PLoS ONE: Snail-Regulated MiR-375 Hemmt Migration und Invasion von Magenkrebszellen durch JAK2

Abstrakt

MicroRNAs (miRNAs) sind eine kritische Rolle bei der Krebsinvasion und Metastasierung spielen berichtet. Unsere frühere Studie zeigte, dass miR-375 häufig in Magenkrebs nach unten reguliert Zellproliferation durch Targeting Janus-Kinase 2 (JAK2) unterdrückt. Hier fanden wir weiterhin, dass die Expression von miR-375 signifikant bei metastasierendem Magenkrebs Gewebe verringert im Vergleich zu den nicht-Metastasierung Kontrollen. Die ektopische Expression von miR-375 hemmt die Migration und Invasion von Magenkrebszellen teilweise durch JAK2-Targeting. Weiterhin ist miR-375 Expression durch die Metastasierung assoziierten Transkriptionsfaktor Snail negativ reguliert, die direkt an den putativen Promotor von miR-375 bindet. Darüber hinaus Überexpression von Schnecke kann teilweise die Hemmung von Magenkrebs Zellmigration umkehren verursacht durch miR-375. Zusammengenommen legen diese Daten deuten darauf hin, dass miR-375 kann sich negativ durch Schnecke und möglicherweise bei Magenkrebs Zellmigration und Invasion beteiligt reguliert werden, indem sie auf JAK2

Citation:. Xu Y, Jin J, Liu Y, Z Huang, Deng Y, Sie T, et al. (2014) Snail-Regulated MiR-375 Hemmt Migration und Invasion von Magenkrebszellen durch JAK2-Targeting. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10.1371 /journal.pone.0099516

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 7. Februar 2014; Akzeptiert: 15. Mai 2014; Veröffentlicht am: 23. Juli 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von Natural Scientific Foundation of China (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 und 31100975), Ministerium für Wissenschaft und Technologie von China unterstützt (2013CB945603, 2012CB945004 und (2011CBA01001), Ministerium für Bildung von China (20110101110103 und (20130101120001), Naturwissenschaftliches Gründung der Provinz Zhejiang, China (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 und Y2100106), das 111-Projekt (B13026), der Grundlagenforschung Fonds für die zentralen Universitäten (2014QNA7015) und Zhejiang Provincial Programm für die Bearbeitung von High-Level innovative Gesundheits Talente. die Geldgebern hatte keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

konkurrierende Interessen:.. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einleitung

Metastasierung ist die schrecklichsten Aspekte von Krebs und ist seit mehr als 100 Jahren [1], [2] untersucht worden. Bei Magenkrebs, Attribute die hohe Sterblichkeit hauptsächlich verzögerten Diagnose aufgrund des Mangels an spezifischen Symptome in frühen Stadium. Und Metastasierung ist verantwortlich für die Magenkrebs-Mortalität [3], [4]. Migration und Invasion von Krebszellen sind wesentliche Prozesse bei metastasierendem Prozession, die aus einer Reihe von miteinander verbundenen Schritten besteht, einschließlich Proliferation, Ablösung, Kreislauf, Verkehr, Verhaftung in Organen, die Einhaltung der Gefäßwand, Extravasation, die Einrichtung eines Mikroumgebung, und die Proliferation in entfernten Organen. In Magenkrebs, Zellen Invasion in das umliegende Gewebe ist ein wichtiger erster Schritt [3], [5]. Jedoch sind die Mechanismen von Magenkrebszellen, Migration, Invasion und Metastasierung nicht vollständig verstanden worden.

In den letzten Jahren verschiedene Moleküle, beispielsweise Wachstumsfaktoren, Cytokinen, extrazellulären Matrix-Remodeling Moleküle und einigen Transkriptionsfaktoren wie Schnecke, Twist und ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], haben die Fortschritte der Krebszellen Migration zu fahren, Invasion und Metastasierung enthüllt worden. In letzter Zeit hat sich gezeigt, dass, zusätzlich zu Abnormalitäten in Protein-kodierenden Genen, Änderungen in nicht-codierenden Genen kann auch auf die Krebszellen, Migration, Invasion und Metastasierung, wie miRNAs, die eine Klasse kleiner sind beitragen einsträngige nicht-kodierenden RNA-Molekülen, welche die Genexpression mit hohem Potenzial zu regulieren und sind an der Regulierung von Krebszellen Migration, Invasion und Metastasierung als Aktivatoren oder Suppressoren [12], [13], [14], [15], [16] in Verbindung gebracht . Bisher wurden eine Reihe von miRNAs untersucht worden bei Magenkrebs Metastasen Progression in Zusammenhang gebracht werden, zum Beispiel, miR-218, miR-9, miR-7 und miR-146a [6], [17], [18], [19]. Wir haben den Zusammenhang zwischen spezifischen dysregulated miRNA und spezifische Metastasierung Schritt von Magenkrebs untersucht, die Einblicke in die möglichen Mechanismen der Magenkrebszellen Migration, Invasion und Metastasierung bieten.

