PLOS ONE: aberrante Expressão CCR4 está envolvido na invasão tumoral do Linfonodo-Negativas Humano gástrica Cancer

Abstract

quimiotaxia celular é a função mais conhecida de receptores de quimiocinas, que estão intimamente ligados com a metástase do tumor. Na verdade, a expressão positiva de receptores de quimiocinas também pode ser identificado até mesmo em alguns pacientes sem tumores metastáticos, enquanto a relevância clínica destes dados não foi totalmente estabelecido. Nossos estudos foram desenhados para esclarecer os perfis de expressão CCR4 e explorar seu potencial papel no câncer histologicamente linfonodos negativos (pN0) gástrica (GC). A imuno-histoquímica (IHC) ou análise immunohistofluorescence (IHF) foi realizada sobre as amostras obtidas a partir de 108 pacientes com pN0 GC. Descobrimos que R4CC foi sobre-expresso de forma aberrante tecidos inpN0 GC, com diferentes padrões de expressão em células de tumor e sendo associada com t-fase ( P
= 0,002). O Matrigel In vitro
ensaio de invasão revelou que a sobre-expressão de R4CC em linhas celulares de GC melhorou significativamente a capacidade invasiva de células destes. Os resultados de tempo real de RT-PCR e gelatinzymography mostrou um aumento significativo da metaloproteinase da matriz (MMP) -9 produção induzida pela expressão forçada de R4CC em linhas celulares de GC. Os nossos dados sugerem que a expressão aberrante R4CC está envolvido na invasão tumoral de pN0 GC e, concebivelmente, antagonistas de CCR4 podem ser candidatos úteis para o controlo de eventos precoces na progressão do tumor

citação:. Yang Y, Du G, Yang X, Qu A, Zhang X, C, Zhou, et al. (2015) Expressão CCR4 aberrante está envolvida na invasão tumoral do Linfonodo-negativo câncer gástrico humano. PLoS ONE 10 (3): e0120059. doi: 10.1371 /journal.pone.0120059

Editor do Academic: Chih-Hsin Tang, China Medical University, TAIWAN

Recebido: 29 de setembro de 2014; Aceito: 03 de fevereiro de 2015; Publicação: 19 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Os autores confirmam que os seus dados estão dentro do manuscrito e sua atual arquivo de Informações de Suporte

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela National Science Foundation Natural da China (Grant nos 81271916 e 81301506), o Fundo de Investigação para o Programa de Doutorado da Ensino superior da China (No. 20120131110055), Fundação de inovação independente da Universidade de Shandong (IIFSDU, 2012TS174), o Projeto de Desenvolvimento Tecnológico Shandong (STDP, 2013GSF11859), a Fundação de Ciência Natural de Shandong (Grant No. ZR2013HM104) eo Key National Clinical Medical Specialties Fundação

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Assim como a maioria dos cânceres, o câncer gástrico (CG) é um altamente. malignidade agressiva que tende a invadir o tecido circundante e metástases para órgãos distantes. Embora os pacientes com câncer gástrico linfonodos negativos têm melhores resultados do que aqueles com metástases nodais [1, 2], alguns dos quais ainda sofria de recorrência local ou metástases à distância após a ressecção curativa [3-5]. Identificação de fatores eficazes ou moléculas-chave que associam com a progressão da doença em pacientes com câncer gástrico linfonodos negativos encenadas é necessário, tendo em vista que esses pacientes podem se beneficiar de terapias adjuvantes.

Quimiotaxia desempenha um papel-chave na metástase do tumor, orientando a motilidade células metastáticas através de gradientes de quimioatractores. Notavelmente, os receptores de quimiocinas mediar metástase específico do órgão de tumores através da interacção com os seus correspondentes quimiocinas nos órgãos-alvo [6]. células cancerosas gástricas poderia expressar vários receptores de quimiocinas, tais como receptor de quimiocinas 4 (CXCR4) e receptor de quimiocinas 7 (CCR7) e cooptar essas moléculas para a metástase [7-12]. Outros papéis de receptores de quimiocinas na progressão do câncer, exceto para a quimiotaxia raramente têm sido descobertos. CCR4, um receptor do tipo quimiocina C-C, anteriormente tem sido focada na sua função biológica na imunopatogénese de tumores hematológicos [13]. Até à data, relativamente pouca atenção tem sido dada ao papel de CCR4 na promoção da metástase de alguns tumores sólidos, incluindo câncer gástrico [14-17]. O nosso grupo demonstrou que os GC-rich linfócitos tendem a ser mais frequentemente positiva para CCR4, e encontraram um novo papel de CCR4 na imunossupressão induzida por tumores [18], indicando vários perfis de expressão de R4CC nos tecidos GC e papéis multifuncionais desta molécula na progressão da GC.

