon og cytokin-beriget mikromiljø. TAF'er fra lungekræftpatienter konstitutivt producere og udskille IP-10 [27]. Hepatocytter inficeret med hepatitis C-virus producere IP-10, og inducerer migrering af aktiverede T-celler til leveren parenkym, hvilket indikerer, at IP-10 niveauer er korreleret med histologisk alvorlighed og inflammation [42]. I vores system, blev IP-10-sekretion observeres i gastrisk cancer SNU-638-celler, NIH3T3 fibroblaster og MEF'er, som reaktion på IFN-γ, og sekretion blev forbedret i fravær af PML-proteinekspression. Da vi fandt, at der ikke var nogen væsentlige forskelle i niveauet af STAT-1-ekspression og phosphorylering i fravær eller tilstedeværelse af PML på IFN-γ (figur 3 og 7), øget IFN-γ-induceret IP-10 transskription i fravær af PML skyldes hovedsageligt forbedret STAT-1 DNA binding til IP-10-promotor. Vi foreslår, at PML-medieret inhibering af STAT-1 DNA-bindende fører til undertrykkelse af STAT-1-afhængige IP-10 ekspression, i overensstemmelse med vores tidligere fund [17]. I den foreliggende undersøgelse, vi identificerer en potentiel regulatorisk region for PML i undersøgelsesperioden-10-promotoren, som er en formodet STAT-1-bindingssted. Yderligere viser vi, at PML Knockdown øger IFN-γ-induceret STAT-1-DNA-binding til IP-10-promotor, og forbedrer IP-10 niveauer i fravær af PML. Lymfocytter, neutrofiler, makrofager, og mastceller er de vigtigste komponenter i de fleste tumor infiltrater. Tumorinfiltrerende lymfocytter er blevet identificeret i en række solide cancervæv. De specifikke funktioner af sådanne celler i tumorer, og den nøjagtige molekylære mekanismer i lymfocyt rekruttering i tumorer, forbliver kontroversiel. Status og funktionelle relevans af CD8 + T-celle infiltration i tumorer, og sammenslutningen af sådanne celler med patient prognose, er også uklart. I renalcellecarcinom, er infiltration af CD8 + T-celler er forbundet med gunstige prognose [43]. Omvendt er sådan infiltration knyttet til ugunstig prognose i nonsmall patienter celle lungecancer [33]. Vi her viser, at PML proteinekspression i tumorceller er omvendt korreleret med omfanget af infiltration af CD8 + T-celler i tumorvæv. Når funktionen for PML i lymfe invasion anses sammen med associationen mellem PML udtryk og ugunstige prognose [2], er det klart, at nogen sammenhæng mellem kliniske funktioner og omfanget af CD8 + T-celle infiltration i mavecancerpatienter kræver yderligere udredning. Kerner af normale maveslimhinden kirtler, stromale væv og lymfoide celler diffust immunpositive (moderat til stærk) for PML proteinekspression, mens PML-niveauer blev reduceret eller afskaffet i tumorceller (figur 1). Disse resultater støtter tanken om, at kræftceller har specifikke nedbrydningsprodukter mekanismer for PML. Vi foreslår, at post-translationel proteasom-afhængige nedbrydning forklarer tabet af PML protein. Med andre ord, nedbrydning på det transskriptionelle niveau ikke er operativ [2], [44]. PML-proteinekspression reduceres eller afskaffes i mange forskellige cancere, herunder prostata, bryst, CNS, tyktarms-, lunge-, og gastrisk cancer [2], [3]. I overensstemmelse med disse resultater, observerede vi reduceret eller ubetydelig udtryk for PML i avancerede gastric cancer væv. Desuden vores resultater tyder på, at kræftceller, der udtrykker forskellige niveauer af PML protein varierer i deres evne til at tiltrække og fastholde lymfocytter i tumor områder, hvilket giver yderligere beviser for, at sådanne celler deltage aktivt i etableringen af inflammatoriske tumor mikromiljøer, via NF-KB og STAT-3 signalering foreslås at tjene som store reguleringssystemer forbinder betændelse til kræft [45]. IL-6, en NF-KB-afhængige inflammatoriske vækstfaktor, er afgørende for udvikling af inflammation-associerede carcinogenese [46]. Seneste indicier har yderligere styrket den idé, at IL-6 /gp130 /STAT-3 signalering akse fungerer både en autokrin og parakrin forstærkning loop i lunge adenocarcinom, myelomatose, Ras-transformerede cancerceller, og en colitis-associeret cancer model [47], [48], [49], [50]. PML er blevet vist at undertrykke IL-6-induceret STAT-3-aktivitet [51], for at fremme apoptose via Materialer og metoder Celler Primær og udødeliggjort Pml i alt 49 gastrisk karcinom paraffinblokke blev indhentet fra 49 patienter (29 mænd, 20 kvinder, median alder 64 år, interval 35-84), som havde gennemgået total eller subtotal gastrektomi for trin IV avancerede gastriske karcinomer ved Mokdong Hospital, Ewha