PLoS ONE: abnehmend miR-204 in der H. pylori-assoziierten Magenkrebs fördert Krebszellproliferation und Invasion durch SOX4

Abstrakt

Hintergrund

Der molekulare Mechanismus zwischen Helicobacter pylori (H. pylori) Infektion und Magenkrebs blieb weitgehend unbekannt. In dieser Studie haben wir festgestellt, die Rolle der miRNA bei H. pylori Magenkrebs induziert.

Methoden und Ergebnisse

Wir fanden, dass miR-204 in H. verringert wurde pylori-positiven Gewebe durch qRT- PCR. Preissturz von miR-204 verbessert die Invasion und die Proliferationsfähigkeit von Magenkrebszellen in vitro. Luziferase-Assay ergab, dass SOX4 war Zielgen von miR-204, die hochreguliert in H. gefunden wurde pylori-positiven Geweben. Die Herunterregulierung von miR-204 und eine Überexpression von SOX4 gefördert epithelial-mesenchymale Transition-Prozess.

Fazit

Insgesamt unsere Ergebnisse zeigten, dass miR-204 als Tumorsuppressor wirken kann, in H. pylori durch Magenkrebs induzierte SOX4 Targeting

Citation:. Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) Verminderte miR-204 in der H. pylori-assoziierten Magenkrebs fördert Krebszellproliferation und Invasion von SOX4 Targeting. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10.1371 /journal.pone.0101457

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 18. März 2014; Akzeptiert: 5. Juni 2014; Veröffentlicht: 1. Juli 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier und seine Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Guoxin Zhang von National Natural Science Foundation of China (Nr 81270476) finanziert wurde (http://www.nsfc.gov.cn/). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweite führende Ursache von Krebs-Todesfälle weltweit [1]. Bisher wurden molekulare Mechanismen auf Magenkrebs untersucht worden, jedoch sind sie nicht vollständig verstanden ist [2]. Magenkarzinomen sollen nach einem mehrstufigen Prozess der Karzinogenese zu entwickeln, die stark mit der Infektion durch das Bakterien-Pathogen, Helicobacter pylori
( H. Pylori
) [3] verbunden ist. H. pylori
, die den Magen von 50% der Weltbevölkerung kolonisiert, wurde als Klasse-I bei der Entwicklung von Magenkrebs wegen seiner ursächliche Rolle Karzinogen [4].

Es wurde berichtet, dass die Entwicklung und Progression von Magenkrebs zu microRNAs (miRNAs) kann [5] zurückgeführt werden - [8]. MiRNAs sind kleine, nicht-kodierenden RNAs, die die Expression von Zielgenen durch translationale Repression oder messenger RNA (mRNA) Abbau [9] regulieren. MiR-204 wurde abweichenden Expression berichtet mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung [10], [11]. Allerdings ist nur wenig über miRNA-204-Funktion bei Magenkrebs bekannt. Matsushima ausgeführt miRNA Array Studie in H. pylori-positiven Geweben und contols und festgestellt, dass miR-204 Expression war signifikant niedriger bei H. pylori positive Gewebe [12].

Beim Menschen ist die geschlechtsbestimmenden Region Y (SRY ) Box-Familie, auch für die SOX-Familie bezeichnet, umfasst 20 hoch Faktoren konserviert Transkription, die eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Prostatakrebs [13] spielen. Diese Transkriptionsfaktoren sind durch eine konservierte Signatursequenz in der Hochmobilitätsgruppe (HMG) DNA-Bindungsdomäne (DBD) [14], [15] definiert. SOX4 ist ein 47-kDa-Protein stark in Wirbeltieren konserviert ist und ihre klinische Bedeutung hat sich die Aufmerksamkeit in den letzten Jahren gewonnen Erhöhung mit zahlreichen Berichten, dass SOX4 was darauf hindeutet, [16] bis zur Tumorprogression beitragen kann [17]. [21] - Erhöhte SOX4 Expression in Tumoren der Blase, Prostata und Dickdarm, und mit nicht-kleinzelligem Lungentumoren [18] gefunden. Deregulierte Expression von SOX4 wurde mit einem erhöhten Krebszellproliferation, Zellüberleben, die Hemmung der Apoptose und Tumorprogression bei Magenkrebs [22] korreliert. Seine Überexpression wurde auch zu einer schlechten Prognose in den Kliniken in Verbindung gebracht und es ist eine Markierung, um die Ergebnisse von Patienten mit Magenkrebs, vorherzusagen, [23].

