Påvisning af sentinel og ikke-skildvagtslymfekirtel mikrometastaser ved fuldstændig seriel sektionering og immunhistokemisk analyse for gastrisk cancer

Påvisning af sentinel og ikke-skildvagtslymfekirtel mikrometastaser ved fuldstændig seriel sektionering og immunhistokemisk analyse for mavekræft
Abstract
Baggrund
Vi undersøgte forekomsten og fordelingen af ​​sentinel og ikke-sentinel node mikrometastaser bruger fuldstændig seriel sektionering og immunhistokemisk farvning (IHC), til at inspicere, om lymfeknude mikrometastaser spredt sig til skildvagtslymfekirtel først.
Metoder
A alt 35 patienter, som gennemgik gastrektomi med en skildvagtslymfekirtel biopsi for mavekræft, blev indrulleret i denne undersøgelse. Alt 1028 lymfeknuder fra 35 patienter med mavekræft uden metastase af lymfekirtel ved permanent sektion med hematoxylin og eosin-farvning (H &E) blev udvalgt. Der var 252 kontroldyr noder og de andre 776 var ikke-kontroldyr noder. Alle noder blev snittet serielt og farves skiftevis med H &E og IHC. blev påvist lymfeknude mikrometastaser blev defineret som viser sig at være positivt første enten IHC eller hele serielle sektionering.
Resultater
micrometastases i 4 (11%) af de 35 patienter, seks (0,58%) af 1028 noder. Af disse 4 patienter, 3 havde mikrometastaser udelukkende i sentinelle lymfeknuder, og den anden havde mikrometastase i både kontroldyr og ikke-kontroldyr noder. Der var ingen patient, som havde micrometasitases kun i ikke-sentinelle noder.
Konklusion
Disse resultater understøtter det koncept, at lymfeknude mikrometastase af mavekræft spreder først at sentinel noder.
Baggrund
prognose patienter med gastrisk cancer påvirkes primært ved tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastaser. Lymfeknudemetastaser i mavecancerpatienter med submukøse invasion forekomme i 15 til 20% af patienterne; derfor kan en lymfeknude dissektion være unødvendigt for de resterende 80 til 85% af patienterne [1]. En præcis og pålidelig indikator til at forudsige fraværet af lymfeknudemetastaser ville fjerne mange unødvendige lymphadenectomies [1]. Derfor er en præoperativ og præcis diagnose af lymfeknudemetastaser fortsat vigtigt [2-4]. En sentinel node biopsi for mavekræft er en intraoperativ diagnostisk metode til at påvise lymfeknudemetastaser [5-7]. I 1992 Morton et al. [8] indførte teknikken med intraoperativ farvestof injektion på det sted, melanoma at identificere "sentinel" knudepunkt, som er den første knudepunkt, at de afferente lymfekar ind fra tumorstedet. Miwa et al. [7, 9] ansat denne type farvestof kortlægning teknik til at identificere de sentinel knudepunkter i mavekræft, og rapporterede en høj positiv prædiktiv værdi og nøjagtighed for sentinel node biopsi af tidlig mavekræft. På den anden side er tilstedeværelsen af ​​en mikrometastase i en lymfeknude er et alvorligt problem for den kliniske anvendelse af sentinel node biopsi for tidlig mavekræft. Lymfeknude mikrometastaser er blevet fundet i patienter bestemt til at være node-negative ved rutinemæssig histologisk undersøgelse. Tidligere forskere har rapporteret, at kunne detekteres lymfeknude mikrometastaser udføre trin sektionering, immunhistokemisk farvning og revers transkriptase-polymerasekædereaktion [10-12]. Imidlertid har der været få rapporter om fordelingen af ​​mikrometastaser i både kontroldyr og ikke-sentinelle lymfeknuder i lymfeknude-negativ mavecancerpatienter ved rutinemæssig histologisk undersøgelse [13-15].
I denne undersøgelse har vi efterfølgende undersøgt tilstedeværelse og distribution af sentinel og ikke-sentinel node mikrometastaser bruger fuldstændig seriel sektionering og immunhistokemisk farvning. Disse teknik er de mest præcise metoder til påvisning mikrometastaser i noder, så vi kunne afgøre, om lymfeknude mikrometastaser havde spredt sig til skildvagtslymfekirtel først.