Womans University School of Medicine, Seoul, Korea fra 2001 til 2007. Reagenser og antistoffer Rekombinant murine og humane IFN-γ (mlFNp-γ og hIFN γ) og MIP-10 og hip-10 blev købt fra ProSpec (Rehovot, Israel). Antistoffer mod PML (monoklonalt muse) og STAT-1 blev erhvervet fra Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) og neutraliserende antistof mod IP-10 blev indkøbt fra R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antistof mod p-Y701-STAT-1 blev erhvervet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mod histon, blev Lamin B og PML (kanin polyklonale) indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), og anti-tubulin-antistof blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) . Immunhistokemi blev celletælling og måling af immunoreaktive områder Humane mavekræft væv behandlet til immunhistokemisk analyse som tidligere beskrevet [2] med mindre modifikationer. Primære antistoffer til PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (01:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), og IP-10 (01:50; R &D Systems) blev udnyttet. Alle objektglas blev modfarvet med Mayers hematoxylin. Positive kontroller blev opnået ved hjælp af ganetonsiller for PML protein og CD8, og nasopharyngeale udifferentierede karcinomer til IP-10. Negative kontroller blev tilvejebragt ved at udelade primære antistoffer fra alle objektglas. Immunopositivitet for PML-protein blev kategoriseret som diffus positivitet (nuklear immunoreaktivitet i ≥50% af tumorcellerne), fokal positivitet (i ≥10%, men < 50%), eller fuldstændigt tab (i < 10% af tumorcellerne). Antallet af CD8 immunpositive celler i en høj effekt felt (HPF, x40) på 0,25 mm 2 til fem tilfældigt udvalgte tumor infiltrative grænser blev talt for hver prøve, efterfulgt af beregning af det gennemsnitlige antal og SD. Immunopositivitet til IP-10 blev defineret som alle nukleare eller cytoplasmatisk positivt udtryk i tumorceller. Til bestemmelse af det udtrykte niveau af hvert objektglas, blev digitale billeder opnås ved anvendelse af et mikroskop-monteret digitalkamera. Brug ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij), hvert billede blev konverteret til 8-bit skala, og der er tætheder grå blev målt fra pixels i området af interesse; kun pixels overstiger et vist niveau (> 50 intensitet værdi). blev inkluderet for at fjerne baggrunden fejl siRNA transfektion NIH3T3 celler blev forbigående transficeret hjælp Mirus transfektion reagens (Mirus Bio LLC, Madison,
. Interferon-gamma-inducerbare protein 10 (IP -10 /CXCL10) ekspression blev øget i gastriske carcinoma væv udviser reducerede PML-niveauer. Desuden har både Pml
knockout og knockdown celler udviste forbedret IP-10 mRNA og proteinekspression i nærvær af IFN-γ. PML knockdown øget IFN-γ-medieret Signal Transducer og Activator of transcription-1 (STAT-1) binding til IP-10-promotoren, resulterer i forhøjet transkription af undersøgelsesperioden-10-genet. Omvendt PML IV proteinekspression undertrykkes IP-10 promotoraktivering . Baseret på disse resultater, foreslår vi, at tabet af PML proteinekspression i gastriske cancerceller bidrager til øget IP-10 transkription via
forøgelse af STAT-1-aktivitet, hvilket på sin side fremmer lymfocyttrafik inden tumor-regioner .
dysfunktion i progressionen af en række forskellige cancertyper, og reduceret eller afskaffet ekspression af PML er blevet rapporteret i prostata, bryst, CNS, tyktarms-, lunge- og gastriske cancere [2], [3] .
genet blev oprindeligt identificeret ved fusion med retinoinsyrereceptor involveret i t (15; 17) kromosomal translokation forbundet med akut promyelocytisk leukæmi (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML er en tumor suppressor protein, der regulerer cellecyklusprogression, gentranskription, transformation undertrykkelse, og apoptose. Pml
knockout mus er betydeligt mere følsomme over for tumordannelse efter udsættelse for kræftfremkaldende stoffer end er vildtype-kontroller, og Pml
deficiente celler er mindre tilbøjelige til at undergå apoptose efter anvendelse af bestemte typer af cellulært stress [9]. Foruden, der fokuserer på tumorsuppressor rolle PML spiller, har flere undersøgelser bekræftet, at proteinet fungerer som en transskriptionel regulator, via
associering med co-aktivator CREB-bindende protein; co-repressorer herunder HDAC, N-RU, og mSin3A; og transskription faktorer Nur77, AP-1, myc, p53, og STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].