In unserer früheren Studie, miR-375 war bei Magenkrebs und gehemmt Magenkrebszellen Proliferation durch gezielte JAK2 [20] deutlich herunter reguliert. Interessanterweise wurde in der vorliegenden Studie fanden wir weiterhin, dass die Expression von miR-375 war sogar noch niedriger bei Magenkrebs Proben von Metastasen-positiven Patienten compaired mit, dass von metastasenfreien Patienten. So haben wir vorgeschlagen, dass miR-375 eine kausale Rolle bei Magenkrebs Metastasen haben könnte. Unsere Studien fanden heraus, dass die ektopische Expression von miR-375, die Migration und Invasion von Magenkrebszellen gehemmt zum Teil auch durch JAK2-Targeting. Wir aufgefordert, weiter um herauszufinden, wie miR-375 Expression in Magenkrebs geregelt wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass miR-375 war, ein Ziel der Metastasierung Transkriptionsfaktor Schnecke und seine Expression invers mit Schnecke in Magenkrebs korreliert. Die Überexpression von Schnecke kann die Hemmung von Magenkrebs Zellmigration teilweise umkehren, verursacht durch miR-375. So zeigen unsere Ergebnisse, dass miR-375 Magenkrebs-Zellen Migration und Invasion durch Snail /miR-375 /JAK2 Regulierung Weg hemmt.

Materialien und Methoden

Klinische Proben (Ethics Statement) und Zelle linien

Klinische Magenkrebs Proben und deren Paar abgestimmten nicht-malignen Magenproben von 39 Patienten Magenkrebs Resektion von Sir Run Run Shaw Hospital (Hangzhou, China) zur Verfügung gestellt wurden. Alle Proben wurden mit schriftlicher Zustimmung der Patienten gesammelt, wie zuvor beschrieben [20]. Sowohl Magentumorgewebe und benachbarte nontumorous Magen gesammelt Gewebe nach der Operation und in zwei Teile geteilt waren. Einer wurde in flüssigem Stickstoff unmittelbar für die weitere Verwendung eingefroren, ein anderer Teil in Formalin für Pathologie Analyse gelagert wurde. Die Patienten in unserer Studie beteiligt waren, in metastasenfrei getrennt und Metastase-positiven Gruppen (30.9). Die Magenkrebszelllinien (AGS und MGC-803) und ein nicht-malignen Magen-epithelialen Zell-Linie (GES-1) wurden zuvor beschrieben [20].

RNA-Extraktion

Gesamt-RNA aus Magenproben und Zelllinien wurde mit der Mirvana miRNA Isolation Kit extrahiert (Ambion, TX, USA) nach dem Protokoll des Herstellers.

Quantitative real-time PCR-Analyse

die Expression von miR-375 wurde Verwendung des Taqman Assays MicroRNA (Applied Biosystems, CA, USA) mit spezifischen Primern (P /N: 4.373.151, Applied Biosystems) analysiert. Reverse-Transkriptase-Reaktion wurde von 10 ng Gesamt-RNA durchgeführt Starten der geschleift Primer verwendet. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) wurde unter Verwendung des Standard-TaqMan MicroRNA-Assays Protokoll auf ABI7500 Real-Time PCR Detektionssystem durchgeführt. Die ΔΔCt Verfahren zur relativen Quantisierung wurde verwendet, miRNA-Expression zu bestimmen. Der Ct ist die fraktionierte Zykluszahl, bei der die Fluoreszenz jeder Probe, welche die feste Schwelle durchläuft. aus dem Ct des miRNA von Interesse: Die ACt wurde durch Subtraktion der Ct von snRNA U6 (4.373.381, Applied Biosystems RNU6B, P /N) berechnet. Die ΔΔCt wurde durch Subtrahieren der ACt der Referenzprobe (gepaart nicht-malignem Gewebe für chirurgische Proben normalen Geweben und GES-1-Zellen für Magenkrebszelllinien) von der ACt jeder Probe berechnet. wurde Falten Änderung bestimmt als 2 ^-ΔΔCt.

