Påvisning af promotor hypermethylering af CpG øen E-cadherin i gastrisk kardial adenocarcinoma

Påvisning af promotor hypermethylering af CpG øen E-cadherin i gastrisk cardiac adenocarcinom
Abstract
Sigt
Unormal hypermethylering af CpG-øer forbundet med tumorsuppressorgener kan føre til transkriptionel nedregulering i neoplasi. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge promotoren methylering og ekspression af E-cadherin-genet i gastrisk kardial adenocarcinom (GCA). Salg Metoder
En nested MSP tilgang, immunhistokemi fremgangsmåde og RT-PCR blev anvendt henholdsvis til at undersøge status af 5'CpG ø E-cadherin, dets proteinekspression og mRNA-ekspression i tumorer og tilsvarende normale væv methylering.
Resultater
E-cadherin blev methyleret i 63 af 92 (68,5%) tumorprøver, hvilket var signifikant højere end den tilsvarende normale væv (P < 0,001). Methylering frekvenser af trin III og IV tumorvæv var betydeligt højere end den i trin I og II tumorvæv (P = 0,01). Status for methylering af dårlig differentiering var væsentligt højere end moderat og ringe-moderate differentieringsfaktorer grupper (P < 0,01). Ved immunfarvning viste 51 af 92 tumor tisssues heterogen, positiv immunfarvning af tumorvæv (44,6%), markant forskellige fra matchede normale væv (P < 0,001). Positiv immunfarvning af fase III og IV tumorvæv var betydeligt lavere end trin I og II tumorvæv (P < 0,01). Dårlig differentiering gruppe var også signifikant lavere end moderat og ringe-moderate differentieringsfaktorer grupper (P < 0,05). 80 procent af tumorvæv med E-cadherin gen methylerede viste inaktiveret mRNA-ekspression.
Konklusioner
status Høj methylering af 5'CpG ø E-cadherin genet kan være en af ​​de mekanismer i udviklingen af ​​gastrisk cardiac adenocarcinom .
Nøgleord
E-cadherin methylering gastrisk cardiac adenocarcinom Introduktion
E-cadherin er en M r 120.000 transmembrane glycoprotein udtrykt på epitelceller og er ansvarlig for homofil, Ca 2 + -afhængig intercellulære adhæsion, som er afgørende for opretholdelsen af ​​normalt væv arkitektur i epitelvæv [1]. Det cytoplasmatiske domæne af E-cadherin binder til a-, β- og y-catenins, som er igen knyttet til aktinerne, og denne interaktion er kritisk for dets funktion [2]. Celle-celle og celle-matrix-interaktioner er afgørende involveret i neoplastisk transformation og metastase [3, 4]. Defekt celleadhæsion kan bidrage til tab af kontaktinhibering af vækst og tab af celleadhæsion kan forklare evnen hos cancerceller til at krydse normale væv grænser og metastase [5]. Betydningen af ​​E-cadherin i at bevare celleadhæsion indebærer, at dens dysfunktion kan spille en vigtig rolle i tumorigenese. Tab af E-cadherin ekspression forekommer i en række humane tumorer og antages at være et vigtigt skridt i progressionen fra tumordannelse for invasion og metastase [6].
I de senere år er der flere undersøgelser vedrørende den kritiske rolle af E-cadherin i tumorigenese. Det er blevet vist, at kim-line mutationer af E-cadherin-genet er relateret til familiær gastriske og kolorektal cancer [7, 8]. Endvidere blev somatiske mutationer af E-cadherin også findes i gastrisk karcinom og allele tab af E-cadherin locus på 16q22.1 er blevet rapporteret i forskellige epiteliale tumorer, såsom bryst-, ovarie-, endometrie-, og prostatacarcinomer [9, 10] . Bortset fra denne genetiske ændringer, epigenetisk ændring omfatter hypermethylering af 5'CpG ø i promotoren af ​​E-cadherin er også ansvarlig for transkriptionel repression af genet [11]. Det er kendt, at unormal hypermethylering af CpG-øer forbundet med tumorundertrykkende gener kan føre til transkriptionel nedregulering i neoplasi [12]. Faktisk methylering-associeret inaktivering af E-cadherin repræsenterer den mest almindelige årsag til dets inaktivering i flere kræftformer, såsom lever, prostata, bryst og esophageal [13-15].
