PLoS One: Csökkent a miR-204 H. pylori okozta gyomor- Rák Elősegíti a rákos sejtek szaporodásának és inváziója célzás SOX4

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

A molekuláris mechanizmusa között a Helicobacter pylori (H. pylori) fertőzés és gyomorrák jórészt ismeretlen. Ebben a vizsgálatban meghatároztuk a szerepe miRNS a H. pylori okozta gyomorrákban. Katalógusa

módszerek és eredmények

Azt találtuk, hogy a miR-204-ben csökkent a H. pylori pozitív szövetekben qRT- PCR. Kiütése miR-204 fokozott a invázióját és proliferációját képes a gyomor rákos sejtek in vitro. Iuciferázvizsgáió kiderült, hogy SOX4 volt célgént a miR-204, amelyről megállapították, akár szabályozott H. pylori pozitív szöveteket. Leszabályozza miR-204 és a túlzott kifejeződése SOX4 támogatni epithelialis-mesenchymalis átalakulás folyamatában. Katalógusa

Következtetés katalógusa

Mindent egybevetve, eredményeink igazolták, hogy a miR-204 eljárhat tumorszuppresszorként a H. pylori okozta gyomorrák megcélozva SOX4. katalógusa

Citation: Zhou X, Li L, Su J, Zhang G (2014) csökkent miR-204 H. pylori okozta gyomor- rák Elősegíti a rákos sejtek szaporodásának és invázió a célzás SOX4. PLoS ONE 9 (7): e101457. doi: 10,1371 /journal.pone.0101457 katalógusa

Szerkesztő: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center & Research Institute, Amerikai Egyesült Államok

Beérkezett: március 18, 2014; Elfogadva: június 5, 2014; Megjelent: július 1, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Zhou et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Az adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az összes adatot a megállapításokat alátámasztó teljes mértékben hozzáférhető, korlátozás nélkül. Minden lényeges adat a papír és az azt támogató információs fájlokat. Katalógusa

Forrás: Guoxin Zhang által finanszírozott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 81270476) (http://www.nsfc.gov.cn/). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganat és a második vezető oka a rák okozta halál világszerte [1]. A mai napig, a molekuláris mechanizmusok gyomorrák vizsgálták, azonban ezek még nem teljesen ismert [2]. A gyomor carcinoma kéne fejleszteni szerint egy többlépcsős karcinogene-, amely szoros összefüggésben van a fertőzés bakteriális kórokozó, Helicobacter pylori katalógusa ( H. Pylori katalógusa) [3]. H. pylori
, amely colonizes a gyomor 50% -át a világ népességének, már minősül osztály karcinogén anyagok I., mert a oki szerepet a fejlesztés a gyomorrák [4].

Leírták hogy a fejlődés és progressziója gyomorrák kötődhetnek a mikroRNS (miRNS-ek) [5] - [8]. MiRNS-ek kicsik, nem kódoló RNS-ek, amelyek szabályozzák a célgének expresszióját keresztül transzlációs elnyomás vagy messenger RNS (mRNS) degradáció [9]. MiR-204 namika számoltak társítani a különböző rákos megbetegedések [10], [11]. Azonban keveset tudunk a miRNS-204 funkció gyomorrákban. Matsushima végzett miRNS tömb tanulmány H. pylori pozitív szövetek és ORT és megállapította, hogy a miR-204 expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt a H. pylori pozitív szöveteket. [12] katalógusa

Az embereknél a szexuális meghatározó régió Y (SRY ) box család is hivatkozott a SOX család, áll 20 erősen konzervált transzkripciós faktorok, amelyek fontos szerepet játszanak a fejlesztés a prosztatarák [13]. Ezek a transzkripciós faktorok által meghatározott egy konzervált signature szekvencia a magas Mobility Group (HMG) DNS-kötő domén (DBD) [14], [15]. SOX4 egy 47 kDa-os fehérje erősen konzervált gerincesek és annak klinikai jelentőségét nyert egyre nagyobb figyelmet az utóbbi években, a számos jelentés arra utal, hogy SOX4 hozzájárulhat a tumor progresszióját [16], [17]. Fokozott SOX4 expresszió talált tumorokban a húgyhólyag, a prosztata és a vastagbél, és a nem-kissejtes tüdő daganatok [18] - [21]. Szabályozatlan expressziója SOX4 összefüggésbe hozták a fokozott a rákos sejtek proliferációját, a sejtek túlélését, az apoptózis gátlása és a tumor progresszióját gyomorrákban [22]. A túlzott kifejeződése is kapcsolódik rossz prognózissal a klinikák és ez a marker megjósolni a kimenetelét gyomorrákos betegeknél [23]. Katalógusa