Migration und Invasion Assay

Die Zellen wurden mit 20 pre-miR-375 oder negative Kontrolle unter Verwendung von Transfektionsagens (Ambion nM transfiziert, TX, USA) nach der Herstellung des Protokolls in 24-Well-Platten. 24 h nach der Transfektion Transwell-Migrationstest und Matrigel Invasionstest wurden getrennt unter Verwendung von 24-Well Transwell-Einsätze mit 8 &mgr; m Porengröße (Corning Costar Corp). Für Transwell-Migrationstest, 2 × 10 ^{4 AGS oder 3 x 10 4 MGC-803 in 100 ul entsprechenden Kulturmedium ohne fötales Rinderserum (FBS) wurden mit nicht in die obere Kammer des Transwell-Einsatz geladen suspendierten Zellen -beschichteten Membran. Für Matrigel Invasionstest, 5 x 10 4 AGS oder MGC-803-Zellen wurden in 100 &mgr; l serumfreiem Medium in der oberen Kammer Matrigel beschichteten statt plattiert. In beiden Tests wurde enthält die untere Kammer 600 &mgr; l Medium mit 20% FBS. Die Zellen wurden dann bei 37 ° C für 12 h zu migriert oder fallen gelassen. Die Zellen, die in der unteren Kammer gewandert oder überfallen wurden fixiert, gefärbt mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000), visualisiert unter Phasenkontrastmikroskop und fotografiert. Gesamtzahl der migrierten oder Invasion Zellen wurde durch IPP (Image-Pro Plus-6.0) Software gezählt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal unabhängig voneinander wiederholt.}

Kratzwundheilungs Assay

Zellen transfiziert wurden wie zuvor beschrieben und erlaubt zur Konfluenz zu wachsen. Die Zellen wurden dann in entsprechenden Medium ohne FBS für 12 h und anschließend mit einer Pipettenspitze gekratzt. Wundflächen wurden markiert und bei 0 h fotografiert, 12 h, 24 h und 36 h jeweils. Die Rate der Migration Zellen wurde sowohl Fotografieren ausgewertet und die Quantifizierung der migrierten Entfernung von Zellen aus dem Wundrand in Richtung der Mitte mit IPP 6.0-System bewegt. Alle Experimente wurden dreimal wiederholt.

Konstrukten

pGL3-375pro Plasmid, die DNA-Sequenz enthält pri-miR-375 (primäre miR-375) Promotor amplifiziert wurde mittels RT-PCR Zur Herstellung verwenden die Primer 5'-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT AAG CGA CTC-3 'und 5'-ATCG AAGCTT ACG CCT TGG AGC TTG TCC-3' und dann kloniert in pGL3-basic-Vektor (Promega). Um das Plasmid zu konstruieren, die Schnecke in Zellen exprimiert, wurde der offene Leserahmen (ORF) -Sequenz von Snail kloniert in Säugetier-Expressionsvektor pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) durch unter Verwendung der Primer 5'-ATCG AA GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 'und 5'-ATCG GGA TCC TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3'. Für ektopische Expression von FLAG-markierten JAK2, menschliche JAK2 mit kodierende Region wurde kloniert in pCMV-Tag 2C Vektor. Um das Plasmid zu konstruieren, das in Säugerzellen miR-375 exprimiert, die paarigen Oligonukleotiden auf der Primärsequenz anhand von has-miR-375 und seine flankierenden Regionen wurden pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) in Säugetier-Expressionsvektor kloniert. Alle der Konstrukte wurden durch Sequenzierung bestätigt.