Gastrisk kardial adenocarcinom (GCA), som tidligere var registreret som esophageal cancer eller gastrisk cancer, er blevet diagnosticeret uafhængigt i de allerseneste år, som følge af forbedringen i begyndelsen endoskopisk screening og patologisk diagnose. Kina er et land med høj forekomst regioner GCA, Især i Taihang bjerg af det nordlige Kina. Udefra kommende faktorer, herunder ernæring mangel, usunde levevaner, forbrug af alkohol og tobak, er patogene infektioner generelt betragtes som risikofaktorer for udvikling af GCA i Kina [16-18]. kun en undergruppe af personer udsat for de ovenfor anførte eksogene risikofaktorer ville udvikle GCA, hvilket antyder, at flere genetiske og epigenetiske begivenheder kan dog bidrage til udviklingen af ​​GCA. Det er nu i stigende grad anerkendt, at epigenetisk inaktivering af genekspression ved promotor-CpG hypermethylering er et vigtigt alternativ mekanisme til at inaktivere tumorsuppressorgener og tumorassocierede gener i cancere [19]. Mutationer af E-cadherin-genet er sjældne i GCA således i denne undersøgelse vurderede vi rollen methylering af 5'CpG ø E-cadherin og dets korrelation med reduceret E-cadherin-ekspression i GCA.
Metoder
patienter og prøver
Tumor og parrede normale vævsprøver blev opnået fra 92 patienter. Disse væv blev delt i to parallelle dele, den ene del blev frosset og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA blev ekstraheret, den anden side var formalinfikseret og paraffinindlejret. Sagerne var alle indlagte for kirurgisk behandling i fjerde Tilknyttede Hospital, Hebei Medical University mellem 2004 og 2006. Histologisk tumor maskinskrivning blev udført på baggrund af resektion prøver i Patologisk Institut for det samme hospital. Alle gastriske kardiale carcinomer var adenocarcinomer med deres epicenters på gastroøsofageal krydset, dvs. fra 1 cm over indtil 2 cm under samlingen mellem enden af ​​den rørformede spiserøret og begyndelsen af ​​den Sækformet mave [20]. Oplysninger om TNM stadieinddeling var tilgængelige fra hospital optagelser og patologisk diagnose. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Hebei Cancer Institute og informeret samtykke blev opnået fra alle rekrutteret fag.
Methylering specifik polymerasekædereaktion (MSP) for E-cadherin promotor methylering
Genomisk DNA fra gastrisk cardiac adenokarcinomer og tilstødende ikke-maligne sektioner blev isoleret fra paraffinindlejrede væv slides ved standardmetoder under anvendelse af en forenklet proteinase K-fordøjelse metode. At undersøge de DNA-methyleringsmønstre behandlede vi genomisk DNA med natriumbisulfit, som tidligere [21] beskrevne. Kort fortalt blev 2 pg DNA denatureret med 2 M NaOH ved 37 ° C i 10 minutter, efterfulgt af inkubation med 3 M natriumbisulfit, pH 5,0, ved 50 ° C i 16 timer. Bisulfit behandlede DNA blev derefter oprenset (DNA Cleanup Kit, Promega, Madison, Wisconsin, USA), inkuberet med 3 M NaOH ved stuetemperatur i fem minutter, udfældet med 10 M ammoniumacetat og 100% ethanol, vasket med 70% ethanol, og resuspenderet i 20 ul destilleret vand.