Metoder
En skildvagtslymfekirtel (SLNs) biopsi for mavekræft blev udført på 243 patienter ved Institut for gastroenterologiske kirurgi, Kanazawa Universitetshospital fra 1993 til 2002. Før sentinel node biopsi blev udført, blev skriftligt informeret samtykke opnået i overensstemmelse med de etiske standarder i Udvalget for menneskelige forsøg med Kanazawa Universitetshospital. Af disse patienter vi indskrevet 35, som havde en cancer, der havde invaderet til submucosa eller muscularis propria og havde ingen lymfeknudemetastase ved rutinemæssig histologisk undersøgelse til denne undersøgelse. Ingen af ​​patienterne havde modtaget præoperativ kemoterapi eller strålebehandling. Baseret på den japanske Klassifikation af gastrisk karcinom, alle 35 patienter gennemgik en sentinel node biopsi efterfulgt af konventionel lymphadenectomy for back-up dissektion [16]. I alt 1028 lymfeknuder blev fjernet fra 35 patienter. Af disse 252 lymfeknuder var SLNs og de andre 776 var ikke-SLNs. Alle 252 SLNs var negative for metastaser både på intraoperativ frosne snit undersøgelse og permanent sektion med hematoxylin og eosin-farvning (H &E). De andre 776 knuder var negative for metastaser på histologisk undersøgelse af H &E multiple trin sektionering på 0,2 cm mellemrum. De clinicopathologic data blev vurderet ifølge den japanske Klassificering af gastrisk kræft [16]. De variabler patienter er anført i tabel 1. Til påvisning af SLNs anvendte vi intraoperativ endoskopisk lymfatiske kortlægning (IELM), som bestod af en intraoperativ injektion af 0,2 ml 2% patentblåt i det submukøse lag ved fire steder rundt gastrisk karcinom gennem en gastroskop [9]. Farvestoffet optrådte straks ved serøse overflade og farves lymfekar og knuder [5, 9]. I denne undersøgelse blev SLN defineret som lymfeknuden der farves blå 20 minutter efter injektionen. De lymfe bassiner blev defineret som det område, der indeholder de farvede lymfekar, og som var i stand til at blive opdelt i fem kategorier efter anvisningerne i arterierne omgivet maven, som følger: venstre gastrisk arterie område, retten gastrisk arterie område, højre gastroepiploic arterie område, retten gastroepiploic arterie område og den bageste gastrisk arterie område. De udskårne SLNs blev sendt for frosset-sektion undersøgelse. Lymfeknuderne farvet med H &E på repræsentative snit blev skåret langs planet med den største diameter, der omfattede node hilus, og undersøgt intraoperativt for metastases.Table 1 Patienter karakteristika
Median alder (interval)
62 (37-85)
Sex
Mand
23
Female
12
dybde invasion
SM
24
MP
11
Histologisk type,
Differentieret *
18
Udifferentieret * *
17
lymfekar invasion
Negativ
16
positiv
19
Vaskulær invasion
Negativ
30
positiv
5
SM, submucosa; MP, muscularis propuria
* Den differentierede type papillær, godt og moderat differentierede rørformede adenokarcinomer
** Den udifferentierede type. Dårligt differentieret adenocarcinom, mucinøs adenocarcinom og signet-ring celle karcinom
De resterende frosne væv var optøet, og de væv og ikke-SLNs blev rutinemæssigt skåret ved 0,2 cm mellemrum. Efterfølgende blev de multiple snit lymfeknuder og operativt fjernede prøver fikseret i 10% formalin, behandles gennem gradueret ethanol og indlejret i paraffin til permanente sektioner. Lymfeknuderne blev farvet med H &. E og blev undersøgt af to patologer
I denne undersøgelse blev alle resektion lymfeknuder sektioneret serielt ved 25 um intervaller på 4 um tykkelse ud og enten farves skiftevis med H &E og immunhistokemisk farvning (IHC) anvendelse af et anti-cytokeratin-antistof. Envision teknik blev anvendt (DAKO, Carpinteria, CA) for IHC og vi brugte det monoklonale anti-human cytokeratin 8/18 antistof (Santa Cruz Biotechonology, Californien, USA) [17-19]. Alle de vigtigste tumorprøver fra 35 patienter blev udsat for cytokeratin farvning og blev anvendt som en positiv kontrol. En lymfeknude mikrometastase blev defineret som en node negativ for metastase af vores rutine histologisk undersøgelse, men positiv ved enten IHC eller de komplette serielle sektionsopdelingen metoder.
