PLoS ONE: Aberrant CCR4 Expression in Tumorinvasion von Lymphknoten-negativen menschlichen Magen Cancer

Abstrakt

Cellular Chemotaxis beteiligt ist, ist die bekannteste Funktion von Chemokin-Rezeptoren, die mit Tumormetastasierung eng miteinander verbunden sind. Tatsächlich positive Expression von Chemokin-Rezeptoren auch selbst ohne metastatischen Tumoren in einigen Patienten identifiziert werden konnte, während die klinische Relevanz dieser Daten nicht vollständig etabliert. Unsere Studien wurden entwickelt, um die CCR4 Expressionsprofile zu klären und seine mögliche Rolle in histologisch node-negative (pN0) Magenkrebs (GC) zu erkunden. Immunhistochemie (IHC) oder immunohistofluorescence (IHF) Analyse wurde an Proben von 108 Patienten mit pN0 GC erhalten durchgeführt. Wir fanden, dass CCR4 war aberrant überexprimiert inpN0 GC Geweben mit unterschiedlichen Expressionsmuster auf Tumorzellen und T-Stufe ( P
= 0,002) zugeordnet ist. Das Matrigel in vitro
Invasionstest zeigte, dass Überexpression von CCR4 in GC-Zelllinien signifikant die invasive Kapazität dieser Zellen verbessert. Ergebnisse von Echtzeit-RT-PCR und gelatinzymography zeigte einen signifikanten Anstieg der Matrix-Metalloproteinase (MMP) -9-Produktion durch die erzwungene Expression von CCR4 in GC-Zelllinien induziert. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die anomale CCR4 Expression bei der Tumorinvasion von pN0 GC beteiligt ist und, möglicherweise, Antagonisten von CCR4 könnte nützlich Kandidaten für die frühe Ereignisse in der Tumorprogression zu steuern

Citation:. Yang Y, Du L, Yang X, Qu A, Zhang X, Zhou C, et al. (2015) Aberrant CCR4 Expression in Tumorinvasion von Lymphknoten-negativen menschlichen Magenkrebs beteiligt. PLoS ONE 10 (3): e0120059. doi: 10.1371 /journal.pone.0120059

Academic Editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, TAIWAN

Empfangen: 29. September 2014; Akzeptiert: 3. Februar 2015; Veröffentlicht: 19. März 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, sofern der Autor und Quelle gutgeschrieben

Datenverfügbarkeit: Die Autoren bestätigen dass ihre Daten sind in der Handschrift und ihre aktuellen Hintergrundinformationen Datei

Finanzierung:. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss Nr 81271916 und 81301506), der Forschungsfonds für das Doktoratsstudium unterstützt von Higher Education of China (Nr 20120131110055), Unabhängige Innovation Gründung der Shandong University (IIFSDU, 2012TS174), der Shandong technologische Entwicklung Project (STDP, 2013GSF11859), der Natural Science Foundation of Shandong (Grant No ZR2013HM104) und der National Key Clinical Medical Specialties Foundation

konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Ähnlich wie bei den meisten Krebsarten, Magenkrebs (GC) ist ein hoch. aggressive maligne Erkrankung, die das umgebende Gewebe einzudringen neigt und auf andere Organe metastasieren. Obwohl Patienten mit node-negative Magenkrebs haben bessere Ergebnisse als die mit Lymphknotenmetastasen [1, 2], von denen einige noch litt an Lokalrezidiven oder Fernmetastasen nach kurativer Resektion [3-5]. Die Identifizierung wirksamer Faktoren oder Schlüsselmoleküle mit Fortschreiten der Krankheit assoziiert in Szene gesetzt node-negative Patienten mit Magenkrebs ist notwendig, unter Berücksichtigung, dass diese Patienten von einer adjuvanten Therapien profitieren könnten.