Luciferaseassay

Vierzig tausend Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen 24 h vor der Transfektion ausgesät. Zellen wurden entweder mit pGL3-375pro oder pGL3-Basic Vektor transfiziert. Der pRL-TK-Vektor (Promega, WI, USA), die Renilla
Luciferase wurde auch als Referenzkontrolle cotransfiziert. Firefly und Renilla
Luciferase-Aktivitäten wurden unter Verwendung von Dual Luciferase Reporter Assay (Promega) 24 Stunden nach der Transfektion gemessen. Firefly wurde die Luciferase-Aktivität normalisiert Renilla-Luciferase-Aktivität.

Statistische Analysen

Die Daten sind dargestellt als Mittelwert ± Standardfehler (SE) von drei unabhängigen Experimenten. Beziehungen zwischen der Expression von miR-375 und die Expression von Snail-mRNA untersucht wurden von Pearson
Korrelationskoeffizient, der zuvor beschrieben wurde [20]. Student t
-test und X
^{2-Test durchgeführt wurden statistische Signifikanz zu bestimmen. P
< 0,05 wurde als statistisch signifikant sein}

Ergebnisse |

MiR-375 dramatisch bei Magenkrebs Zellen und Gewebe von Metastasen-positiven Patienten nach unten reguliert wird
.

, um herauszufinden, ob miR-375 mit Magenkrebs Metastasen assoziiert ist, entdeckten wir zuerst die Expression von miR-375 in der primären Magenkrebs Gewebe von Metastasen-positive und metastasenfreien Patienten. Im Vergleich mit Proben von Metastasierung freien Patienten, das Expressionsniveau von miR-375 war fast zweifache Reduktion in Geweben von Metastase-positiven Patienten ( P
< 0,05) (1A). In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis wurde das Expressionsniveau von miR-375 in Magenzelllinien negativ mit den Fähigkeiten der Zellen Migration und Invasion assoziiert. Die metastatischen Eigenschaften von Magen-epithelialen Zell-Linien (GES-1, MGC-803, AGS) charakterisiert. Wie in 1C und 1D gezeigt ist, die Migration und Invasion Fähigkeiten der AGS-Zelllinie größer waren als die von MGC-803 und GES-1-Zelllinien ( P
< 0,01). miR-375-Expression in Zellen AGS umgekehrt, geringer war als die von MGC-803 und GES-1-Zellen ( P
< 0,01) (1B). Mit einem Wort, ist miR-375 bei Magenkrebs Gewebe von Metastasen-positiven Patienten und bei Magenkrebs-Zellen mit einer größeren Migration und Invasion Fähigkeiten herunter reguliert. Diese Korrelation zeigt an, dass miR-375 eine kausale Rolle bei Magenkrebs Metastasen haben könnte.

Die Überexpression von miR-375 Migration Magenkrebszellen hemmt und die Invasion

die Rolle der miR-375 zu erforschen in Magenkrebs Metastasen, untersuchten wir die Wirkung von miR-375-Überexpression auf die Migration und Invasion von AGS und MGC-803 Magenkrebs-Zellen mit niedrigen endougenous Expression von miR-375. Zellen wurden entweder mit miR-375 Vorstufe (miR-375) oder ein Vorläufer-negativen Kontroll-Oligonukleotide (negativ) oder keine der oben genannten (Mock) transfiziert. Die Transwell-Migrationstest zeigte, dass die Überexpression von miR-375 stark die Wanderung von AGS (2A, 2B) und MGC-803-Zellen (S1A, S1B) gehemmt. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen ergab die kratzWundheilungsTest auch, dass die Geschwindigkeiten der AGS (2C, 2D) und MGC-803-Zellen (S1C, S1D) Migration in Richtung der Wundbereich nach Überexpression von miR-375 deutlich reduziert wurden . Wir weiteren Assay Matrigel Invasions eingesetzt und festgestellt, dass die Überexpression von miR-375 führte zu einer mehr als zweifache Verringerung der invasiven Eigenschaften von AGS (3A, 3B) und MGC-803-Zellen (3C, 3D). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die Überexpression von miR-375 ausreichend ist, sowohl die Migration und Invasion Fähigkeiten von Magenkrebszellen zu hemmen.

miR-375-regulierten JAK2 ist an der Regulation von Magenkrebszellen Migration und Invasion beteiligt