é bem conhecido que a invasão é o primeiro passo que leva à metástase do cancro. Evidências mostraram que alguns receptores de quimiocina, tal como CXCR4 [19] e CCR7 [20], promover a invasão de células de leucemia linfocítica crónica de células B através da sobre-regulação da MMP-9. Recentemente, Yu et al. mostrou que CXCR4 poderia promover a migração e invasão celular através da indução da expressão de MMP-9 e MMP-13 no carcinoma espinocelular oral [21]. Li e colegas descobriram que CCR7 estava envolvido na invasão do cancro do cólon humano através de regulação positiva de MMP-9 [22]. Não está claro, porém, se CCR4 também poderia promover a invasão da célula cancerosa.

Dada a ampla distribuição de receptores de quimiocinas dentro tumores andtheir potenciais papéis na invasão tumoral e metástase, a hipótese de que pN0 pacientes com câncer gástrico que transportam determinadas quimiocinas Os receptores podem ser mais propensos a experimentar uma maior progressão. Para testar a nossa hipótese, investigamos os perfis de CCR4 expressão em células cancerosas gástricas de pacientes pN0 e seu papel na invasão de células de câncer gástrico.

Materiais e Métodos

Pacientes e espécimes

as amostras de tecido foram obtidas de 108 pacientes (75 homens e 33 mulheres, com idades entre 35-71 anos, idade média de 62 anos) com cancro gástrico pN0 submetidos à ressecção curativa do tumor primário na Qilu Hospital da Universidade de Shandong (Jinan, China). Que usamos anteriormente combinado tecidos do estômago normais adjacentes e tecidos de 56 pacientes gástricas displasia (36 homens e 20 mulheres, com idades entre 35-68 anos, com idade média de 48 anos), como controles. Todos os diagnósticos histopatológicos e classificações malignos foram determinados por patologistas seniores no momento do diagnóstico, de acordo com a Organização Mundial de Saúde Internacional histológica classificação dos tumores [23], eo estadiamento patológico pós-operatória foi determinado com base no União Internacional Contra o Câncer (UICC) [24 ]. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Qilu Hospital de Ética e consentimento informado por escrito de todos os pacientes foi também obtida.

A imuno-histoquímica e immunohistofluorescence

IHC ou IHF foi realizada em cortes de parafina utilizando anticorpos contra humanos CCR4 (LS-A351; LifeSpanBioSciences, Seattle, WA, EUA) e Anti-pan Cytokeratin anticorpo (CK) (ab80826; Abcam, Cambridge, MA, EUA), seguindo as instruções fornecidas por cada fabricante. anticorpos fluorescentes incluem anticorpos de cabra anti-coelho TRITC conjugada (E031320; Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, China), cabra anti-rato anticorpos conjugados com FITC (E0312400; Amyjet Scientific, Inc. Wuhan, China). As amostras foram visualizados e observado sob um microscópio de fluorescência (IX81; Olympus, Tóquio, Japão), e os resultados IHC foram analisados ​​conforme relatado anteriormente [18]

cultura celular

O gástrica humana. linhas celulares de cancro SGC-7901 e BGC-823 foram comprados na Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e mantidas em RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, EUA) suplementado com 10% FBS (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a 37 ℃ numa atmosfera humidificada de 5% de CO _2.

transiente sobre-expressão de CCR4 no SGC-7901 e células BGC-823

transitoriamente transf ecção do plasmídeo EGFP-CCR4 (CCR4) ou um vector de expressão EGFP (MOCK) em linhas de células gástricas foi efectuada utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) como descrito anteriormente [18]. E as eficiências de transfecção foram determinados por microscópio de fluorescência, em tempo real, reacção em cadeia com transcrição reversa da polimerase (RT-PCR) e citometria de fluxo (FCM), respectivamente.