Chemotaxis spielt eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasen, die Leitung der Motilität von metastatischen Zellen durch Gradienten von Lockstoffe. Bemerkenswert ist, vermitteln die Chemokin-Rezeptoren organspezifische Metastasierung von Tumoren, die durch an den Zielorganen mit der entsprechenden Chemokine interagieren [6]. Magenkrebszellen könnten verschiedene Chemokin-Rezeptoren, wie Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) und Chemokinrezeptor 7 (CCR7) exprimieren, und Co-entscheiden, diese Moleküle für die Metastasierung [7-12]. Andere Rollen von Chemokin-Rezeptoren in der Krebsprogression außer für die Chemotaxis wurden selten aufgedeckt. CCR4, eine C-C-Typ-Chemokin-Rezeptor, wurde zuvor auf seine biologische Funktion in Immunpathogenese von hämatologischen Tumoren konzentriert [13]. Bis heute relativ wenig Aufmerksamkeit wurde bei der Förderung der Metastasierung von einigen soliden Tumoren, einschließlich Magenkrebs [14-17], um die Rolle der CCR4 bezahlt. Unsere Gruppe hat gezeigt, daß die Lymphozyten-rich GCs neigen häufiger positiv für CCR4 zu sein, und fanden eine neue Rolle von CCR4 in tumorinduzierter Immunsuppression [18], die verschiedene Expressionsprofile CCR4 in GC Geweben und multifunktionale Rollen dieses Moleküls in GC Progression.

Es ist allgemein bekannt, dass Invasion der erste Schritt, die zu Krebsmetastasen ist. Beweise haben gezeigt, dass einige Chemokinrezeptoren, wie CXCR4 [19] und CCR7 [20], B-Zell-chronische lymphatische Leukämie Zellinvasion durch Hochregulierung der MMP-9 zu fördern. Kürzlich, Yu et al. zeigten, dass CXCR4 Plattenepithelkarzinom fördern könnte [21] die Zellmigration und Invasion durch Induzieren der Expression von MMP-9 und MMP-13 in oral. Li und Kollegen fanden heraus, dass CCR7 in menschlichen Darmkrebs-Invasion über upregulation von MMP-9 [22] beteiligt war. Es ist nicht klar, aber, ob CCR4 auch Invasion von Krebszellen fördern könnte.

die breite Verteilung von Chemokin-Rezeptoren innerhalb Tumoren andtheir möglichen Rollen bei der Tumorinvasion und Metastasierung gegeben, wir nahmen an, dass pN0 Magenkrebs-Patienten, die bestimmte Chemokine Rezeptoren können die Wahrscheinlichkeit weitere Progression zu erleben. Um unsere Hypothese zu testen, untersuchten wir die Expressionsprofile von CCR4 in Magenkrebszellen von pN0 Patienten und ihre Rolle bei Magenkrebs Zellinvasion.

Materialien und Methoden

Patienten und Proben

Es wurden Gewebeproben von 108 Patienten (75 Männer und 33 Frauen im Alter von 35-71 Jahre, Alter 62 Jahre bedeuten) mit pN0 Magenkrebs unterzogen kurative Resektion des Primärtumors in Qilu Hospital of Shandong University (Jinan, China). Wir verwendeten oben angrenzenden normalen Magen Gewebe und Gewebe von 56 Magen-Dysplasie Patienten (36 Männer und 20 Frauen im Alter von 35-68 Jahre, mittleres Alter 48 Jahre) abgestimmt als Kontrollen. Alle histopathologischen Diagnosen und bösartige Klassifikationen wurden von erfahrenen Pathologen zum Zeitpunkt der Diagnose bestimmt, nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation Internationale Histologische Klassifikation der Tumoren [23], und die postoperativen pathologischen Inszenierung wurde bestimmt auf der Grundlage der Internationalen Union gegen Krebs (UICC) [24 ]. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Qilu Krankenhaus genehmigt, und eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Patienten wurde ebenfalls erhalten.