Unsere früheren Studie hat JAK2 als nachgeschalteter Ziel von miR-375 identifiziert [20]. Hier sind wir daran interessiert, zu studieren, ob JAK2 bei der Regulation der Magenkrebszellen Migration und Invasion beteiligt ist. Wir verwendeten Vektor-basierte RNAi-Technik endogenen JAK2 zu verarmen und fanden heraus, dass die Migration und Invasion Aktivitäten von AGS (Abbildung 4) und MGC-803-Zellen (S2) wurden stark beide gehemmt. Gleichzeitig haben wir untersucht, ob JAK2 die Hemmung Wirkung von Magenkrebszellen Migration und Invasion von miR-375 verursacht entgegenwirken könnte. Die Zellen wurden mit miR-375-Vorläufer cotransfiziert und entweder JAK2 Überexpressionsvektor (miR-375 + JAK2) oder steuern leeren Vektor (miR-375 + Vec). Überexpression von JAK2 eindeutig Zellen Migration und Invasion gefördert, wie in Figur 4 und S2 gezeigt. So wird in Einklang mit unserer Hypothese, miR-375 kann die Migration und Invasion von Magenkrebszellen teilweise JAK2 durch gezielte hemmen. Wir weiter festgestellt, dass JAK2 Überexpression keinen Einfluss auf die Expression von miR-375 hat, wie in Abbildung S3 gezeigt. Wir können jedoch nicht die Möglichkeit ausschließen, dass die Fehlregulation von miR-375 mit anderen Zielen stört Magenkrebszellen Migration und Invasion erforderlich für.

Snail downregulates miR-375 Expression

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass miR-375 kann durch bestimmte Transkriptionsfaktoren ausgerichtet sein, die mit Krebs Invasion und Metastasierung Prozess verbunden sind. Natürlich konzentrieren wir uns auf, wie miR-375 Expression reguliert wird. Wir fanden zunächst vor pri-miR-375-Gen eine DNA-Region unterhalten aus, die die pri-miR-375-Gen-Promotor [21] enthalten berichtet wurde. Wir führten dann Consite Programm (http://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite) und fanden, dass es sechs Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors Snail in der DNA-Region (5A) waren. Die DNA-Region wurde in pGL3-Basic Vektor (Promega) (pGL3-375pro) kloniert die Promotoraktivität zu messen. In Einklang mit der Daten von Walker-Gruppe [21] zeigten unsere Ergebnisse, dass diese DNA-Region, die pri-miR-375-Gen-Promotor enthält und fähig ist, die Luciferase-Expression (5B). Die Luciferase-Aktivität wurde effizient unterdrückt, wenn pGL3-375pro Vektor mit Snail-Expressionsvektor (Schnecke) cotransfiziert wurde, aber nicht, wenn kotransfiziert mit dem leeren Kontrollvektor (Mock) (5C). Darüber hinaus könnte Snail Expression des Expressionsniveaus von miR-375 um 46% (Abbildung 5D) zu reduzieren. Um die klinische Relevanz dieser Ergebnisse, um zu bestimmen, korreliert wir weiter das Expressionsniveau von miR-375 mit der Schnecke mRNA-Ebene in den gleichen Patienten mit Magenkrebs. Wie in 5E gezeigt ist, wurde eine deutliche inverse Korrelation zwischen der Expression von miR-375 und Snail-mRNA ( P
< 0,05, r = -0,6) gefunden. Daher zeigen diese Beobachtungen, dass Snail ein Potential vorgeschalteten Regler von miR-375 Expression ist.

Schnecke ist an der Regulation der Magenkrebszellen Migration beteiligt, indem sie auf miR-375

Zur weiteren Aufklärung der Korrelation von miR-375 und Schnecke, untersuchten wir, ob Schnecke durch gezielte miR-375 in der Regulation der Magenkrebszellen Migration beteiligt ist. Wir beschäftigten vektorbasierte Technik Snail Expressionsniveau hoch zu regulieren und festgestellt, dass die Migrationsaktivität von AGS-Zellen (Abbildung 6) wurden stark gefördert. Gleichzeitig haben wir untersucht, ob Schnecke könnte die Hemmung Wirkung von Magenkrebszellen Migration von miR-375 verursacht entgegenzuwirken. Die Zellen wurden mit miR-375 Überexpressionsvektor und Schnecke Überexpressionsvektor (Schnecke + miR-375) cotransfiziert. Die Überexpression von Snail deutlich Zellen Migration gefördert und könnte die Hemmung Wirkung von Magenkrebszellen Migration verursacht durch miR-375 teilweise entgegenwirken, wie in Abbildung 6 Somit gezeigt, in Einklang mit unserer Hypothese, Schnecke kann die Migration von Magenkrebszellen teilweise hemmen, indem sie auf miR-375.