produktionen af cytokiner, kemokiner, interferoner og andre biologisk aktive faktorer [21], [22]. Cross-talk mellem tumorceller, TAF'er, TAM'er, og lymfocytter, er betydelig i tumor udvikling og progression, og bidrager til etablering af tumor mikromiljøer beriget i ekspression af en række biologisk aktive faktorer [23], [24], [25] , [26], [27].
modulation af ekspressionsniveauerne af tumorafledte faktorer, herunder IP-10, hvilket giver yderligere beviser på, at tabet af tumorsuppressorgener i tumor celler deltager aktivt i etableringen af tumor mikromiljøer.
PML påvirkninger T-celleinfiltration /migration in vitro
siRNA eller PML IV ekspressionsvektor, derefter behandlet med IFN-γ blev anvendt i Transwell migration assays. SNU-638 gastriske cancerceller udtrykte høje niveauer af PML protein, i overensstemmelse med tidligere resultater [2], mens SNU-638-celler transficeret med Pml
siRNA de viste reducerede niveauer af endogen PML udtryk (~46-56%) som bekræftet ved immunoblotting (figur 2A). IFN-γ inducerede en beskeden stigning i PML proteinekspression efter aftale med tidligere resultater [38]. Migration af Jurkat T-celler mod konditioneret medium fra PML
siRNA-transficerede SNU-638-celler blev signifikant forøget, sammenlignet med den af kontrol siRNA-transficerede celler, efter behandling med IFN-γ (figur 2B). Efter transfektion af SNU-638 med PML IV ekspressionsvektor, migration af Jurkat T-celler mod konditioneret medium fra PML IV overudtrykte celler var reduceret sammenlignet med den for tom vektor (figur 2C). Disse resultater antyder, at PML regulerer niveauerne af sekretoriske molekyler produceret af og frigivet fra IFN-γ-stimulerede gastriske cancerceller, og også påvirker migreringen af T-lymfocytter.
Tab af PML forøger IFN-γ-induceret IP-10-ekspression
genetiske status, blev chemokin genekspression undersøgt ved hjælp af beskyttelse ribonuclease assay (RPA). Pml
+ /+ og Pml
- /- mus embryonale fibroblast (MEF) celler blev inkuberet i fravær eller tilstedeværelse af IFN-γ for 0-24 timer , totalt mRNA blev opsamlet på forskellige tidspunkter, og underkastet RPA. I Pml
- /- MEF'er, IP-10 mRNA niveauer steg 1,5 gange ved 2 timer, og blev markant forhøjet (8 gange) med 4 timer (figur 3A). RANTES mRNA niveauer blev forøget 3,2-fold ved 0,5 time, og forblev forhøjede, men i mindre grad (1,3 gange), 8 timer efter IFN-γ behandling i PML Salg - /- MEF'er . Andre chemokin gener, herunder MIP-1, MIP-2, og MCP-1, blev ikke påviseligt udtrykt i Pml
+ /+ eller Pml
- /- MEF'er (data ikke vist). STAT-1-ekspression blev øget efter udsættelse for IFN-γ i begge celletyper, men ingen forskel var tydelig, når IFN-y-niveauer blev sammenlignet mellem Pml
+ /+ og Pml
- /- celler. Som transskription af IP-10-genet væsentligt blev forhøjet i IFN-γ-stimuleret Pml
- /- MEF'er, vi målte relevante protein niveauer i dyrkningssupernatanter af Pml
+ /+ og Pml
- /- MEF'er, under anvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA). I overensstemmelse med RPA resultater, højere niveauer af IP-10-protein var tydelige i konditioneret medium fra IFN-γ-behandlede Pml
- /- MEF'er (figur 3B). Også, IP-10 mRNA-ekspression i PML
siRNA-transficerede NIH3T3-celler blev forøget, sammenlignet med den af kontrol siRNA-transficerede celler, efter IFN-γ behandling (figur 3C). Reduktionen i ekspressionen af PML protein i PML
siRNA-transficerede NIH3T3 celler blev bekræftet ved immunoblotting.