Immunhistochemie und immunohistofluorescence

IHC oder IHF wurde auf Paraffinschnitten durchgeführt Antikörper gegen die menschliche Verwendung CCR4 (LS-A351; LifeSpanBioSciences, Seattle, WA, USA) und Anti-pan Cytokeratin (CK) Antikörper (ab80826; Abcam, Cambridge, MA, USA), im Anschluss an die von jedem Hersteller bereitgestellten Anweisungen. Fluoreszierende Antikörper schließen Ziege Anti-Kaninchen-TRITC-konjugierten Antikörper (E031320; Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, China), Ziege-anti-Maus-FITC-konjugierte Antikörper (E0312400; Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, China). Die Proben wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht und beobachtet (IX81, Olympus, Tokyo, Japan) und die IHC Ergebnisse wurden wie bereits berichtet analysiert [18]

Zellkultur

Der menschliche Magen. Krebszelllinien SGC-7901 und BGC-823 wurden aus der Kultursammlung der chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) und gehalten in RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, USA) mit 10% FBS (Gibco ergänzt erworben haben, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bei 37 ℃ in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO _2.

Transient über~~POS=TRUNC von CCR4 in SGC-7901 und BGC-823 Zellen

transient Transfektion des Plasmids EGFP-CCR4 (CCR4) oder einem EGFP-Expressionsvektor (MOCK) in Magenzelllinien wurde unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wie zuvor beschrieben [18] durchgeführt. Und die Transfektionseffizienzen wurden durch Fluoreszenzmikroskop bestimmt, Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und Durchflusszytometrie (FCM), respectively.

Quantifizierung von mRNA durch RT-PCR und Echtzeit-RT -PCR

die Gesamt-RNA wurde aus Zellen isoliert, Trizolreagenz mit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und Transkriptase Reaktionen Reverse wurden mit Kit durchgeführt gemäß dem Protokoll des Herstellers (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland ). Für RT-PCR wurden die Primer und die PCR-Bedingungen zur Amplifikation von CCR4 verwendet, wie zuvor beschrieben [25]. Und die menschliche Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (Vorwärts-Primer, 5'-GGTGGTCTC-CTCTGACTTCAACAG-3 '; Reverse-Primer, 5'-GTTGTTGTAGCCA-AATTCGTTGT-3') usedas interner Standard war. Für Echtzeit-RT-PCR, Primer für CCR4, MMP-9 und GAPDH und Amplifikationsbedingungen verwendet wurden, wie früher berichtet [18, 25, 26].

FCM-Analyse

Die Zellen wurden geerntet inkubiert mit einem Phycoerythrin (PE) -konjugierten anti-CCR4 monoklonaler Antikörper (FAB1567P, R & D Systems) oder mit einer Maus IgG2b-Isotyp-Kontrolle PE (IC0041P, R & D Systems) gemß den Anweisungen des Herstellers. FCM-Analyse wurde dann ein FACSCalibur durchgeführt (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) CCR4 Ausdruck auf SGC-7901 und BGC-823 Zellen zu analysieren sind.

Matrigel Invasion Assays

Das in-vitro-
Invasionstest wurde unter Verwendung der 24 Zellkultur-Einsätze mit 8-um-Membranen (BD Biosciences, San Jose, CA) durchgeführt. Jede Membran wurde mit Matrigel beschichtet (30 &mgr; g, Becton Dickinson, San Jose, CA) und für 30 Minuten inkubiert. Dann wurden 0,2 ml transfiziert oder Eltern GC-Zellen wurden in serumfreiem RPMI-1640 mit einer Konzentration von 1,5 × 10 resuspendiert ^{5 /ml und in der oberen Kammer angeordnet ist, und 0,6 ml RPMI-1640-Medium mit 10% FBS wurde zur basolateralen Kammer hinzugefügt. Nach 24 h Inkubation bei 37 ℃ mit 5% CO _{2 wurden die Zellen fixiert und mit 0,2% Eosin Y. Die Anzahl der Zellen gefärbt, die an der basalen Seite der Membran gewandert waren, wurde bei 200 × unter einem Lichtmikroskop quantifiziert Vergrößerung.}}

Zelllebensfähigkeitstest

Die Zellen in 96-Well-Platten bei 5 x 10 ^{3 Zellen /Vertiefung und kultiviert angegebenen Zeitpunkten ausgesät. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit CCK8 (Beyotime, Haimen, China) nach den Anweisungen des Herstellers beurteilt. Die Extinktion wurde bei 450 nm Wellenlänge gemessen. Jeder Zeitpunkt wurde in drei Vertiefungen wiederholt, und der Test wurde dreimal independentlyperformed.}