jedoch bis vor kurzem ist es unklar, ob das H. pylori-Infektion kann SOX4 Expression durch nach unten regulieren miR-204 induzieren. So führten wir unsere Studie, um die Rolle der miR-204 und SOX4 in H. untersuchen induzierten Karzinogenese pylori.

Materialien und Methoden

Klinische Proben

Bei Patienten mit oder ohne H. pylori
Infektion an der ersten Affiliated Hospital der Nanjing Medical University, Jiangsu Province, China ab März 2012 und Dezember 2013 genommen Proben unterzogen Gastroskop hatten von den 250 Patienten (150 Patienten noncancerous und 100 Tumorpatienten) wurden gesammelt, und wurden als positiv identifiziert, wenn eine schnelle Urease-Test positiv war. Diese ausgewählten Patienten wurden auch von ^{13C-Atemtest bestätigt. nach der pathologischen Klassifikation noncancerous Patienten wurden in oberflächliche Gastritis, atrophische Gastritis und Dysplasie eingestuft. Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission der erste verbundenen Krankenhaus von Nanjing Medical University zugelassen, und jeder Patient informierte Zustimmung geschrieben hatte.}

Zellkultur

SGC-7901 /MKN45 Magenkrebs-Zelllinien ( bezogen von ATCC) wurden in RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Gibico) und Penicillin (100 U /ml). Die Zellen wurden mit 5% CO in einer angefeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C kultiviert _2.

Bakterienkultur und Infektionsmodell

H. pylori wurde mit 5% O bei 37 ° C in einer microaerophilic Atmosphäre in die Platte und kultiviert geimpft _{2, 10% CO 2 und 85% N 2. Nach 3 Tagen wurde die Bakterien in RPMI-1640-Medium ohne FBS resuspendiert und die Zellen in einer MOI von 100 Zellen infiziert wurden dann nach 48 h der Infektion geerntet.}

Isolierung von Gesamt-RNA und Quantitative RT-PCR

Gesamt-RNAs wurden aus gesammelten Geweben und Zelllinien extrahiert Trizol (Tarkara, Japan) und dann beide miRNA und mRNA wurden in cDNA revers transkribiert. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung der reversen Transkription-Kit (Takara, Japan) durchgeführt. Die Expression von reifen miRNAs und potentielle Zielgene wurden durch qRT-PCR mit SYBR Green PCR Kit (Takara) auf Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time-PCR-System und menschliche U6-RNA wurde als interne Kontrolle verstärkt gemessen. Die relative Expressionsverhältnis von miR-204 wurde durch das 2 ^{-ΔΔCT-Methode berechnet. PCR-Reaktionen wurden mit den folgenden Primern durchgeführt: für hsa-miR-204, vorwärts, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'und für U6, vorwärts, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. Relative Expression von SOX4 mRNA wurden von SYBR Green Echtzeit-PCR (RT-PCR) und normalisiert auf GAPDH sucht. Die Primer für SOX4 waren nach vorn, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3' und umgekehrt, 5 'CAGACAACCGGCCTTTAT 3'; und für GAPDH, vorwärts, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'und umgekehrt, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. RT-PCR wurde unter Verwendung des ABI 7500 Fast Real-Time-PCR-System (ABI, CA, USA) durchgeführt.}