Eddig azonban nem világos, hogy vajon H. pylori fertőzés indukálhat SOX4 kifejezés révén leszabályozza miR-204. Így végre a vizsgálatot, hogy vizsgálja tovább a szerepét a miR-204 és SOX4 H. pylori okozta kialakulásában. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Klinikai minták katalógusa

A betegek vagy nélkül H. pylori fertőzés katalógusa átesett gastroszkóppal The First Kapcsolt Kórház Nanjing Orvostudományi Egyetem, Jiangsu tartomány, Kína 2012 márciusától és 2013. december vett mintákat a 250 beteg (150 rákos betegek és 100 daganatos beteg) gyűjtöttünk, és azonosították a pozitív, amikor a gyors ureáz teszt pozitív lett. Ezek a szelektált betegek is megerősítette ^{13C kilégzési teszt. Jóindulatú betegek soroltuk felszínes gastritis, sorvadásos gyomorhurut és diszplázia szerint patológiai osztályozás. Ezt a protokollt jóváhagyta az Etikai Bizottságának első kapcsolt kórház Nanjing Orvostudományi Egyetem, és minden beteg írásos beleegyezését adta. Katalógusa}

Sejtkultúra katalógusa

SGC-7901 /MKN45 gyomorrák sejtvonalakon ( vásárolt ATCC) tenyésztettünk RPMI-1640 tápközegben, amelyet 10% magzati borjúszérummal (FBS) (Gibico) és penicillin (100 U /ml). A sejteket 37 ° C hőmérsékleten nedvesített atmoszférában, 5% CO _2.

baktérium kultúra és a fertőzés modell

H. pylori oltjuk be a lemezt, és a tenyésztést 37 ° C-on mikroaerofil atmoszférában, 5% O _{2, 10% CO 2, és 85% N 2. 3 nap elteltével a bakteriális felszuszpendáltuk RPMI-1640 közegben FBS nélküli és a fertőzött sejtek MOI 100. Ezután a sejteket összegyűjtöttük 48 óra után a fertőzés.}

izolálása teljes RNS és kvantitatív RT-PCR

Teljes RNS-eket kinyert összegyűjtött szöveteket és sejtvonalak Trizol (Tarkara, Japán), majd mind a miRNS és mRNS-t reverz transzkripcióval cDNS-sé. A reverz transzkripciós végeztük reverz transzkripció reagenskészlet (Takara, Japán). A kifejezés az érett miRNS-ek és a potenciális célgének mértük QRT-PCR SYBR Green PCR készlettel (Takara) BE Applied Biosystems StepOne-Plus Real-Time PCR System és a humán U6-RNS-t amplifikáljuk, mint belső kontroll. A relatív expressziós aránya miR-204 számítottuk ki 2 ^{-ΔΔCT módszerrel. PCR-reakciókat végeztünk az alábbi primerek alkalmazásával: a HSA-miR-204, előre, 5'-CAUCUUCCAGUACAGUGUUGGA-3 'és az U6, előre, 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'. Relatív expressziós szintjének SOX4 mRNS vizsgáltuk SYBR Green valós idejű PCR (RT-PCR), és normalizáltuk GAPDH. A primerek SOX4 voltak előre, 5 'AGCCATCTCGGAGGAATA 3' és fordított, 5 'CAGACAACCGGCCTTTAT 3'; és a GAPDH, előre, 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3 'és reverz, 5'-TTGGCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'. RT-PCR alkalmazásával végeztük az ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (ABI, CA, USA).}