Resultater
samlede antal afsnit undersøgte var 24.094. Af disse 5986 var SLNs og 18.108 var ikke-SLNs. Af de 35 patienter, 4 (11%) havde mikrometastaser. En mikrometastase blev fundet i 6 af 1028 knudepunkter (0,6%) og 60 sektioner (0,3%) af 24.094 (fig. 1, 2). Af disse 6 knuder, der involverer et mikrometastase, 4 var SLNs og de andre to var ikke-SLNs i lymfe bassin. Ingen mikrometastaser blev detekteret uden for bassinet (tabel 2). Detaljerne i distributionen mønster, placering og størrelse af mikrometastaser er vist i tabel 3, 4 og 5. Af de 4 patienter, der havde en lymfeknude mikrometastase, 3 patienter havde mikrometastaser udelukkende i SLNs. Den anden patient havde en mikrometastase i både SLN og ikke-SLNs i det lymfatiske bassinet. Ingen patienter havde en mikrometastase kun i ikke-SLNs. Ingen patient har endnu lidt en gentagelse eller er død i december, 2007.Table 2 Antal og placering af lymfeknuder med mikrometastase
Placering af knuder
Antal knuder

med mikrometastase
uden mikrometastase
SLNs
4 fotos 248
ikke-SLNs i lymfe bassin
2
653
ikke-SLNs ud af bassinet
0
121
Alle noder
6
1022
SLNs, skildvagtslymfekirtel
tabel 3 Fordeling mønster af lymfeknude mikrometastase

Antal tilfælde
Distribution mønster af mikrometastase
Rutinemæssig histologisk undersøgelse
komplet seriel sektionsopdelingen og IHC
SLNs (-), ikke-SLNs (-)
35
31
SLNs (+), ikke-SLNs (-)
0
3
SLNs (+), ikke-SLNs (+)
0
1
SLNs (-), ikke-SLNs (+)
0
0
SLNs, skildvagtslymfekirtel; IHC, immunohistochemic farvning
Tabel 4 Placering af lymfeknude mikrometastase
tilfælde
Placering af tumor

Stained lymfe bassiner
Antal SLNs
Antal micrometastsis
Station af mikrometastase af SLNs
Station af mikrometastase af ikke-SLNs

1
M, Mindre
Venstre GA
8
1
No.3 LN -
2
M post
. Venstre GA Right GEA
5
1
No.3 LN
-.
3
M, Ant
Venstre GA
2
1
No.3 LN -
4
M, Mindre
Venstre GA Right GEA
10
3
No.3 LN
No.3 LN
SLNs, skildvagtslymfekirtel; M, midterste tredjedel af maven; Mindre, mindre krumning; Indlæg.; posterior væg; Myre. forreste væg; GA, gastrisk arterie; GEA, gastroepiploic arterie; No.3 LN, LN langs mindre krumning
Tabel 5 Webstedet og størrelse af lymfeknude mikrometastase
tilfælde
Type af lymfeknude

site i lymfeknude
størrelse mikrometastase (mm)
1
SLN
perifer sinus
1,2
2
SLN
perifer sinus
0,3
3
SLN
perifere sinus
0,2
4
SLN
perifere sinus
0,6
ikke-SLN
perifer sinus
1,0
ikke-SLN
perifere sinus
1,0
SLN, skildvagtslymfekirtel
Figur 1 lymfeknude mircrometastasis som påvist ved immunhistokemisk farvning med en cytokeratin antistof. (× 400).
Figur 2 Ingen kræftceller blev identificeret i dette afsnit af rutine histologisk undersøgelse. (Hæmatoxylin & eosin farvning × 40). (B) Lymfeknude mikrometastase i repræsentativt udsnit af hele seriel sektionering metode. (Immunohistokemisk farvning, × 40). (C) mikrometastase lymfeknude i repræsentativt udsnit af hele seriel sektionering metode. (Immunhistokemisk farvning, × 400)
Diskussion
Miwa et al. indført begrebet sentinel node biopsi for mavekræft [7]. Den kliniske anvendelse af sentinel node biopsi for at bestemme den kirurgiske metode til gastrisk cancer kræver kontrol af dette koncept på niveau med lymfeknude mikrometastaser. I denne undersøgelse undersøgte vi tilstedeværelsen og fordelingen af ​​lymfeknudeceller mikrometastaser i patienter med gastrisk cancer, som havde en sentinel node biopsi. For nylig er tilstedeværelsen af ​​lymfeknudeceller mikrometastaser upåviselige ved rutinemæssig histologisk undersøgelse er rapporteret i bryst, lunge, spiserør, mavesæk, colon og galdeblære kræft. Det er blevet rapporteret, at en lymfeknude mikrometastase var en dårlig prognostisk indikator i bryst-, lunge- og coloncancer [20-22]. Enkelte forfattere har rapporteret, at en lymfeknude mikrometastase var en dårlig prognostisk faktor i mavecancerpatienter [23, 24]. Således er betydningen af ​​detektering af en lymfeknude mikrometastase blevet understreget af forskellige neoplastiske sygdomme.