En nested PCR strategi blev anvendt til bestemmelse status for methylering i E-cadherin CpG ø i exon 1 (sekvens -126 bp til 144 bp i forhold til transkriptionsstarten, GenBank accession nummer D49685 ), som tidligere er blevet offentliggjort [15]. I den første runde af PCR blev 100 ng af bisulfit-behandlet DNA amplificeret. Sekventeringsprimerne var 5'-GTTTA GTTTTGGGGAGGGGTT-3 '(sense) og 5'-ACTAC TACTCCAAAAACCCATAACTAA-3' (antisense), og de cyklusbetingelser var en cyklus på 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af 95 ° C i 30 s, 50 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 min. Størrelsen af ​​produktet efter denne indledende PCR-reaktion var 270 bp. For den anden runde af PCR, blev dette produkt fortyndet 1: 50 i vand, og 2 pi af fortyndingen blev brugt til MFP. Indlejrede primersekvenser for E-cadherin for den methylerede reaktion var 5'-TG TAGTTACGTATTTATTTTTAGTGGCGTC-3 '(sense) og 5'-CGAATACGATCGAATCGAACCG-3' (antisense), og primersekvenser for ikke-methylerede reaktion var 5'-TGGTTGTAGTTATGTATTTATT TTTAGTGGTGTT-3 '(sense) og 5'-ACACCAAATA CAATCAAATCAAACCAAA-3' (antisense). PCR parametre var som anført ovenfor, bortset fra, at udglødningstemperaturer for de methylerede og ikke-methylerede reaktioner var 64 ° C og 62 ° C. Produktegenskaberne størrelser af methylerede og ikke-methylerede reaktioner var 112 og 120 bp. Brystkræft cellelinien MB-MDA-231, hvilket viser methylering og inaktivering af E-cadherin og reagensblindprøver blev anvendt som positive og negative kontroller.
Immunohistokemisk farvning for E-cadherin
E-cadherin-ekspression blev bestemt ved immunfarvning under anvendelse af avidin-biotin kompleks immunperoxidase metode, der blev udført på parallelle histopatologiske snit fra paraffinindlejret tumor sektion og parret normalt væv. Endogen peroxidase blev blokeret med 3% hydrogenperoxid i 10 minutter, efterfulgt af mikrobølge antigen-genvinding i ni minutter ved 98 ° C i 10 mM natriumcitratbuffer (pH 6,0) og inkuberet i 2% normalt hesteserum til minimering af ikke-specifik binding. Objektglassene blev sekventielt inkuberet med primært monoklonalt, muse-anti-E-cadherin antistof (1: 100 fortynding i phosphatbufret saltvand, Santa Cruz, sc-8426) natten over ved 4 ° C, biotinyleret sekundært antistof i 30 minutter ved 37 ° C og ABC-reagens i 45 minutter ved 37 ° C. 0,5% 3,3'-diaminobenzidin (Sigma, St. Louis, MO) blev anvendt som chromagen. For en negativ kontrol blev det primære antistof erstattes med muse IgG. Slides med normal maveslimhinden blev anvendt som en positiv kontrol.
Måling af mRNA ekspression af E-cadherin
RNA blev ekstraheret fra frosne sektion væv ved standardmetoder under anvendelse af Trizol (Invitrogen, USA). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af Advantage RT-for-PCR-kittet (Clontech, Palo Alto, CA) med oligo (dT) priming som anbefalet i protokollen tilvejebragt. GAPDH genet blev anvendt som kontrol. Primersekvenser af E-cadherin var 5 ° ‰ -CGACCCAACC CAAGAATCTA-3 ° ‰ (sense) og 5 ° ‰ -AATGGCAG GAATTTGCAATC-3 ° ‰ (antisense), primersekvens af GAPDH var 5 ° ‰ -GGGAAACTGTGGCGT GAT-3 ° ‰ (sense) og 5 ° ‰ -GTGGTCGTTGAGGG CAAT-3 ° ‰ (antisense), produktstørrelse var 202 bp og 342 bp. PCR-produkter blev opløst på 2% agarosegeler og signalintensiteter blev kvantificeret ved anvendelse af en computer imaging system. Niveauerne af gentranskripter blev kvantificeret som forholdet mellem intensiteten af ​​E-cadherin signal til intensiteten af ​​β-actin. Inaktiveret ekspression blev scoret, da ekspression af en E-cadherin genet i tumoren prøve var < 25% af sit udtryk i den tilsvarende normale prøve.
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført ved hjælp SPSS10.0 softwarepakke (SPSS Company, Chicago, Illinois, USA). Fishers eksakte test og Chi-square test blev anvendt til at vurdere den statistiske signifikans af forskelle og sammenligne kategoriske sammenslutninger. To-sidet test blev anvendt til at bestemme betydning, og P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant for alle statistiske tests.