Immunhisztokémia

A szöveteket rögzítettük 4% paraformaldehidben, és kivágott paraffin blokk 5 um vastag. Miután viaszmentesítésével xilollal és rehidratáló egy fokozatos sorozat etanol, tárgylemezeket melegítjük autoklávban három percig citrát nátrium-pufferben (pH = 6,0), és inkubáljuk az antitesttel SOX4 (Cell Signaling Technology) 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át. Blokkoló szérum vagy ellenanyag hígítási puffert használtunk negatív kontrollként. Az antitestek hasznosított előtt ugyanazok voltak, mint a Western-blot-analízis. Fényképeket készítette mikroszkóppal (Nikon Eclipse 50i). A számos pozitív festődés mutató sejtek immunreaktivitását SOX4 tíz reprezentatív mikroszkópos mezőt megszámoltuk, és a pozitív sejtek százaléka is kiszámítottuk. A százalékos pontozási immunreaktív tumorsejtek írták le, a következők szerint: 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%), és a 3. (> 50%). Az intenzitás pontoztuk a következők: 0 (negatív), 1 (gyenge), 2 (közepes) és 3 (erős). Az expressziós szintjének SOX4 mértük szorozni a százalékos és az intenzitás pontszámot. Nagy kifejezés mintákat jelent tumorokban megsokszorozott pontszám meghaladja a 4, míg a többiek alacsonynak tekinthető kifejezés. Katalógusa

A sejt proliferációt assasy katalógusa

A sejtproliferációt vizsgáltuk vízoldható tetrazoliumsó assay segítségével Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japán). Röviden, a sejteket (1,5 × 10 ^{3 /üreg) oltottuk 96-lyukú tenyésztő lemezek három párhuzamosban inkubáljuk 4 napon át 37 ° C /5% CO 2-tartalmú nedvesített inkubátorban. Az életképes sejteket mennyiségileg mindegyik 24 h intervallum mérésével OD450 alkalmazásával mikrotiterlemez-leolvasó (Epoch; BioTek, Winooski, VT).}

A sejteket (2 × 10 ^{6) fixáltuk 75% -os etanollal 4 ° C éjszakán át, majd mostuk hideg PBS-ben, és az oldathoz RNaseI, majd megfestettük propídium-jodiddal 30 percig sötétben. Sejtciklus analízis ezután végzett áramlási citometriával (FACSCalibur, Becton Dickinson, Sparks, MD).}

A sejteket tripszinizáltuk és a sejteket 6 mérőhelyes lemezekre (500 sejt /lyuk), és 2 hétig tenyésztettük. A telepeket megfestjük 1% kristályibolya 30 percig fixálás után 4% -os paraformaldehiddel 30 percig. A telepek száma a meghatározás szerint a > 50 sejt /kolónia megszámoltuk. Három független kísérletet végeztünk. Az adatok segítségével számítottuk ki párosított t-teszt.

Cell migrációs assay (sebgyógyító)

sebgyógyító assay-t alkalmaztunk, hogy értékelje a képességét, tumoros sejtek mozgékonyságát. Röviden, a sejteket (1 * 10 ^{6 /lyuk) oltottuk hat-üregű lemezeken, egy éjszakán keresztül tenyésztünk, és a transzfektált miR-204 utánozza vagy inhibitor, pcDNA-SOX4 vagy pcDNA-NC. A konfluencia elérését, a sejt fázist karcos egy steril műanyag csúcsa és mossuk táptalajt kétszer tenyésztjük ismét legfeljebb 48 a szérum csökkentett tápközegben, amely 1% FBS-t. A rés bezárása mértük, és az adatokat összefoglalta alapuló hatszoros assay minden egyes kísérletben.}

Cell inváziós vizsgálati eljárás

sejtek invázióját aktivitás alkalmazásával értékeltük sejttenyészet lapkák bevonva alapmembrán mátrix (BD Biosciences , Bedford, MA) alkalmazásával a gyártó utasításai. Röviden, összesen 1 × 105 sejt, 0,2 ml szérummentes RPMI-1640 közegben oltottunk egy Transwell berendezésben. RPMI-1640, amely 10% FBS-t (600

• PLoS One: Nincs tumor mérete pontosságának javítása prognosztikus Jóslatok a nyirokcsomó-negatív gyomorkarcinóma (pT1-4aN0M0 Stage)?
• PLoS One: D-dimer: nem csak egy indikátor vénás trombózis, de előrejelzője tünetmentes hematogén metasztázis gyomorrákban Patients