A quantificação de ARNm por RT-PCR em tempo real e RT -PCR

o ARN total foi isolado a partir de células, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e inverso de transcriptase reacções foram realizadas com o kit de acordo com o protocolo do fabricante (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemanha ). Para RT-PCR, os iniciadores e condições de PCR para amplificação de CCR4, foram usados ​​como descrito anteriormente [25]. E humana gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (iniciador em sentido directo, 5'-GGTGGTCTC-CTCTGACTTCAACAG-3 '; iniciador reverso, 5'-GTTGTTGTAGCCA-AATTCGTTGT-3') foi usedas um padrão interno. Para tempo real de RT-PCR, foram utilizados iniciadores para o R4CC, MMP-9 e GAPDH e condições de amplificação como descrito anteriormente [18, 25, 26].

FCM análise

As células foram colhidas incubadas com ficoeritrina (PE) -conjugated anticorpo anti-R4CC monoclonal (FAB1567P, R & D Systems) ou com uma IgG2b de ratinho-PE de controlo de isotipo (IC0041P, R & D Systems) de acordo com as instruções do fabricante. análise de FCM foi então levada a cabo usando um FACSCalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha) para analisar a expressão CCR4 em células SGC-7901 e BGC-823, respectivamente.

ensaios de invasão Matrigel

O in vitro
ensaio de invasão foi realizada usando as inserções de cultura de 24 células com membranas 8 mícrons (BD Biosciences, San Jose, CA). Cada membrana foi revestida com Matrigel (30 mg, Becton Dickinson, San José, CA) e incubadas durante 30 min. Em seguida, 0,2 ml transfectadas ou células GC parentais foram ressuspensas em isento de soro RPMI-1640 com uma concentração de 1,5 × 10 ^{5 /mL e colocado na câmara superior, e 0,6 ml de RPMI-1640 contendo 10% de FBS foi adicionada à câmara basolateral. Após 24 h de incubação a 37 ℃ com 5% de CO _{2, as células foram fixadas e coradas com 0,2% de eosina Y. O número de células que tinham migrado para o lado basal da membrana foi quantificada sob um microscópio de luz a 200 × ampliação.}}

a viabilidade celular ensaio

As células foram semeadas em placas de 96 poços a 5 x 10 ^{3 células /poço e cultivadas durante pontos de tempo indicados. A viabilidade celular foi avaliada utilizando CCK8 (Beyotime, Haimen, China) seguindo as instruções do fabricante. A absorvância foi medida a 450 nm de comprimento de onda. Cada ponto de tempo foi repetida em três poços e o ensaio foi independentlyperformed por três vezes.}

Gelatina zimografia

Os sobrenadantes foram recolhidos por centrifugação após 24 h pós-transfecção e resolvidas num gel de SDS-PAGE contendo 0,1% (w /v) de gelatina. Após a electroforese, as proteínas foram renaturadas por lavagem o gel duas vezes, durante 40 min em 2,5% de Triton X-100 seguido de uma incubação durante 18 horas a 37 ° C numa mistura contendo Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), CaCl _{2 5mMm e NaCl 200 mM. Em seguida, o gel foi brevemente enxaguadas em água destilada e coradas com 0,25% de ácido acético com Coomassie Brilliant Blue R250 /45% de metanol /10% durante 4 h e em seguida descoradas em 45% metanol, 8% de ácido acético. Os géis foram então digitalizados e fotografado com sistemas Kodark.}

A análise estatística

Os dados de pelo menos três experiências independentes foram analisados ​​e expressos como a média ± SD. A relação entre a expressão CCR4 e T-estágio foi analisada pelo teste do qui-quadrado. Outros dados foram analisados ​​pelo teste t de Student ou ANOVA, sempre que necessário. A valor P
inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises foram feitas usando o software estatístico (versões 13.0, SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultados

Sobre-expressão de CCR4 com padrões de expressão distintos em pN0 início de tecidos de câncer gástrico

expressão CCR4 em células de câncer foi detectado em níveis variáveis. Entre 108 tecidos embebidos em parafina, 29 casos (26,9%) apresentaram expressão negativa (-), 30 casos (27,8%) mostraram expressão fraca (+), 35 casos (32,4%) mostraram expressão moderada (++), e 14 casos (13,0%) mostraram forte expressão (+++) (Fig. 1A-D). Todos os tecidos normais do estômago adjacentes apresentaram coloração negativa para CCR4, e apenas 2 (3,6%) casos de displasia gástrica mostrou fraca expressão de CCR4 de membrana (Fig. 1E e F).

Ambos membrana e citoplasma de expressão foram R4CC observados com maior frequência em ninhos tumorais bem diferenciados do tipo intestinal, enquanto as células menos diferenciadas tendem a exibir um padrão citoplasmático de expressão CCR4 no câncer gástrico tipo difuso (Fig. 2). Um fenômeno interessante foi que as células com potencial altamente invasivo, como a invasão muscular, a penetração da invasão vascular e nervosa, também mostrou um padrão de expressão CCR4 citoplasmática (Fig. 3).

CCR4 sobre-expressão promove célula de câncer gástrico invasão

em troços típicos, foi também demonstrado que o nível de expressão de CCR4 tendia a aumentar com a profundidade de invasão do tumor (Fig. 3). A análise IHC mostraram claramente que a sobre-expressão de CCR4 foi associado positivamente com o estádio T ( P
= 0,002), invasão vascular ( P
= 0,001) e invasão perineural (P = 0,002) em pN0 GC (Tabela 1).

Nós relataram que os níveis de proteína CCR4 foram bastante baixas em algumas linhas de células gástricas [18] e, portanto, para obter novas perspectivas na invasão tumoral mediada por CCR4, sobre- expressão de R4CC em linhas de células gástricas foi realizada como previamente descrito [18]. eficiências de transfecção elevadas foram determinadas pelo tempo real de RT-PCR, FCM e microscopia de fluorescência, respectivamente (Fig. 4A-C). A EGFP foi expresso no núcleo, citoplasma e membrana das células de controlo do vector, que foram transfectadas com o plasmídeo MOCK; e a proteína de fusão fluorescente foi localizada no citoplasma e na membrana das células transfectadas plasmídeo CCR4. ensaio de invasão de Matrigel mostraram que os números de células gástricas cancerosas EGFP-transfectado-CCR4 que passam através do Matrigel foram significativamente mais elevados do que aqueles das células transfectadas por simulação gástricas cancerosas (Fig. 4D). O ensaio CCK8 indicou que a sobre-expressão de CCR4, não teve nenhum efeito sobre a proliferação de células de cancro gástrico (Fig S1).

regulada-R4CC MMP-9 a produção em células de cancro gástrico

Para testar os possíveis mecanismos subjacentes invasão tumoral mediada por CCR4, avaliou-se o efeito de CCR4 na MMP-9 expressão e atividade. A análise em tempo real de RT-PCR (Fig. 5A) mostrou que as células de cancro gástrico EGFP-transfectadas com CCR4 expressa níveis mais elevados de ARNm de MMP-9 em comparação com células falsamente transf ectadas a 24 horas após a transfecção. análise Gelatina zimografia (Fig. 5B) revelou que a secreção e a actividade de MMP-9 foi significativamente regulada para cima nos sobrenadantes das células de EGFP-transfectadas com R4CC em comparação com células falsamente transf ectadas a 48 h após a transfecção, com ou sem a adição de CCL22 exógena.

Discussão

As interações entre receptores de quimiocinas de células cancerosas e suas quimiocinas correspondentes representam passos importantes na metástase do tumor. No entanto, os resultados do nosso atual studyshowed que um certo número de pacientes com câncer gástrico sem metástase linfática também foram positivos para a coloração CCR4. Ao contrário a maioria dos estudos anteriores sobre as funções de quimiotaxia mediada por alguns receptores de quimiocina, esta pesquisa revelou um romance, comportamento invasivo de CCR4.