Resultater
Emne karakteristika
Som vist i tabel 1, blev 92 GCA patienter opnået i denne forskning, herunder 73 mandlige og 19 kvindelige, alder varierede fra 38 ~ 76, gennemsnitsalder 56,9. Alle sager blev klassificeret i 4 tumor-node-metastaser (TNM) etaper efter UICC standard, 8 i fase I (8,7%), 32 i fase II (34,8%), 38 i fase III (41,3%), 14 af trin IV (15,2%). Ifølge de patologiske faser blev sagerne inddeles i 3 grupper, 42 (45,7%) af moderat gruppe, 34 (36,9%) af dårlig moderat gruppe og 16 (17,4%) af dårlig group.Table 1 Kliniske og patologiske karakteristika GCA patienter
grupper
n (%)
Sex
Mand
73 (79,3)
Kvindelige 19 (20,7 )
Mean alder i år (SD)
56,9 (8,86)
TNM stadie
jeg
8 (8,7)
II
32 (34,8)
III
38 (41,3)
IV
14 (15,2)
Patologisk differentiering af tumor
moderat
42 (45,7)
dårlig moderat
34 (36,9)
dårlig
16 (17,4)
methyleringsanalyse af E-cadherin genet
methylering analyse blev positivt resultat i alle tumor og parret normale vævsprøver (figur 1). For 10% af prøverne, blev methylering analyse gentages for kvalitetskontrol. I 63 (68,5%) af 92 GCA tumorer E-cadherin methylering blev registreret, mens af parrede normale væv blev fundet kun 10 (10,9%) E-cadherin methylering. Hyppigheden af ​​E-cadherin methylering af tumorvæv var betydeligt højere end parrede normale væv (P < 0,001). Når stratificeret for TNM etaper, Hyppighed af E-cadherin gen methylering af GCA patienter med stadium III og trin IV (78,8%) var signifikant højere end GCA patienter med stadie I og fase II (55%) (χ2 = 5,96, P = 0,01 ). Når stratificeret for patologiske stadier, de E-cadherin gen methylering frekvenser af moderat, dårlig moderat og fattig gruppe var 52,4%, 73,5% og 100%, frekvens af E-cadherin gen methylering af dårlig gruppe betydeligt højere end i moderat og fattige -moderate grupper (χ2 = 8,92, P = 0,003) (tabel 2). Figur 1 Methyleringsanalyse af E-cadherin i tumorvæv (T) og tilsvarende normalt væv (N). u: indikerer tilstedeværelsen af ​​ikke-methylerede gener; m: indikerer tilstedeværelsen af ​​methylerede gener. Tilfælde 1 og 2: tumorspecifik methylering; Case 3: tumoren er fuldt methyleret, mens den tilsvarende normale væv har en meget svagt bånd demonstrerer methylering; Case 4: både tumor og tilsvarende normale væv umethyleret
Tabel 2 E-cadherin methylering og immunohistokemisk farvning karakteristika GCA patienter
<. col> Gruppe
methylering status
P
immunhistokemisk farvning
P
M
U
-
+
TNM stadie
jeg
4
4
2
6
II
18
14
13
9
III
29
9
26
12
IV
12
2
0.015a
10
4
0.002a
Patologisk differentiering af tumor
moderat
22
20
20
2
dårlig moderat
25
9
18
16
fattige
16
0
0.003b
13
3
0.022b
en P værdi på stadium III og IV patienter mod trin i og II patienter b P-værdi af dårlig differentiering gruppe mod moderate og dårlig moderate grupper Salg immunfarvning af E-cadherin genet
Som vist i tabel 2, farvningen var heterogen i 51 tumorvæv, tumorceller med nedsat membranøs E-cadherin-farvning blev blandet med tumorceller viser stærk membranøs farvning (figur 2). Hyppighed af proteinekspression var 44,6% i tumorvæv, mens parrede normale vævsprøver alle demonstreret diffus stærk membranøs E-cadherin-farvning. Hyppighed af proteinekspression var signifikant forskellig mellem tumor og parrede normale væv (P < 0,001). Når stratificeret for TNM etaper, Hyppighed af E-cadherin gen protein udtryk for stadium III og IV tumorvæv (30,8%) var signifikant lavere end i fase I og II-tumorvæv (62,5%) (χ2 = 9,21, P = 0,002) . Hyppighed af E-cadherin gen proteinekspression af dårlig gruppe signifikant lavere end i moderate og fattige-moderat grupper (χ2 = 5.23, P = 0,022). Figur 2 E-cadherin immunofarvningsprocedure i GCA væv. A: positiv farvning (normalt væv). B:. Negativ farvning (GCA væv)
mRNA-ekspression for E-cadherin gen