Immunhistochemie

Die Gewebe wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert und aus Paraffinblock geschnitten 5 &​​mgr; m Dicke. über Nacht unter Verwendung von Citrat-Natriumpuffer (pH 6,0) und inkubiert mit dem Antikörper SOX4 (Cell Signaling Technology) bei 4 ° C nach dem Entwachsen mit Xylol und Rehydratisierung mit einer abgestuften Reihe von Ethanol, wurden die Objektträger in dem Autoklaven für 3 Minuten erhitzt. Blockierungsserum oder Antikörperverdünnungspuffer wurde als negative Kontrollen verwendet. Die verwendeten Antikörper waren, bevor die gleichen wie für Western-Blot-Analyse. Fotografien wurden von Mikroskop aufgenommen (Nikon Eclipse 50i). Die Anzahl der Zellen eine positive Färbung Immunreaktivität von SOX4 in zehn repräsentative mikroskopische Felder zeigte gezählt, und der Prozentsatz der positiven Zellen wurde ebenfalls berechnet. Der Prozentsatz scoring von immunoreaktiven Tumorzellen wurde wie folgt beschrieben: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%) und 3 (> 50%). Die Intensität wurde wie folgt bewertet: 0 (negativ), 1 (schwach), 2 (mittel) und 3 (stark). Das Expressionsniveau von SOX4 wurde durch Multiplikation des Prozentsatzes und der Intensität Punktzahl gemessen. Hohe Expressions Proben bedeutet Tumoren mit einem vervielfachten Score von mehr als 4, während die anderen in Betracht gezogen wurden geringe Expression zu sein.

Die Zellproliferation assasy

Die Zellproliferation wurde unter Verwendung von wasserlöslichen Tetrazoliumsalz Test untersucht die Zelle unter Verwendung von Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan). Kurz gesagt, Zellen (1,5 × 10 ^{3 /Well) wurden in 96-Well-Kulturplatten in dreifacher Ausfertigung beimpft und 4 Tage bei 37 ° C /5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Lebensfähige Zellen wurden bei jeweils 24 h Intervall quantifiziert durch OD450 Messung Mikrotiterplatten-Lesegerät verwendet wird. (Epoch; BioTek, Winooski, VT)}

Die Zellen (2 × 10 ^{6) wurden bei 4 ° mit 75% Ethanol fixiert C über Nacht und dann mit kaltem PBS und mit RNase I, gefolgt durch Färbung mit Propidiumiodid für 30 min in der Dunkelheit gewaschen. Zellzyklus-Analyse wurde dann mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, Becton Dickinson, Sparks, MD) durchgeführt.}

Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt und plattiert auf 6-Well-Platten (500 Zellen /Vertiefung) und kultiviert für 2 Wochen. Die Kolonien wurden 30 min nach der Fixierung mit 4% Paraformaldehyd mit 1% Kristallviolett gefärbt für 30 Minuten. Die Anzahl der Kolonien, definiert als > 50 Zellen /Kolonie gezählt. Drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt. Die Daten wurden unter Verwendung von gepaarte t-Test berechnet.

Die Zellmigration Test (Wundheilungs)

Ein Wundheilungs Assay verwendet wurde, die Fähigkeit der Tumorzellbeweglichkeit zu beurteilen. Kurz gesagt, Zellen (1 · 10 ^{6 /Well) in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät, über Nacht gezüchtet und transfiziert mit miR-204 nachahmt oder Inhibitor, pcDNA-SOX4 oder pcDNA-NC. Auf Erreichen der Konfluenz wurde die Zellschicht mit einer sterilen Kunststoffspitze gekratzt und dann mit Kulturmedium kultiviert und zweimal erneut bis zu 48 mit serumreduziertes Medium mit 1% FBS gewaschen. Der Lückenschluss wurde gemessen und die Daten wurden auf sextuple Assays für jeden Versuchs zusammengestellt basiert.}