Diskussion

MiRNAs berichtet Tumor Migration, Invasion und Metastasierung einschließlich Magenkrebs [6], [22] zu regeln. MiR-375 wurde zuvor gezeigt, eine wichtige Rolle bei Magenkrebs-Zellen-Proliferation zu spielen [20], [23]. Jedoch bleiben die regulatorischen Mechanismen unklar. In der vorliegenden Studie untersuchten wir ferner die Funktion und mögliche Mechanismen von miR-375 bei der Migration und Invasion von Magenkrebszellen. Wir fanden heraus, dass die Überexpression von miR-375 inhibiert die Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen teilweise durch JAK2-Targeting. Es hat mehr als ein Jahrzehnt her, seit JAK2 erste geklonte wurde [24]. JAK2 ist in fast jedem Gewebe exprimiert und in Verbindung mit vielen pathologischen fortschreitet. Obwohl es offensichtlich ist, dass JAK2 als Onkogen wirkt in beiden myeloproliferative Erkrankungen und einigen soliden Tumoren [25], [26], [27], ohne direkte Beteiligung von JAK2 in Krebs Migration, Invasion oder Metastasen berichtet. Aufregend, unsere Studie zeigte zunächst, dass durch RNAi JAK2 umzuwerfen, die Migration und Invasion Aktivitäten von Magenkrebszellen ähnlich der Überexpression von miR-375 gehemmt. Neben Überexpression von JAK2 könnte die Migration und Invasion von Magenkrebszellen fördern. So gingen wir davon aus, dass JAK2 könnte die hemmende Wirkung auf die Zellen Migration und Invasion von miR-375 verursacht entgegenzuwirken. In Anbetracht der entscheidenden Rolle von miR-375 und JAK2 als Master-Regler bei Magenkrebs-Zellen-Proliferation, Migration und Invasion, hat sie beide therapeutisches Potential bei der Behandlung von Magenkrebs. Daher bleibt es zu untersuchen, ob es noch andere Ziele in miR-375 vermittelte Magen-Metastasen teilnehmen ist.

Von besonderem Interesse, wir weiter untersucht, wie miR-375 in der Magen-Krebsentstehung beteiligt sind. Zwar gibt es eine offensichtlich, dass die DNA-Methylierung und Histondeacetylierung die möglichen Mechanismen in der Herabregulation von miR-375 in Magenkrebs beteiligt sind [23]. Die Mechanismen, miR-375 Dysregulation bei Magenkrebs Metastasen zugrunde liegen, sind noch weitgehend unverstanden. Es besteht die Möglichkeit für eine transkriptionelle Blockierung von miR-375-Genexpression in diesem Prozess. Hier zeigen wir, dass die Metastasierung Transkriptionsfaktor Snail ist ein Potential vorgeschalteten Regler von miR-375 Expression. Schnecke ist eine DNA-bindende Zinkfingerprotein und wurde als Transkriptionsrepressor [28] berichtet. Acumulating Beweise zeigen, dass Snail bindet an E-Boxen in dem Promotor von E-Cadherin und reprimiert dessen Transkription Tumorinvasion Entwicklung [29] zu regulieren. Außerdem Überexpression von Snail in Krebsen gefunden wurde mit Lymphknotenmetastasen, Tumorrezidiv und Prognose assoziiert zu sein [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Im Einklang mit den anderen Berichten, fand unsere Studie, dass Snail mRNA in Magenkrebsgewebe überexprimiert wird, wenn sie mit ihren benachbarten nicht-malignen Gewebe verglichen. Da die Promotoraktivität von miR-375 von Schnecke und Überexpression von Schnecke unterdrückt werden kann, könnte miR-375-Expressionsniveau deutlich zu reduzieren, fanden wir weiterhin eine deutliche inverse Korrelation zwischen der Expression von miR-375 und der Ebene der Schnecke mRNA bei Magenkrebs Proben. Schnecke wird auch durch gezielte miR-375 in der Regulation der Magenkrebszellen Migration gefunden beteiligt.