Niveauer af transkripterne blev bestemt i de 32 udvalgte frosne GCA prøver ved RT-PCR-analyse (figur 3). De 32 GCA prøver, herunder to af fase I, 2 i fase II, 8 i fase III og 8 i trin IV af tilfælde, hvor tumoren var methylerede og 12 tilfælde (2 i fase I, 4 trin II, 4 i fase III og 2 i trin IV) med umethyleret E-cadherin gen. En 202 bp fragment af E-cadherin gentranskript blev dannet, med en 342 bp GAPDH-fragment af transkriptet som en kontrol. 16 (1 til trin II, 7 i stadium III og 8 i trin IV) tilfælde (80%) af inaktiveret-mRNA-ekspression blev observeret i 20 tumorprøver med E-cadherin genet methyleret, andre 4 (2 trin I, 1 af fase II, en af ​​fase III) tilfælde viste positivt udtryk. 12 tumor prøver med E-cadherin gen umethyleret alle viste positivt udtryk for E-cadherin genet. Figur 3 mRNA-analyse af E-cadherin i tumorvæv. 1: 100 bp DNA markør 2,4,5,6,9: positiv mRNA udtryk 3,7,8:. Negativ mRNA-ekspression
Diskussion
Kina er et land med høj forekomst af fordøjelseskanalen kræft, som herunder esophageal carcinoma, gastrisk cancer og gastrisk hjerte- adenocarcinom (GCA). GCA, der tidligere blev registreret som esophageal cancer eller gastrisk cancer, er blevet diagnosticeret uafhængigt i de allerseneste år, som følge af forbedringen i begyndelsen endoskopisk screening og patologisk diagnose. Det er blevet foreslået af flere epidemiologiske data, at forekomsten af ​​GCA er stigende i de senere år. Nogle undersøgelser har vist, at den mekanisme, og klinisk symptom på GCA er forskellig fra mavekræft, men ligner kræft i spiserøret. Den nøjagtige mekanisme af forekomsten af ​​GCA fortsat uklart for øjeblikket. Det er almindeligt accepteret, at den arvelige faktor, irriterende forekomsten af ​​tumor herunder to mekanisme, genetik og epigenetik mekanisme. Genetiske abnormiteter af proto-onkogener og tumor-suppressor gener er velkendte ændringer, der ofte er involveret i cancer patogenese. Imidlertid er Epigenetisk inaktivering af visse tumorsuppressorgener ved afvigende promotor methylering hyppigt observeret i flere kræftformer og kan spille en central rolle i tumorigenese. Mens genetiske abnormiteter er associeret med ændringer i DNA-sekvensen, kan epigenetiske begivenheder fører til ændringer i genekspression, som forekommer uden ændringer i DNA-sekvensen. Hvis tumorsuppressorgener påvirkes, resulterer sædvanligvis i transkriptionel nedregulering og dermed inaktivering af dette gen. Den kan derefter give vækst fordele til disse celler, der fremmer udviklingen af ​​kræft [22].
Som medlem af celleadhæsion molekylære, E-cadherin spille en vigtig rolle i opretholdelsen af ​​celleadhæsion og dens dysfunktion kan resultere i tumorigenesis.6 Den biologiske konsekvenserne af sin dysfunktion omfatter afbrydelse af intercellulære vedhæftning og nedskrivning af ß-catenin-medieret transaktivering [23]. Til dato, men de reguleringsmekanismer, der er ansvarlige for ændrede niveauer af E-cadherin proteiner i GCA er ikke blevet belyst. Det er blevet rapporteret, at hypermethylering af E-cadherin blev forbundet med gastrisk cancer og esophageal adenocarcinom [21, 24]. Men der er ingen anden rapport om forholdet mellem Ecadherin methylering og tumorigenese af GCA. I denne undersøgelse viste vi, at hypermethylering af 5'CpG ø i E-cadherin promotoren opstod ofte i GCA væv (68,5%), og at denne methylering ændring var forbundet med reduceret ekspression af E-cadherin-protein. Vore data antydede, at epigenetisk inaktivering af E-cadherin promotoren via hypermethylering kan være en af ​​de kritiske mekanisme til inaktivering af dette gen i GCA. Gene silencing forbundet med hypermethylering medieres af methyl-bindende proteiner, der binder til methylerede cytosiner og rekruttere et kompleks af proteiner, der undertrykker transkription, herunder histondeacetylaser [25].