Zellinvasionstest

Zellinvasion Aktivität wurde unter Verwendung von Zellkultureinsätze beschichtet mit Basalmembranmatrix beurteilt (BD Biosciences , Bedford, MA) nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, wurden insgesamt 1 × 105 Zellen in 0,2 ml serumfreiem RPMI-1640-Medium auf einem Transwell-Apparat angeimpft. RPMI-1640, 10% FBS (600 ul) enthielt, wurde in die untere Kammer gegeben. Nach der Inkubation der Zellen für 24 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator, Zellen auf der oberen Oberfläche des Einsatzes wurden durch Abwischen mit einem Baumwolltupfer entfernt. Die Zellen, die an der Bodenfläche des Einsatzes eingedrungen wurden für 30 min, gebeizt in 0,5% Kristallviolett dann in 100% Vorkühlung Methanol fixiert für 30 min, in PBS gespült und zur mikroskopischen Prüfung unterzogen. Die Zellen wurden in fünf zufälligen Feldern unter dem Mikroskop gezählt und die relative Invasion und Migration wurden als die durchschnittliche Anzahl von Zellen ± Standardabweichung pro Feld interpretiert.

Western-Blot

Insgesamt Proteine ​​wurden hergestellt und quantifiziert ein Protein-Assay (BCA-Verfahren, Thermo, USA). Proteine ​​wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt (SDS-PAGE) übertragen Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran, blockiert in 5% Trockenmilch bei Raumtemperatur für 1 Stunde und immunhistochemisch mit Antikörpern bei 4 ° C über Nacht anti-SOX4 Verwendung ( 1:1000, CST, USA), Anti-N-Cadherin (1:1000, CST, USA) und Anti-E-Cadherin (1:1000, CST, USA). Anti-GAPDH (1:5000, Sigma, USA) wurde als Ladekontrolle verwendet. Ergebnisse wurden durch ein Chemilumineszenz-Detektionssystem (Pierce ECL Substrat Western-Blot-Detektionssystem, Thermo, Pittsburgh, PA) sichtbar gemacht und dann in Molecular Imager ChemiDoc XRS-System (Bio-Rad, Hercules, CA) ausgesetzt.

Plasmidkonstruktion

Vorhersage von miR-204-Bindungsstellen wurde mit TargetScan Software (http://www.targetscan.org) durchgeführt. 3'-UTR-Sequenz von SOX4 die mit miR-204 oder eine mutierte Sequenz mit der vorhergesagten Zielstellen zu interagieren, wurde vorhergesagt wurden in die KpnI und SacI-Stellen von pGL3 eingeführt Promotor-Vektor (Invitrogen). Sie wurden pGL3-SOX4 und pGL3-SOX4-mut benannt. Die Zellen wurden auf 6-well-Platten ausplattiert und wurden mit 100 ng pGL3-SOX4 oder pGL3-SOX4-mut und miR-204 nachahmt (50 nM) transfiziert von Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp, CA, USA) verwendet. Wir normalisiert die Unterschiede in der Transfektionseffizienz durch Co-Transfizieren eines Renilla-Luciferase-Vektor pRL-SV40 (5 ng).

SOX4 Gens wurde synthetisiert (erworben von Genscript, Piscataway, NJ) mit restriktiven Verdau MluI subkloniert und unter Verwendung von pLV-GFP-Plasmid und benannte pLV-GFP-SOX4. Rekombinante Lentiviren wurde von 293T-Zellen unter Verwendung von Calciumphosphatfällung erzeugt. SGC-7901-Zelllinien wurden transfiziert mit Lentiviren mit Polybren (8 ug /ml).

Luziferase-Aktivitäten Analyse

Die Zellen wurden in 24-Well-Platten und transfiziert mit 0,2 ug entweder Breit Typ oder mutant pGL-SOX4 Plasmid Glühwürmchen-Luciferase enthält, zusammen mit 0,01 ug des pGL-SOX4 Vektor (Invitrogen) Renilla-Luciferase und 1 ug Oligonukleotide enthält. Die Transfektion wurde durchgeführt unter Verwendung von Lipofectamin 2000-Reagens (Invitrogen). Relative Luciferase-Aktivität wurde 48 h nach der Transfektion durch die Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) berechnet. Alle Transfektion Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und wiederholt dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.