Reduceret PML udtryk er omvendt korreleret med IP-10 protein niveauer i mavekræft væv og SNU- 638 celler
= 0,034) sammenlignet med dem, der viser diffus positive PML udtryk. En stigning i IP-10 ekspression blev observeret, når fuldstændig tab af PML var tydelig, sammenlignet med, hvad der blev bemærket, da PML var diffust udtryk; dog har denne forskel ikke statistisk signifikans. Repræsentative eksempler på variationer i PML protein status, korreleret med forskellige IP-10 ekspressionsniveauer i tumorceller fra avancerede gastriske carcinomer er vist (figur 4A, højre). For yderligere at undersøge forholdet mellem IP-10 og PML proteinekspression i gastrisk karcinom cellelinjer, IP-10 protein niveauer er målt i dyrkningssupernatanter fra SNU-638 celler forbigående transficeret med enten Pml
siRNA eller PML IV exression vektor. Celler blev dyrket i fravær eller nærvær af IFN-γ i 8 timer, supernatanterne opsamlet, og IP-10 niveauer kvantificeres deri (ved ELISA). IFN-γ-induceret IP-10-sekretion blev signifikant forøget i SNU-638- PML
siRNA-transficerede celler, sammenlignet med den for SNU-638-celler transficeret med kontrol siRNA (figur 4B). Transfektion af SNU-638 med PML IV ekspressionsvektor undertrykte IFN-γ-induceret IP-10-sekretion (figur 4C). Resultaterne viser klart, at sekretion af IP-10 fra gastriske cancerceller forøges, når PML ekspression reduceres.
IP-10 neutralisation formindsker vandringen af T-celler
siRNA-holdige celler, der udtrykker reducerede niveauer af PML-proteinet viste forøgelse af T-celle rekruttering og IP-10-sekretion i respons på IFN-γ (figur 2 og 4), vi næste undersøgt, om en stigning i IP 10 niveauer lettes T-celle migrering til konditioneret medium fra SNU-638 gastriske cancerceller stimuleret med IFN-γ. SNU-638- Pml
siRNA celler blev dyrket i fravær eller nærvær af IFN-γ i 8 timer, og de opsamlede supernatanter blev forbehandlet med et anti-IP-10-neutraliserende antistof eller kontrol-ikke-specifik IgG i 1 h før påbegyndelse af Transwell assay. Neutraliserende antistof eller IgG-holdige supernatanter blev anbragt i de nedre kamre, og migrationen af Jurkat-celler fra øvre til nedre kamre blev analyseret ved at undersøge celler høstet fra de nedre kamre. Inklusion af IP-10-neutraliserende antistoffer inhiberede Jurkat T-celle-migrering til konditioneret medium fra SNU-638- Pml
siRNA-celler (figur 5A). Disse resultater er i overensstemmelse med oplysningerne fra NIH3T3 celler; en IP-10-neutraliserende antistof inhiberede EL-4 T-celle migrering til konditioneret medium fra NIH3T3- Pml
siRNA-celler (figur 5B).
en mekanisme, der involverer STAT-1, isolerede vi og genererede en reporter konstruktion begynder ved position -330 af det murine IP-10-promotor, der indeholder formodede GAS element, som beskrevet i Materialer og Metoder. IP-10- luc
reporter indeholdende GAS element blev forbigående transficeret ind i NIH3T3-celler inkuberet med eller uden IFN-γ i 24 timer, og efterfølgende analyseret for luciferaseaktivitet. IFN-γ-induceret IP-10-promotor-aktivitet blev væsentligt forbedret i NIH3T3 celler transficeret med Pml
siRNA, sammenlignet med celler, der modtager kontrol siRNA (figur 6B). Efter transfektion af NIH3T3-celler med PML IV ekspressionsvektoren, blev IFN-γ-induceret IP-10 promotoraktivering betydeligt undertrykt. Nedregulering af PML udtryk med Pml
siRNA og overekspression af PML af PML IV ekspressionsvektoren blev verificeret ved immunoblotting. For at bestemme om der forekom den inhiberende virkning af PML på IFN-γ-induceret IP-10 promotoraktivitet i gastrisk cancer cellelinier udførte vi lignende forsøg med SNU-638 gastriske cancerceller. Mønstrene for stigning og fald i luciferaseaktiviteten i SNU-638 var svarende til den i NIH3T3-celler (Figur 6C). Niveauet af PML proteinekspression i SNU-638-celler transficeret med enten Pml
siRNA eller PML IV ekspressionsvektoren blev bekræftet ved immunoblotting (data ikke vist).