Gelatin Zymographie

Die Überstände durch Zentrifugation gesammelt wurden nach 24 h nach der Transfektion und auf einem SDS-PAGE Gel aufgetrennt, enthaltend 0,1% (w /v) Gelatine. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine ​​durch Waschen des Gels zweimal für 40 min in 2,5% Triton X-100, gefolgt von einer Inkubation für 18 Stunden bei 37 ° C in einer Mischung, enthaltend Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), CaCl _{2 5mMm und NaCl 200 mM. Dann wurde das Gel kurz in destilliertem Wasser und gefärbt mit 0,25% Coomassie Brilliant Blue R250 /45% Methanol /10% Essigsäure für 4 h gespült und dann in 45% Methanol, 8% Essigsäure entfärbt. Die Gele wurden dann mit Kodark Systeme gescannt und fotografiert.}

Statistical analysis

Daten von wenigstens drei unabhängigen Experimenten wurden analysiert und als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die Beziehung zwischen CCR4 Expression und T-Phase wurde von Chi-Quadrat-Test analysiert. Weitere Daten wurden durch den Student-t-Test oder ANOVA soweit angemessen analysiert. A P
-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Analysen wurden mit Hilfe statistischer Software (Version 13.0, SPSS, Inc., Chicago, IL) durchgeführt.

Ergebnisse |

Die Überexpression von CCR4 mit unterschiedlichen Expressionsmuster in pN0 Magenfrühkarzinomen Gewebe

CCR4 Expression in Krebszellen wurde in wechselnden Anteilen nachgewiesen. Unter 108 in Paraffin eingebetteten Gewebe, 29 Fälle (26,9%) zeigten negativen Ausdruck (-), 30 Fälle (27,8%) zeigten eine schwache Expression (+), 35 Fälle (32,4%) zeigten eine mäßige Expression (++) und 14 Fälle (13,0%) zeigten eine starke Expression (+++) (Abb. 1A-D). Alle angrenzenden normalen Magen Gewebe zeigte eine negative Färbung für CCR4, und nur 2 (3,6%) Fälle von Magen-Dysplasie zeigten eine schwache Expression von Membran CCR4 (Abb. 1E und F).

Sowohl Membran und Zytoplasma Expression von CCR4 waren beobachtet am häufigsten in gut differenzierten Tumornester intestinalen Typ, während die weniger differenzierten Zellen, die einen cytoplasmatischen Muster von CCR4 Expression in diffuser Art Magenkrebs (Fig. 2) anzuzeigen neigten. Ein interessantes Phänomen war, dass die Zellen mit hochinvasiven Potential, wie Muskelinvasion, vaskuläre Penetration und Nerven Invasion, auch eine zytoplasmatische CCR4 Expressionsmuster (Abb. 3).

CCR4 Überexpression fördert Magenkrebszellen Invasion

auf typische Abschnitte, es wurde auch gezeigt, dass die Expression von CCR4 mit der Tiefe der Tumorinvasion (Abb. 3) zu erhöhen neigten. Die IHC-Analyse zeigte deutlich, dass die Überexpression von CCR4 positiv mit der T-Stufe verbunden war ( P
= 0,002), Gefäßinvasion ( P
= 0,001) und perineuralen Invasion (P = 0,002) in pN0 GC (Tabelle 1).

Wir haben berichtet, dass die Konzentrationen von CCR4 Protein in einigen Magenzelllinien ziemlich niedrig waren [18] und damit weitere Einblicke in CCR4-vermittelte Tumorinvasion zu bekommen, über Expression von CCR4 in Magen-Zelllinien durchgeführt wurde, wie wir vorher [18] beschrieben. Hohe Transfektionseffizienzen wurden durch Echtzeit-RT-PCR, FCM und Fluoreszenzmikroskopie bestimmt, jeweils (Fig. 4A-C). Die EGFP wurde in den Zellkern, Zytoplasma und Membran der Vektorkontrollzellen ausgedrückt, die mit dem MOCK Plasmid transfiziert wurden; und das fluoreszierende Fusionsprotein wurde auf dem Cytoplasma und Membran der CCR4-Plasmid transfizierten Zellen lokalisiert. Matrigel Invasionstest zeigte, dass die Anzahl der EGFP-CCR4-transfizierten Zellen Magenkrebs durch das Matrigel vorbei waren signifikant höher als die der Schein transfizierten Magenkrebszellen (Fig. 4D). Der CCK8 Test zeigte an, dass die Überexpression von CCR4 hatte keinen Einfluss auf die Magenkrebszellproliferation (S1) Abb.