Die statistische Analyse

Student-t-Test oder Einwegvarianzanalyse für die statistische Analyse verwendet wurde, als angemessen. Alle statistischen Analysen wurden mit dem SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL) durchgeführt. Ein zweiseitiges Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse |

MiR-204 ist aberrantly herunterreguliert in H.. pylori
positive Gewebe und Zellen

Die Expression ausgewählter miRNAs nach bisherigen Microarray-Daten [10] wurden in 75 Paaren von H. pylori nachgewiesen positiven und negativen normalen Geweben und 50 Paare von H. pylori-positiven und negative Tumorgewebe durch real-time PCR. Wir fanden, dass miR-204 war einer der bedeutendsten miRNAs herunterreguliert auf H. pylori-Infektion (Abbildung S1A, 1A, B). Zusätzlich wurde miR-204 auf einem niedrigeren Niveau in schwereren Gastritis (1C) ausgedrückt. Wir verglichen weiter seine Expression in Tumorgewebe mit normalen Geweben, unabhängig von H. pylori-Status und festgestellt, dass miR-204 wurde in Tumoren (Abbildung S1B) deutlich niedriger ausgedrückt. Wir teilten die Patienten mit Tumor nach verschiedenen TNM Stadien und T2-T4 und M1 Patienten ausgedrückt signifikant niedrigere miR-204 als T1 und M0 Patienten (Abbildung S1C, S1D). Wir untersuchten auch miR-204-Expression in Zellen, die mit H. pylori infiziert und fanden wir, dass die Expression von miR-204 in mehreren H. signifikant niedriger war pylori infizierten Zellen als Kontrolle (1D, Figur S1E).

miR-204 unterdrückt die Migration /Invasion und Proliferation von Magenkrebszellen in SGC-7901 und MKN-45-Zellen

Wir SGC7901 und MKN45 Zellen mit hsa-miR-204 mimischen /Inhibitor-Oligonukleotiden transfiziert und untersuchte die Auswirkungen auf zelluläre Proliferation und Migration /Invasion. Zuerst führten wir qRT-PCR, die Wirksamkeit der Transfektion zu überprüfen, wie in Fig. 2A, Transfektion von Zellen mit miR-204 ahmt /Inhibitor zeigten signifikant erhöhen /Abnahme der miR-204 Expression im Vergleich zu ihren Negativkontrolle (NC /iNC). Wundheilungstest zeigte, dass Überexpression von miR-204 Zellmigration unterdrücken konnte, während die Zuschlagszellmigration induzierte, mit erheblichen näher Lücke als Kontrolle (2B). Konsequent auch Matrigel Invasionstest zeigte, dass die Überexpression von miR-204 Zellinvasion abgeschwächt, während Knockdown davon könnte die Zuneigung (2C) umkehren. Wir haben auch MTT-Assay durchgeführt und festgestellt, dass die Wachstumsrate der mit miR-204-Inhibitor transfizierten Zellen signifikant verglichen mit den Kontrollen erhöht war, während die Zellen mit miR-204 nachahmt zeigte wurde die verschiedenen (3A, B). Wir untersuchten auch, ob der Zellzyklus würde durch die Zuschlags betroffen /Überexpression von miR-204 unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) Analyse von Propidium-Jodid-gefärbten Zellen. Knockdown von miR-204 führte zu einem signifikanten Anstieg der Prozentsätze der Zellen in der G2 Phase, während eine Überexpression den entgegengesetzten Effekt (Abbildung 3C) zeigte. Koloniebildungsassays zeigten, dass die Hemmung der miR-204 signifikant die Wachstumsrate der Zelllinien (3D) erhöht. Wir verglichen auch die Zellfunktionen zu transfizieren mit miR-204 imitiert mit Mimik und H. pylori-Infektion. Wir fanden, dass miR-204 ahmt die Zellmigration unterdrücken konnte, Invasion und Proliferation auf H. pylori-Infektion (Abbildung S2). Diese Ergebnisse zeigten, dass zusammen Herunterregulation von miR-204 induziert durch H. pylori-Infektion Migration /Invasion und Proliferation der Magenkrebs-Zelllinie in vitro zu fördern.