Abschließend haben wir festgestellt, dass miR-375 aberrantly im Magenkrebsgewebe von Metastasen-positiven Patienten exprimiert wurde oder Magenkrebszellen mit einer größeren Migration und Invasion Aktivitäten, wenn sie mit Geweben von metastasenfreien Patienten oder nicht-invasive Magenepithelzellen Zelllinie GES-1 jeweils verglichen. Die Überexpression von miR-375 reduziert Magenkrebszellen Migration und Invasion Aktivitäten zumindest teilweise durch JAK2-Targeting. Ferner ist ein stromaufwärts Regulator von miR-375 Snail kann die sich negativ auf die Expression von miR-375 regelt und in der Regulierung der Magenkrebszellen Migration durch gezielte miR-375 beteiligt. Zusammen stellen unsere Ergebnisse eine unbeschriebene Weg, in dem ein Transkriptionsfaktor Snail die Expression von miR-375 reguliert, die ihre direkte Ziel JAK2 unterdrückt, was die Migration und Invasion von Magenkrebszellen zu hemmen. Unsere Daten zeigen, dass die Wiederherstellung von miR-375 oder Hemmung der Schnecke oder JAK2 therapeutischen Nutzen sein können Strategien für Magenkrebs-Behandlung. Es wird sicherlich sehr interessant sein, weiter die potentielle Wirksamkeit dieser Moleküle untersuchen Targeting miR-375, JAK2 oder Schnecke bei der Behandlung von Magenkrebs. Ein weiteres interessantes Thema für die künftige Forschung wird die Ermittlung anderer möglicher Ziele von miR-375 sein, und, genauer gesagt, die mögliche Beteiligung von JAK2 in Magenkrebs Metastasen.

Hintergrundinformationen
Abbildung S1.
ektopische Expression von miR-375 unterdrückt die Migration von MGC-803-Zellen. MGC-803-transfizierten Zellen mit miR-375 Vorstufe (miR-375), Negativkontrolle (negativ) oder keine der oben genannten (Mock) wurden auf Transwell-Migrationstest (A) unterzogen und kratzWundheilungsAnalyse (C). (A) Repräsentative Felder von invasiven Zellen auf der Unterseite der Membran, die mit DAPI wurden fixiert und gefärbt. (B) Anzahl der migrierten Zellen auf der Unterseite der Membran durch IPP 6.0 Software wurde gezählt. (C) Die Zellen Migration auf das verwundete Gebiet wurde durch Mikroskopie bei 0 h fotografiert, 12 h, 24 h und 36 h nach der Verwundung. Die gepunkteten Linien zeigen die Bereiche fehlen Zellen. (D) Die Migrationsrate wurde durch Messung der Entfernung von Zellen aus dem Wundrand in Richtung der Mitte in 36 h nach dem Kratzen bewegt sucht. Die Daten werden als Mittelwert ± SE von mindestens drei unabhängigen Versuchen dargestellt. Bars, 50 &mgr; m. * P
< 0,05, ** P
< 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s001
(TIF)
Abbildung S2 .
Überexpression von JAK2 kehrt miR-375 induzierte Hemmung der MGC-803-Zellen Migration und Invasion. Die Zellen, die mit den genannten Vektoren oder Oligonucleotide wurden mit Transwell-Migrations (A) oder Matrigel Invasionsassay (C) unterzogen. Die Rettungsversuche für miR-375-Überexpression wurden durch ektopische Expression von JAK2 durchgeführt, ohne 3'-UTR in miR-375-behandelten Zellen. (A, C) Repräsentative Felder der Zellen auf der unteren Kammer bei 12 h nach der Migration oder Invasion wurden gezeigt. Maßstabsbalken, 50 &mgr; m. (B, D) Die Gesamtzahl der migrierten oder invasive Zellen von neun zufällig ausgewählten Feldern wurde von IPP 6.0 gezählt. * P
< 0,05, ** P
< 0,01
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s002
(TIF)
Abbildung S3 .
JAK2 hat keine Auswirkung auf miR-375 Expression. Die AGS und MGC-803-Zellen wurden mit JAK2 Überexpressionsvektor oder Kontrollvektor transfiziert und auf RT-PCR-Analyse für die Expression von miR-375 unterzogen. Die Höhe der RNA U6 wurde als Kontrolle verwendet
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099516.s003
(TIF)

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