CCR4-regulierten MMP-9-Produktion in Magenkrebszellen

, um die möglichen Mechanismen zu testen zugrunde liegenden CCR4-vermittelte Tumorinvasion, untersuchten wir die Wirkung von CCR4 auf MMP-9 Expression und Aktivität. Echtzeit-RT-PCR-Analyse (Fig. 5A) zeigte, dass EGFP-CCR4-transfizierten Magenkrebszellen exprimierten höhere Mengen an MMP-9-mRNA im Vergleich zu scheintransfizierten Zellen bei 24 Stunden nach der Transfektion. Gelatine-Zymographie-Analyse (Fig. 5B) zeigte, dass die Sekretion und die Aktivität von MMP-9 signifikant hochreguliert in den Überständen von EGFP-CCR4-transfizierten Zellen im Vergleich mit MOCK-transfizierten Zellen bei 48 Stunden nach der Transfektion mit oder ohne Zusatz von exogenen CCL22.

Diskussion

Die Wechselwirkungen zwischen Chemokinrezeptoren von Krebszellen und ihre passenden Chemokine stellen wichtige Schritte in der Tumormetastasierung. Allerdings studyshowed die Ergebnisse unserer aktuellen, dass eine bestimmte Anzahl von Patienten mit Magenkrebs ohne lymphatischen Metastasierung für CCR4 Färbung auch positiv waren. Anders als die meisten früheren Studien über Funktionen von einigen Chemokin-Rezeptoren vermittelt Chemotaxis, ergab diese Forschung eine neuartige, invasive Verhalten von CCR4.

Chemokin-Rezeptoren gehören zu einer Familie von Sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Membran Proteine ​​und die funktionellen Konsequenzen der Chemokin-Rezeptoraktivität sind im allgemeinen durch extrazelluläre Liganden [27] hängen von Stimulations angenommen. Jedoch zeigten die histologischen Proben der vorliegenden Studie, dass es für CCR4 unterschiedliche Expressionsmuster waren. CCR4 in nicht-neoplastischen Zellen zeigten eine negative Färbung, mit nur schwachen Membranfärbung bei Magen-Dysplasie Läsionen. Membran- und Cytoplasma-Expression von CCR4 am häufigsten in den gemäßigten schien gut differenzierte Tumornester, während die Expression in weniger differenzierten Zellen eher in das Zytoplasma in erster Linie beschränkt werden. Und mehr intriguingly, wie auf typische Abschnitte gezeigt, Tumorzellen hoch invasive Kapazitäten, wie Muskelinvasion, vaskuläre Penetration und Nerven Invasion aufweisen, zeigten häufig eine erhöhte zytoplasmatische Expression von CCR4. Unsere Ergebnisse zeigten eine enge Verbindung zwischen zytoplasmatischen CCR4 Expressionsmuster und aggressives Verhalten von Magenkrebszellen. Dieser Befund steht im Gegensatz zur allgemeinen Annahme, dass die extrazelluläre Domäne eines Chemokinrezeptors notwendigerweise in Tumormetastasierung durch die Interaktion mit seinen Liganden erforderlich ist. Ähnliche Phänomene wurden mit dem Chemokinrezeptor CXCR4, dessen Kernlokalisations beobachtet mit dem Fortschreiten von verschiedenen Tumoren assoziiert war [28-30]. Diese Daten indictate, dass die Magenkrebszellen könnte in der Nähe Gewebe über CCR4 in einem Liganden-unabhängigen Weg einzudringen. Die andere Hypothese war, dass die CCR4 Internalisierung durch seinen Liganden verursacht möglicherweise einen Mechanismus darstellen, die in der zytoplasmatischen CCR4 Expressionsmuster entwickelt hat. CCL22, die CCR4 Ligand durch menschliche Magenkrebsgewebe produziert [31], wird auch causeCCR4 Internalisierung von Membran zu Zytoplasma bekannt [32, 33], zytoplasmatische Färbung darauf hindeutet, könnte zeigen aktivierte Signal folgende CCR4-CCL22 Ligatur. Weitere Studien sind notwendig, um die genauen Mechanismen aufzudecken, diese abnormale Muster von Chemokin-Rezeptor-Expression bei der Tumorprogression beteiligt zu Grunde liegen. Darüber hinaus schlug die langsam verstärkend Expression von CCR4 in präkanzerösen Gewebe, obwohl statistisch unwesentlich höher als im Tumor benachbarten normalen Geweben, dass CCR4 auch in den präneoplastischen Stadien der frühen Tumorentwicklung teilnehmen könnten.