MiR-204 hochreguliert SOX4 Ausdruck bei Magenkrebs

Wir identifizierten die Downstream-Ziele von miR-204 durch rechnerische Vorhersage, die Mechanismen aufzuklären, durch die miR-204 Magenkrebs-Zellinvasion unterdrückt. Unter Hunderten von Genen, die durch Online-miRNA Ziel Vorhersage Website vorhergesagt (Starbase, http://starbase.sysu.edu.cn/), forcused wir unsere Aufmerksamkeit auf SOX4. SOX4 war berichtet worden, Magenkrebs Progression und EMT oder fungieren als eine zugrunde liegende Funktionsziel von miR-204 zu regulieren. Um die Vorhersage, durch qRT-PCR und Immunhistochemie identifizieren, fanden wir, dass SOX4 war hochreguliert in H. positive Gewebe pylori. Sein Gesichtsausdruck war auch höher in CAG als CG in H. positive Gewebe pylori. (N = 75, p < 0,05; 4A-C), die umgekehrt mit miR-204 korreliert. Verwendung von Pearson Korrelationsanalyse SOX4-miR-204-mRNA-Expression, erhalten wir eine statistisch signifikante inverse Korrelation (Abbildung S3A, R = -0,849, p = 0,002). Verwendung von Immunhistochemie, wir auch entdeckt, dass SOX4 Expression signifikant mit Magen-Histologie assoziiert war (p < 0,05; Tabelle 1). In vitro, fanden wir auch, dass SOX4 mRNA und Protein-Ebene wurden in Magenkrebszellen von H. pylori (Abbildung S3B, S3C) infiziert hochreguliert. Wir stellten fest, dann die Expression von SOX4 als Reaktion auf die Veränderungen in der miR-204 Expression. Western-Blot und qRT-PCR-Assays zeigten, dass die Überexpression von miR-204 konnte signifikant die mRNA herunterregulieren und Proteinexpression von SOX4, während der Effekt der Zuschlags von miR-204 war das Gegenteil (Figur 3D). Wir fanden auch, dass die Expression von EMT-Marker, N-Cadherin und E-Cadherin, auch im Zusammenhang mit miR-204-Expression (Abbildung 4E) geändert wurde, die vorgeschlagen, miR-204 den EMT Prozess beeinflussen könnten.

SOX4 ist ein direktes Zielgen von miR-204 in Magenkrebszellen

Obwohl SOX4 hat als direktes Ziel von miR-204 betrachtet, ist es unklar, ob miR-204 kann direkt die 3'-UTR erkennen von SOX4 mRNA. Nach dem vorhergesagten Zielstelle von Targetscan wir kloniert, um das 3'-UTR-Fragment der vorhergesagten Stelle in die pGL3-Luciferase-Reportervektor (pGL3-SOX4) enthält. Die 3'-UTR-Fragment mit mutierten Sequenz innerhalb der vorhergesagten Zielstelle wurde auch als Kontrolle (pGL3-SOX4-mut) kloniert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Co-Transfektion mit miR-204 imitiert und dem pGL3-SOX4 Vektor-Luciferase-Aktivität in SGC-7901-Zellen verringert. Allerdings hat miR-204 imitiert nicht die Wirkung auf die Luciferase-Aktivität, wenn die Zellen mit pGL3-SOX4-mut-Vektor (Abbildung 5) transfiziert wurden. Diese Daten legen nahe, dass SOX4 Gen eine der direkten Ziele von miR-204 war.

Die Überexpression von SOX4 die Wirkung von miR-204 hat auf die Magenkrebszellen Invasion

SOX4 zu bestimmen, die funktionelle Effektor von miR-204 in Magenkrebs Invasion, wir SOX4 überexprimiert mit Lentiviren durch Transfektion und untersucht ihre Auswirkungen in Magenkrebszellen. Überexpression von SOX4 in der Zelllinie wurde durch Western Blotting (6A) bestätigt. Wir fanden auch, dass E-Cadherin wurde herunterreguliert, während N-Cadherin hochreguliert nach PLV-SOX4 Transfektion war. Durch die Wundheilung und die Matrigel Invasionsassay entdeckten wir dann, dass die Überexpression von SOX4 signifikant Zellen Migration und Invasion (6B und 6C) gefördert. Um wurden den Verlust von SOX4 unterdrückt die Proliferation und Invasion von Magenkrebszellen, Zellen mit miR-204 imitiert und SOX4 transfiziert weiter zu demonstrieren, dass miR-204-Überexpression induzierten Vektor zusammen und die Ergebnisse zeigten, dass die Unterdrückung der Migration, Invasion und Proliferation von miR-204 wurde abgeschwächt (Abbildung S4).