En række fremgangsmåder til påvisning eksistere lymfeknude mikrometastaser, herunder IHC og polymerasekædereaktion assays. Matsumoto et al. påvist, at revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) er mere følsom end IHC til påvisning af mikrometastaser [2]. Imidlertid Yamamoto et al. [25] foreslog, at positive resultater med et molekylært assay, såsom RT-PCR ikke kan være tegn på tilstedeværelse af levedygtige tumorceller, men snarere tilstedeværelsen af ​​tumor-DNA og således kan være forbundet med en stærkt forøget falske positive på trods af højere følsomhed af den molekylære assay. På den anden side er det blevet rapporteret, at den serielt sektionering øget identifikationen af ​​tumorceller i de perifere bihuler af lymfeknuder [26]. Det menes, at seriel sektionering med IHC er den mest nøjagtige metode til påvisning af lymfeknude mikrometastaser. Derfor har vi udsat hele prøven til seriel sektionering og IHC. Antistoffet anvendes til IHC var et monoklonalt anti-humant cytokeratin 8/18 antistof, som er mere følsom, specifik, enkel, nøjagtig og økonomisk end andre antistoffer for IHC. Salg Tumor lån inden lymfeknuder blev klassificeret og indfasningsmål ifølge reviderede retningslinjer fastsat af den Internationale Union Against Cancer (UICC) 6 th Edition. Ifølge denne klassifikationssystem, metastaser mindre end 0,2 cm blev anset mikrometastaser (MMS), og isolerede tumorceller (ITC) var enlige tumorceller eller små klynger af celler, der målte ikke er større end 0,2 mm og blev normalt opdaget af IHC eller molekylære metoder , men kan kontrolleres med H &E. ITC'er viser ikke typisk tegn på metastatisk aktivitet ved proliferation, induktion af en stromal reaktion eller penetrering af vaskulære eller lymfatiske sinus wall invasion [27, 28]. Nakajo et al. [23] og Siewert et al. [29] rapporterede, at lymfekirtelinvolvering klassificeres i klyngedannelse eller enkeltcelle-form, i henhold til resultaterne af IHC for cytokeratin. Deres resultater tydede på, at enkelte celler ikke kan formere sig i lymfeknuder, fordi de allerede var dræbt af lokale og generelle immunocytter. En klynge af celler med en stromal reaktion kan let proliferere og derfor har metastatisk potentiale. I vores afdeling er resektion lymfeknuder rutinemæssigt skæres 0,2 cm mellemrum, og lymfeknuder undersøges for metastaser. Så i denne undersøgelse, at definitionen af ​​lymfeknude mikrometastase afveg fra UICC klassificering. Til denne undersøgelse blev det defineret som et knudepunkt, negativ for metastase af vores rutine histologisk undersøgelse af sektioner skåret ved 0,2 cm mellemrum, men positive ved fuldstændig seriel sektionering med H &E og IHC. Desuden blev alle enkelt celletyper og lille klynge typer uden stromal reaktion af cytokeratin positiv farvning ikke er anerkendt som kræftceller i næste H &E-farvede objektglas. Således har vi udelukket alle enkelte celler og små klynger uden stromale reaktion, der er klassificeret som ITC i klassifikationssystem for UICC, fra den positive lymfeknude mikrometastase gruppe [27, 28].
Vi ekskluderede mavens kræftpatienter, hvis tumorer havde invaderet til slimhinden i denne undersøgelse, fordi at gøre fuldstændig seriel sektionering og immunhistokemisk farvning var en masse arbejde; derudover, satsen for en lymfeknude mikrometastase var lav. Følgelig vi indskrevet 35, som havde en gastrisk cancer, som havde invaderet til submucosa eller muscularis propria og havde ingen tegn på en lymfeknudemetastase ved histologisk undersøgelse til denne undersøgelse.