In unserem vorherigen Studie fanden wir, dass CCR4 wurde im GC Gewebe überexprimiert, aber wir konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten mit und ohne Lymphknotenmetastasen [18] zu finden. Daher nahmen wir an, dass die Chemokin-Rezeptoren könnten auch eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung von pN0 Patienten spielen. In der vorliegenden Studie zeigten unsere Ergebnisse eine positive Korrelation zwischen CCR4 Expression und T-Phase, die mit unseren Immunhistochemie Ergebnisse stehen im Einklang waren, dass CCR4 Ausdruck als die Tiefe der Tumorinvasion fortgeschritten zu erhöhen neigten. Die Wirkung von CCR4 auf Magen-Invasion von Krebszellen wurde von Transwell Zellinvasion Assays teilweise bestätigt. Diese Tests wurden unter Bedingungen durchgeführt, in denen keine exogenen CCR4 Rezeptor-Ligand zugesetzt wurde. Es war möglich, dass unterschiedliche Mechanismen existieren können durch CCR4 in einem Liganden-unabhängigen Weise in Einklang mit dem Phänomen der cytoplasmatischen Muster von CCR4 vermittelten Tumorzellinvasion zu regulieren, die auf die hoch invasive Verhalten von Tumorzellen in GC Gewebe verwandt war. Wir haben bestätigt, dass die Überexpression von CCR4 eng mit einem höheren Grad an Tumorinvasivität assoziiert war, was anzeigt, daß CCR4 Überexpression könnte metastatischen Potential in GC-Zellen verleihen und weitere Tumorprogression fördern. Wir stellten die Hypothese auch, dass die autokrine CCR4 Liganden auch in der Zellbeweglichkeit beteiligt waren In-vitro-
. Die Konzentrationen von CCL22 in den Kulturüberstand GC-Zelllinien, transfiziert mit oder ohne CCR4 waren sehr gering, wie wir (Daten nicht dargestellt) ausgewertet. Jedoch könnte die Möglichkeit nicht, dass der autokrinen oder parakrinen Produktion von CCL22, um Tumorinvasion durch CCL22 /CCR4 Achse in vivo
beitragen könnten ausgeschlossen werden. CCL17 und CCL22, als eine hohe Affinität CCR4 Liganden werden durch GC und andere Krebsgewebe produziert. Insbesondere CCL22, die entweder durch Krebszellen oder Tumor-assoziierte Makrophagen produziert wird, wurde berichtet, in der Metastasierung von verschiedenen Krebsarten [15-17] beteiligt. Dies deutet auf eine mögliche autokrine /parakrine Schleife beteiligt CCL22 und CCR4 zwischen verschiedenen Zelltypen.