Diskussion

Magenkrebs ist eine weltweite Krankheit mit einer hohen Inzidenz, vor allem in Südostasien [21]. Die 5-Jahres-Überlebensrate für Magenkrebs ist ziemlich niedrig. Einige der Magenkrebs-Patienten waren H. pylori in Zusammenhang stehen. Daher ist es notwendig, gründlich die Pathogenese zu untersuchen und neue zielgerichtete Therapien für H. pylori entwickeln Magenkrebs im Zusammenhang.

MiRNAs sind eine große Familie von Gen-Regulatoren, die sich negativ auf ihre Ziel-mRNAs in einer sequenzspezifischen Weise zu regulieren. miRNAs kann auch als Tumorsuppressoren oder Onkogene fungieren [22]. Neuere Erkenntnisse vorgeschlagen, dass miRNAs wichtige Rollen in mehreren biologischen Prozessen im Zusammenhang mit Krebs spielen, einschließlich der Zelldifferenzierung, Proliferation, tumorignesis, Angiogenese, Invasion und Metastasierung [23]. MiR-204 wurde berichtet, um als ein Tumor-Suppressor-und Low-Level-Expression von miR-204 mit einem schlechten prognostischen Phänotyp bei Patienten mit Krebs in Verbindung gebracht wird [24], [25]. Allerdings gab es nur wenige Studien miR-204-Funktion in H. pylori zu untersuchen Magenkrebs im Zusammenhang. Hier waren wir die ersten Beweise vorzulegen, dass miR-204 war signifikant herunterreguliert in H. pylori-positiven Geweben (normale und Tumorgewebe) und die Überexpression von miR-204 unterdrückt SOX4 Proteinexpression und das Wachstum von Zellen, die aus Magentumor.

wir quantifiziert zunächst die Expression von miR-204 in H. pylori-Infektion Gewebe und Kontrollen und wir fanden, dass die miR-204 Expression signifikant niedriger bei H. pylori-infizierten Patienten. Wir fanden auch, daß der Ausdruck auf die Histologie der Patienten in Beziehung steht, das heißt, die Expression von miR-204 ist deutlich geringer in H. pylori-positiven Patienten mit chronisch-atrophische Gastritis als chronische nicht-atrophische Gastritis. Dieses Expressionsmuster zeigten, dass die Möglichkeit, dass miR-204, um verschiedene Arten von Gastritis und die schwereren Patienten waren verwandt ist, wurde die untere die Expression von miR-204. Basierend auf der miR-204-Expressionsniveau, wählten wir SGC-7901 und MKN45 Zellen für die nachfolgende gain-of-Funktion und loss-of-function-Studien sind. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Herabregulierung von miR-204 in Magenkrebszelle ist, um ihr Fortschreiten verwandt. Obwohl eine große Anzahl von menschlichen miRNAs berichtet wurden, bleiben viele ihrer mRNA-Ziele nicht identifizierter [9]. In dieser Studie verwendeten wir eine Kombination der Bioinformatik und der experimentellen Ansatz zu erkennen, dass SOX4 die funktionale nachgeschalteten Ziel von miR-204 sind.