I vores undersøgelse fandt vi, at i de fleste af tilfældene vi undersøgte, E-cadherin methylering var tumor specifik. dog 10 tilfælde, hvor methylering ændring var til stede i både tumor og parrede normale væv fra den samme patient. I betragtning af følsomheden af ​​indlejrede MSP, er det muligt, at normalt udseende prøver indeholdt en sjælden cancercelle, der var ikke kan påvises ved histomorphology. På grund af den begrænsning af prøven, havde vi ikke studere methylering af E-cadherin i normale Cardia væv. Men normalt esophageal væv ikke vise afvigende E-cadherin methylering i nogle undersøgelser [21] og i tidligere undersøgelser undersøger E-cadherin-methylering i forskellige tumortyper, normale væv fra knoglemarv, bryst, thyroid, og mundslimhinden var umethyleret [ ,,,0],14, 26]. Disse data kraftigt antydet, at E-cadherin promotor-methylering er en afvigende begivenhed. Den kendsgerning, at vi kun detekteret methylering i parrede normale væv fra patienter, hvor den tilsvarende tumor blev også methylerede er konsistent med den hypotese, at canceren hos disse individer er opstået en methyleret klonal precursor. I en undersøgelse af neoplastisk progression i Barretts øsofagus, blev hypermethylering af tumorsuppressorgen p16 detekteret i patologisk normalt udseende prøver taget fra en patient, som senere udviklede dysplasi [27]. Derfor kan epigenetisk inaktivering af tumorsuppressorgener være et tidligt træk ved tumorigenese.
Vores resultater viste, at protein ekspression af Ecadherin i tumorvæv signifikant lavere end den parrede normale væv imidlertid immunhistokemisk farvning viste også normal membranøs farvning af E -cadherin i nogle tumor prøver med E-cadherin methylering. Der er flere mulige årsager til hændelserne. Først Dette var sandsynligvis på grund af det faktum, at immunhistokemisk farvning ikke var så følsom som PCR i detektering subpopulationer af celler med gen methylering og dermed nedregulering af E-cadherin. For det andet kan tumorvæv blande nogle normale væv og kan viste normale membranøs farvning af E-cadherin. Tredje, gen heterogen methylering eller en allel methylering kan være en vigtig årsag. I vores undersøgelser, fandt vi, at methylering status for de tumorvæv, der begge viste positiv proteinekspression og hypermethyleringsassocierede var ufuldstændige Ecadherin methylering. Endvidere er det blevet påvist, at DNA-methylering som undertrykt genekspression primært i transkriptionel niveau og densiteten af ​​CpG ø metylering var relateret til den undertrykte grad af transkription [28]. Dicky promotoren kan undertrykkes fuldstændigt ved lavere densitet methylering, men når promotoren blev styrket ved enhanser, funktion af transkription hentes. I vores undersøgelse fandt vi også positivt mRNA-ekspression i nogle tumorprøver med E-cadherin genet methylerede. Det skyldes til dels det faktum, at omfanget af promotor methylering var insufficent at undertrykke E-cadherin transkription. I alt Vores undersøgelse foreslået, at epigenetisk inaktivering af E-cadherin promotor via hypermethylering kan være en af ​​den mekanisme for inaktivering af E-cadherin i GCA.
Erklæringer
Taksigelser
Vi takker patienter og kontrolpersoner for at deltage i denne undersøgelse.
støttet af tilskud fra den betydelige karakteristiske fag fundament i Hebei-provinsen.

• Klinisk betydning af uPA-systemet i mavekræft med peritoneal metastaser
• Epstein-Barr-virus-specifik methylering af humane gener i gastriske cancerceller