Os receptores de quimiocinas pertence a uma família de receptores acoplados à proteína G de sete-transmembranares que são membrana proteínas, e as consequências funcionais da actividade do receptor de quimioquina são geralmente acredita-se depender de estimulação por ligandos extracelulares [27]. No entanto, as amostras histológicas do presente estudo mostraram que houve padrões de expressão distintos para CCR4. R4CC em células não neoplásicas exibiram coloração negativa, com apenas fraca coloração da membrana em lesões gástricas displasia. Membrana e expressão citoplasmática de CCR4 mais frequentemente apareceu em moderada a ninhos tumorais bem diferenciados, enquanto expressão em células menos diferenciadas tendiam a ser confinado principalmente para o citoplasma. E mais intrigante, como mostrado nas secções típicas, as células tumorais que apresentam capacidades invasivas altas, tais como invasão do músculo, a penetração da invasão vascular e nervo, frequentemente apresentaram uma expressão citoplasmática aumentado de CCR4. Nossos dados indicam uma estreita ligação entre o padrão de expressão CCR4 citoplasmática e comportamentos agressivos de células cancerosas gástricas. Esta descoberta é contrária ao pressuposto comum que o domínio extracelular de um receptor de quimiocina é necessariamente obrigatório na metástase tumoral, através da interacção com o seu ligando. Fenómenos semelhantes foram observados com o receptor de quimioquinas CXCR4, cuja localização nuclear foi associada com a progressão de vários tumores [28-30]. Estes dados indictate que as células cancerosas gástricas pode invadir os tecidos adjacentes via CCR4 de uma forma independente do ligando. A outra hipótese era de que a internalização CCR4 causada por seu ligante pode representar um mecanismo que tem evoluído no padrão de expressão CCR4 citoplasmática. CCL22, o ligando de CCR4 produzida por tecidos de cancro gástrico humano [31], também é conhecida a causeCCR4 internalização a partir da membrana para o citoplasma [32, 33], sugerindo coloração citoplasmática pode mostrar sinalização activada seguinte ligadura R4CC-CCL22. Mais estudos são necessários para revelar os mecanismos exactos subjacentes a esses padrões anormais de expressão do receptor de quimiocina envolvidos em progressão tumoral. Além disso, a expressão lentamente-intensificação de R4CC nos tecidos pré-malignas, embora estatisticamente insignificante mais elevada do que nos tecidos normais adjacentes-tumorais, sugeriu que o R4CC pode também participar nas fases de pré-neoplásicas de desenvolvimento do tumor no início.

Na nossa anterior estudo, descobrimos que CCR4 foi superexpresso no tecido GC, mas não encontramos diferenças significativas entre pacientes com e sem metástase ganglionar [18]. Portanto, a hipótese de que os receptores de quimiocinas pode também desempenhar um papel importante no desenvolvimento do câncer de pacientes pN0. No presente estudo, os resultados mostraram uma correlação positiva entre a expressão CCR4 e T-estágio, que foram consistentes com os nossos achados imuno-histoquímica que a expressão CCR4 tendem a aumentar à medida que a profundidade de invasão do tumor progrediu. O efeito de CCR4 na invasão de células de cancro gástrico foi parcialmente confirmada por ensaios de invasão de células Transwell. Estes ensaios foram realizados sob condições em que não se adicionou qualquer ligando do receptor CCR4 exógeno. Era possível que diferentes mecanismos possam existir para regular a invasão de células tumorais mediada por CCR4, de um modo independente do ligando, de acordo com o fenómeno de padrão citoplasmático de CCR4, que estava relacionado com o comportamento altamente invasiva de células tumorais em tecido GC. Confirmou-se que a sobre-expressão de R4CC foi intimamente associada com um maior grau de capacidade de invasão do tumor, indicando assim que a sobre-expressão pode conferir o R4CC potencial metastático nas células GC e promover ainda mais a progressão do tumor. Nós também a hipótese de que os ligantes CCR4 autócrinos também estavam envolvidos na motilidade celular in vitro
. As concentrações de CCL22 nas linhas celulares sobrenadante GC culturais transfectadas com ou sem R4CC foram bastante baixas como avaliamos (dados não mostrados). No entanto, a possibilidade não pode ser excluída a possibilidade de a produção autócrina ou parácrina de CCL22 poderia contribuir para a invasão do tumor via CCL22 /eixo CCR4 in vivo
. CCL17 e CCL22, ligandos de elevada afinidade como CCR4, são produzidos por GC e de outros tecidos de cancro. Em particular, CCL22, que é produzido quer por células de cancro ou tumor associados macrófagos, tem sido referida como estando envolvida na metástase de vários tipos de cancro [15-17]. Isto sugere uma possível autócrino /parácrino laço envolvendo CCL22 e CCR4 entre diferentes tipos de células.