SOX4 überexprimiert wird in verschiedenen Krebsarten und war eng mit der Tumorinvasion und Metastasierung [korreliert ,,,0],16] - [19]. Es ist auch eines der Mitglieder des EMT-Transkriptions Induktoren [26]. EMT ist ein wichtiger Entwicklungsprogramm, das oft während der Tumorprogression aktiviert und Therapieresistenz fördern kann [27]. Zhang et al [20] zeigten, dass die Überexpression von SOX4 in menschlichen Brustepithelzellen auf den Erwerb von mesenchymalen Züge geführt und eine verbesserte Zellmigration und Invasion. Weiterhin SOX4 positiv auf die Expression von bekannten EMT Induktoren reguliert und aktiviert, um die TGF-β-Weg zu EMT [28] beitragen. Bis heute ist EMT ein attraktives Ziel für therapeutische Interventionen, stellt eine neue Basis der Progression von Karzinomen in Richtung dedifferenzierten und maligne Zustände [29]. Unsere Studie zeigte zum einen, dass H. pylori-Infektion induziert miR-204 Down-Regulation zu Magenkrebs durch EMT Prozess führen könnte.

Zum Schluss unsere Beweise darauf hin, dass miR-204 wurde herunterreguliert, während SOX4 war Up- in H. pylori-Infektion und Magenkrebs geregelt. Ektopische miR-204 Expression verringert SOX4 Expression auf der mRNA und Proteinspiegel in der Magenkrebs-Zelllinie. Wir zeigten auch, dass miR-204 direkt an das 3'-UTR von SOX4 gebunden war. MiR-204 Expression EMT über Unterdrückung von SOX4 gehemmt. Darüber hinaus, dass die miR-204-EMT Weg wir für die Behandlung von H. pylori im Zusammenhang mit Krebserkrankungen in einem therapeutischen Ansatz ausgenutzt werden.

identifiziert wurden, können Grundinformationen
Abbildung S1.
(A) Die Expression von 5 miRNAs in H-pylori-positiven und negativen Gewebe durch qRT-PCR nachgewiesen wurde. (B) Die Expression von miR-204 in Tumor- und Kontrollgeweben. (C) Die Expression von miR-204 nach TNM Stadien. (D) Die Expression von miR-204 in drei Arten von H. pylori-infizierten Zellen. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s001
(TIF)
Abbildung S2.
Zellen, die mit miR-204 imitiert und ahmt mit H.-pylori-Infektion und (A) Bewohnbarkeit wurden mit CCK-8-Test (B) Die Bilder bei 0 h (oben) und 24 h (unten) nach der Verwundung fotografiert bestimmt bei einer Vergrößerung von x200 (C) die repräsentativen Bilder von invasiven Zellen am Boden des mit Kristallviolett gefärbt Membran gezeigt wurden, wie gezeigt visualisiert. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s002
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Abbildung S3.
(A) Die relative mRNA-Expression von miR-204 und SOX4, normalisiert mit U6 und GAPDH wurde in 15 Proben von H. pylori beurteilt positive und negative Gewebe durch qRT-PCR. (B) eine inverse Korrelation von SOX4 und miR-204 Expressionsniveaus wurde geprüft (R = -0,920, p = 0,001). (C) Die Expression von SOX4 mRNA wurde durch qRT-PCR in H. pylori-infizierten Zellen bestimmt. (D) Die Expression von SOX4 Proteinebene wurde durch Western-Blot in H. bestimmt infizierten Zellen pylori. (* P < 0,05)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s003
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Abbildung S4.
Zellen, die mit miR-204 imitiert und ahmt mit PLV-SOX4 und (A) Bewohnbarkeit wurden mit CCK-8-Test (B) Die repräsentativen Bilder von invasiven Zellen am Boden des mit Kristallviolett gefärbt Membran bestimmt wurden sichtbar gemacht, wie gezeigt. (C) Die fotografierten Bilder bei 0 h (oben) und 24 h (untere) nach der Verwundung wurden bei einer Vergrößerung von x200 (* p < 0,05) gezeigt
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101457.s004
(TIF)

• PLoS ONE: Trägt Tumorgröße die Genauigkeit der prognostische Vorhersagen in node-negative Magenkrebs (pT1-4aN0M0 Stufe)
• PLoS ONE: D-Dimer: Nicht nur ein Indikator von Venenthrombosen, sondern ein Prädiktor für asymptomatische Hämatogener Metastasierung in Magenkrebs-Patienten