I denne undersøgelse observerede vi en lymfeknude mikrometastase i 4 patienter (11%) med en gastrisk cancer, som havde invaderet til submucosa eller muscularis propria. I mavekræft, Isozaki et al. [30] og Natsugoe et al. [31] rapporterede, at lymfeknudeceller mikrometastaser blev identificeret i 10 til 30% af enheder for trin-sektionering eller IHC. Vores resultater var den mest præcise af alle de seneste undersøgelser og beviste de konkrete omstændigheder i lymfeknude mikrometastase af gastrisk kræft, der havde invaderet til submucosa eller muscularis propria.
I denne undersøgelse undersøgte vi de lymfeknude mikrometastaser af SLNs og ikke -SLNs. Vi fandt lymfeknude mikrometastaser i SLNs af 4 patienter. En patient havde også en mikrometastase i en ikke-SLN af lymfe bassinet, selvom ingen mikrometastaser af ikke-SLNs blev identificeret uden for bassinet. Endvidere ingen patient havde en lymfeknude mikrometastase kun i en ikke-SLN. Vores resultater viste, at de patienter, der ikke havde en lymfeknude mikrometastase i SLNs også ikke havde en mikrometastase i de ikke-SLNs. Disse resultater kan understøtte konceptet, at lymfeknude mikrometastaser spredt først til SLNs, derefter til ikke-SLNs i lymfe bækkenet og endelig til ikke-SLNs uden for bassinet. Derfor baseret på dette koncept, er det tilstrækkeligt kun at undersøge de SLNs at afgøre, om der er lymfeknude mikrometastaser hos patienter med mavekræft.
Det er stadig uklart, om en lymfeknude mikrometastase er en prognostisk faktor i gastrisk kræft . Imidlertid blev en lymfeknude mikrometastase findes i gastrisk cancer patienter, som havde ingen tegn på en lymfeknudemetastase ved rutinemæssig farvning. Dette resultat antyder, at vi forsigtigt bør reducere omfanget af lymfeknude dissektioner. Den intraoperativ fravær af en SLN mikrometastase antyder, at omfanget af lymfeknudedissektion kan sikkert reduceres, fordi det er usandsynligt for ikke-SLNs at have mikrometastaser uden en SLN mikrometastase. I tilfælde af brystkræft, er ikke afgørende behov for intraoperative diagnose af lymfeknude mikrometastaser, fordi yderligere dissektion af de axillære lymfeknuder kan udføres nemt. Den efterfølgende dissektion af lymfeknuder er vanskelig i gastrisk cancer; derfor intraoperative diagnose af lymfeknudeceller mikrometastaser er afgørende. Vi mente, at når en lymfeknude mikrometastase var til stede, bør vi udføre en lymfeknude dissektion på nuværende. Vores undersøgelse udnyttede de mest nøjagtige metoder, men vi kunne ikke opnå de resultater, hurtigt nok til en itraoperative diagnose. Derfor er vi nødt til at etablere en præcis metode til hurtig intraoperativ identifikation. Matsumoto et al. hævdede, at intraoperativ hurtig immunfarvning var en enkel og nyttig teknik til påvisning af lymfeknudeceller mikrometastaser [32]. En ultra-hurtig RT-PCR-system, som kan fuldende påvisning af cancerceller inden for ca. 70 minutter er blevet udviklet. I den nærmeste fremtid, vil disse metoder blive anvendt til at detektere lymfeknude mikrometastaser i SLNs under operationen [33].
Konklusion
vi har vist evnen til at opdage lymfeknude mikrometastaser ved at udsætte hele prøven til at fuldføre seriel sektionering og IHC for node-negative mavecancerpatienter der har haft en sentinel node biopsi. Disse resultater understøtter det koncept, at lymfeknude mikrometastaser spreder først til SLNs. Desuden kan den intraoperative og hurtig diagnose af lymfeknudeceller mikrometastaser i SLNs hjælper med at styre passende lymfeknudedissektion i mavecancerpatienter. Derfor vil en hurtig og nøjagtig intraoperativ diagnose af lymfeknude mikrometastaser i SLNs være nødvendige og bør være i fokus for fremtidige undersøgelser.
Erklæringer
Taksigelser
Forfatterne er taknemmelige for professor Tetsuo Ohta i Kanazawa University for dette studere. Og vi har også takket være pre-professor Koichi Miwa.
Forfattere 'originale filer indsendt til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 13046_2008_7_MOESM1_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 1 13046_2008_7_MOESM2_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 2

• Cancerassocierede fibroblaster er positivt korreleret med metastatisk potentiale af humane gastrisk cancers
• Lange ikke-kodende RNA-ekspression profil i human gastrisk cancer og dens kliniske betydninger