MMP-2 e MMP-9, MMP são os mais afectados e bem caracterizados com forte actividade proteolítica da matriz extracelular (ECM). A consistência entre os testes de tempo real de RT-PCR e zimografia experiências demonstraram claramente que a sobre-expressão de R4CC em células de cancro gástrico aumentou significativamente a expressão de MMP-9 e actividade. Estas experiências enfatizou ainda mais e indicou a sua real papel na invasão tumoral, sob certas condições, com ou sem estimulação por CCL22 exógena. Acredita-se que a matriz MMP-9 degrada o colagénio do tipo IV, que é um dos principais constituintes da membrana basal e está relacionada com a invasão de células cancerosas e metástases em doentes com cancro gástrico [34]. Aqui, fornecemos novas pistas sobre o mecanismo subjacente que CCR4 pode promover a invasão de células de câncer gástrico pela regulação positiva de MMP-9. Observações semelhantes foram feitas também com respeito à invasão tumoral por meio de alguns receptores de quimiocina, tais como CXCR4 e CCR7 [19, 20, 22]. E MMP-2, a estrutura dos quais era semelhante ao MMP-9, foi também relatada para ser associada com o cancro gástrico [35]. No entanto, verificou-se MMP-9, mas não de MMP-2, era uma molécula-chave envolvidas na invasão tumoral mediada-R4CC, que pode ser devido a diferentes co-reguladores que interagem com o R4CC em vários microambientes. Apesar da MMP-2 de expressão em células de cancro gástrico transfectada-CCR4 também pareceu ser mais elevado do que em células transfectadas por simulação, a diferença era estatisticamente insignificante (dados não mostrados). ensaio de viabilidade celular mostrou que a sobre-expressão de CCR4, não teve efeito sobre o crescimento de células de cancro gástrico In vitro
, o que foi consistente com estudos anteriores que mostraram os ligandos CCR4 não pode induzir a proliferação de células [14], evitando assim a possivelmente que podem afectar índice de invasão ou MMP-9 montante. Estes ensaios foram realizados com ou sem CCL22 exógena, com diferenças significativas na expressão de MMP-9 entre CCR4 e células falsamente transfectadas. Nós especulamos os possíveis mecanismos de reforço da expressão de MMP-9 por CCR4-sobre-expressão pode ser parcialmente devido à expressão autócrina ou parácrina de CCL22 in vivo
. Ainda outras MMPs que possam estar envolvidos neste processo e as vias de sinalização precisos permaneceram para ser mais explorada no futuro.

Em conclusão, relatamos pela primeira vez que CCR4 foi aberrante sobre-expressos em câncer gástrico pN0 e pode promover a invasão tumoral. Além disso, os nossos dados indicam que induziu-R4CC MMP-9 de produção pode, pelo menos parcialmente são a base do novo mecanismo para a invasão do tumor mediada por R4CC. Assim, os antagonistas de CCR4 podem ser candidatos úteis para controlar eventos precoces na progressão tumoral.

Informações de Apoio
S1 Fig. Superexpressão de CCR4 não teve efeito sobre o crescimento de células de câncer gástrico in vitro
.
Após transfecção com CCR4 ou plasmídeo MOCK e estimulação com ou sem CCL22 exógena, as células SGC-7901 e BGC-823 foram replantadas em placa de 96 poços. Viabilidade das células foi avaliada por ensaio CCK8 em pontos de tempo indicados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0120059.s001
(TIF)

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