PML knockdown stigninger IFN-γ- induceret STAT-1 DNA-binding til IP-10-promotor
siRNA-celler opnået efter 0,5 h af IFN-γ behandling, stærk binding til murine IP-10-promotoren blev observeret (figur 7B, øverste panel, bane 5), sammenlignet med binding set i NIH3T3-kontrol siRNA celler (bane 3). De samme NE blev udsat for STAT-1 konsensus oligonukleotid, og STAT-1 DNA-binding blev forbedret i NE fra NIH3T3- Pml
siRNA-celler (Figur 7B, midterste panel, sammenligne banerne 3 og 5). Brug af SNU-638 gastriske kræftceller, vi fandt også, at STAT-1-DNA binding af PML
siRNA-transficerede SNU-638-celler var forøget sammenlignet med den af kontrol siRNA-transficerede celler, efter behandling med IFN-γ (figur 7C, sammenlign bane 3 og 5). Disse data indikerer, at PML delvist inhiberer STAT-1-binding til IP-10-promotoren, og at denne virkning er korreleret med øget IFN-γ-induceret IP-10 transkription i fravær af PML.
Diskussion
regulering af IP-10 ekspression.
+ /+ og Pml
- /- MEF'er, og PML knockdown i både NIH3T3 og SNU-638 celler. Data fra både væv tests menneskelige og Transwell migration analyser viste, at tabet af PML fremmer lymfocyt menneskehandel; således, søgte vi mekanismer, der kunne muligvis forklare disse iagttagelser. Vi viser, at en stigning i IP-10 niveauer i cancerceller udtrykker lave niveauer af PML bidrager til lymfocyt rekruttering. Derudover IP-10 neutraliserende antistof hæmmede T-celle migrering til konditioneret medium fra NIH3T3 fibroblaster og SNU-638 gastriske kræftceller in vitro
, i overensstemmelse med resultaterne af flere tidligere in vivo
undersøgelser , som viste, at neutralisering af IP-10 undertrykte T-celle rekruttering [39], [40]. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der viser, at tumor-suppressor, PML, regulerer IP-10 chemokin transkription og lymfocyttrafik i gastrisk cancer, ved at modulere aktiviteten af IFN-γ /STAT-1-signalvejen.
PML-medierede mekanismer.
en TNF-medieret proces, og at sensibilisere celler til apoptose ved at inhibere NF-KB-medieret overlevelse pathway [52]. Det er dog stadig, at være etableret, om tab af tumor suppressor PML bidrager til ændringer i immunresponset vært eller tumor mikromiljø, måske resulterer i enten immunosurveillance eller immun flugt, ved modulation af transkriptionsfaktorer. Således ville det være interessant at sammenligne virkningerne af tab af PML proteinekspression på NF-KB /STAT-3 og STAT-1 signalering, og at afgøre, om disse transkriptionsfaktorer funktion på en koordineret måde at regulere ekspressionen af en delmængde af kemokiner bidrager til udformningen af inflammatoriske tumor mikromiljøer.
+ /+ og Pml
- /- MEF'er blev oprettet og føres som beskrevet tidligere [53]. Den SNU-638 human gastrisk carconoma cellelinie, blev Jurkat human T-celle-lymfoblast-lignende cellelinie og EL-4 murine T-lymfomcellelinier opretholdt som tidligere beskrevet [2], [54].
gastric karcinom væv
Mikrober kunne forudsige fatale følger hos ventilerede COVID-19-patienter
Foranstaltninger til at forhindre SARS-CoV-2-transmission gennem spildevand i fattige regioner
Blodprøve for mikrobielt DNA kan advare om kræft
Hvide blodlegemer og deres rolle i hjernen
Tarmmikrobiom forbundet med adfærdsproblemer hos børn
Rotavirus spiller en rolle i udviklingen af type 1 -diabetes
Undersøgelse med tvillinger viser, at COVID-19-symptomer har et genetisk bidrag
En ny undersøgelse offentliggjort på fortryksserveren medRxiv fra Kings College, London, antyder, at en persons genetiske sammensætning kan bidrage til, hvor meget en person sandsynligvis vil blive
Forskere løser mystisk tilfælde af auto bryggeris syndrom
Forskere i Kina har gjort en vigtig opdagelse, der forklarer den forvirrende sag om en 27-årig mand, der havde en historie om at være beruset uden egentlig at have drukket alkohol. De fandt ud af, a
Plantebaseret kost forbedrer hjertesundheden via tarmmikrobiomet
En ny undersøgelse offentliggjort i februar 2020 i Journal of the American College of Cardiology rapporterer, at et reduceret indtag af animalsk mad og en kost baseret på planter kan resultere i en