MMP-2 und MMP-9 sind die am meisten betroffen und gut charakterisierte MMPs mit starken proteolytischen Aktivität in der extrazellulären Matrix (ECM). Die Konsistenz zwischen Echtzeit-RT-PCR-Tests und Gelatinzymographie Experimente zeigten eindeutig, dass die Überexpression von CCR4 in Magenkrebszellen deutlich MMP-9-Expression und Aktivität erhöht. Diese Experimente weiter hervorgehoben und zeigte seine tatsächliche Rolle bei der Tumorinvasion unter bestimmten Bedingungen mit oder ohne Stimulation durch exogene CCL22. Es wird angenommen, dass Matrix MMP-9-Typ-IV-Kollagen abbaut, die ein Hauptbestandteil der Basalmembran und ist an Krebszellinvasion und Metastasierung bei Patienten mit Magenkrebs [34] bezogen. Hier stellen wir zur Verfügung gestellt neue Hinweise auf den zugrunde liegenden Mechanismus, der CCR4 Magenkrebs Zellinvasion durch Hochregulation von MMP-9 fördern könnten. Ähnliche Beobachtungen wurden in bezug auf Tumorinvasion über einige Chemokinrezeptoren wie CXCR4 und CCR7 [19, 20, 22] hergestellt ebenfalls worden. Und MMP-2, dessen Struktur an MMP-9 ähnlich war, wurde ebenfalls mit Magenkrebs [35] zugeordnet gemeldet werden. Wir fanden jedoch, MMP-9, jedoch nicht MMP-2, war ein Schlüsselmolekül CCR4-vermittelte Tumorinvasion beteiligt, die aufgrund unterschiedlicher Co-Regulatoren sein, die mit CCR4 in verschiedenen Mikroumgebung interagieren. Obwohl MMP-2 Expression in den Magenkrebszellen CCR4-transfizierten schien in scheintransfizierten Zellen als höher zu sein, war der Unterschied statistisch nicht signifikant (Daten nicht gezeigt). Zelllebensfähigkeitstest zeigte, dass die Überexpression von CCR4 auf der Magenkrebs-Zellwachstum hatte keine Wirkung in vitro
, was mit früheren Studien übereinstimmte, die CCR4 Liganden zeigte, konnte die Zellproliferation nicht induzieren [14], vermeidet so die möglicherweise das kann Invasion Index oder MMP-9 Menge beeinflussen. Diese Assays wurden mit oder ohne exogene CCL22, mit signifikanten Unterschieden in MMP-9 Expression zwischen CCR4 und MOCK transfizierten Zellen durchgeführt. Wir spekulieren, die möglichen Mechanismen der verstärkten MMP-9-Expression durch CCR4-Überexpression könnte auf die autokrine oder parakrine Expression von CCL22 teilweise fällig in vivo
. Noch andere MMPs, die in diesem Prozess beteiligt sein könnten und die genauen Signalwege blieben in der Zukunft weiter erforscht werden.

Abschließend berichteten wir zum ersten Mal, dass CCR4 anomal war in pN0 Magenkrebs überexprimiert und könnte Tumorinvasion fördern. Weiterhin angegeben unsere Daten, dass CCR4-induzierte MMP-9 Produktion könnte zumindest teilweise den neuen Mechanismus für CCR4-vermittelte Tumorinvasion zugrunde liegen. So Antagonisten von CCR4 könnte nützlich Kandidaten für die frühe Ereignisse in der Tumorprogression zu steuern.

Grundinformationen
S1 Abb. Überexpression von CCR4 hatte keine Wirkung auf die Magen-Krebszellwachstum in vitro
.
Nach Transfektion mit CCR4 oder MOCK Plasmid und Stimulation mit oder ohne exogene CCL22, SGC-7901 und BGC-823-Zellen wurden in reseeded 96-Well-Platte. Die Zellen-Lebensfähigkeit wurde durch CCK8 Assay zu den angegebenen Zeitpunkten bewertet
doi:. 10.1371 /journal.pone.0120059.s001
(TIF)

• PLoS ONE: Die Überexpression von eukaryotischen Translation Initiation Factor 5A2 (EIF5A2) korreliert mit einer Zelle Aggressivität und Schlechte Überleben in der Magenkrebs
• PLoS ONE: Überleben von Proper Leberarterie Lymphknotenmetastase bei Patienten mit Magenkarzinom: Auswirkungen für die D2 Lymphadenektomie