PLoS ONE: intratumorale Hypoxie Fördert Immuntoleranz durch Induzierung regulatorischer T-Zellen über TGF-β1 in Magenkrebs

Abstrakt

Regulatorische T-Zellen (Treg) vermittelten Immunsuppression eine der entscheidenden Tumor Immunevasionsmechanismen repräsentiert und ist ein Haupthindernis für eine erfolgreiche Tumorimmuntherapie. Hypoxie, ein gemeinsames Merkmal von soliden Tumoren hat sich mit einer Potenzierung Immunsuppression in Verbindung gebracht worden, verminderte Ansprechen auf die Therapie, maligne Progression und lokale Invasion. Leider bleibt die Verbindung zwischen Hypoxie und Treg-vermittelten Immuntoleranz bei Magenkrebs schlecht verstanden. In unserer Studie wurden Treg und Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α gefunden miteinander zu positiv korreliert und mit der Tumorprogression erhöht. Eine nachfolgende In-vitro-
Studie zeigte, dass von Magenkrebszellen unter hypoxischen Zustand abgeleitet Stände, könnte die Expression von Foxp3 über TGF-β1 induzieren. Diese Ergebnisse bestätigen die entscheidende Rolle der Tregs als therapeutisches Ziel bei Magenkrebs-Therapie und gaben hilfreiche Gedanken für die Gestaltung der Immuntherapie für Magenkrebs in Zukunft

Citation:. Deng B, Zhu JM, Wang Y, Liu TT, Ding YB, Xiao WM et al. (2013) intratumoralen Hypoxie Fördert Immuntoleranz durch Induzierung regulatorischer T-Zellen über TGF-β1 in Magenkrebs. PLoS ONE 8 (5): e63777. doi: 10.1371 /journal.pone.0063777

Editor: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 10. Januar 2013 beginnen; Akzeptiert: 6. April 2013 beginnen; Veröffentlicht: 27. Mai 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde von der Shanghai Science and Technology Kommission (10410709400, 10411950100), National Nature Science Foundation of China (81000968, 81101540, 81101637 und 81172273) und der National Clinical Key-Sonder von China unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der häufigsten Ursachen von Krebs-Todesfälle weltweit [1]. Trotz erheblicher Fortschritte in der diagnostischen und therapeutischen Ansätzen in den letzten Jahrzehnten, bleibt die Prognose von Magenkrebs trostlos wegen seiner hohen Rezidiv und Metastasierung [2]. Immunozyten sind seit langem als ein Faktor der Förderung des Tumorwachstums in der Tumor-Mikroumgebung [3], aber die zugrundeliegende molekulare Basis bleibt weitgehend rätselhaft erkannt. Ein besseres Verständnis der Mechanismen bei Magenkrebs wird von Vorteil sein, wirksame therapeutische Systeme zu entwickeln.

intratumoralen Hypoxie ist ein gemeinsames Merkmal von soliden Tumoren, die die Progression von Tumoren durch die Aktivierung Schlüssel biochemischen und zellulären Wege beeinflussen könnten [4 ], [5], [6]. Studien zeigten auch, dass Hypoxie eine zentrale Rolle bei der tumorvermittelten spielt Immunsuppression, einen Beitrag der immunologischen Flucht von Tumoren zu erhalten [7], [8]. Vor kurzem wurde in Ovarialkarzinom etabliert eine bestätigte Verbindung zwischen Tumor Hypoxie und Immuntoleranz durch die Rekrutierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs) [9]. Somit wurde eine Hypothese vorgestellt worden, dass Hypoxie Hindernisse für therapeutische Eingriffe immune liefern.

erhöhte Treg wurden in den Kreislauf und Tumorgewebe von Patienten mit verschiedenen Krebsarten, einschließlich Magenkrebs, Dickdarmkrebs, Leberzellkarzinom berichtet und Bauchspeicheldrüsenkrebs [10]. Akkumulieren Daten zeigten auch, dass die Anwesenheit von Treg resultierte in einem erhöhten Risiko für das Fortschreiten von Krebs [11], [12], [13]. Darüber hinaus wird Treg vermittelten Immunsuppression als einer der entscheidenden Immunevasionsmechanismen in Tumor zu sein, wobei sie die Anti-Tumor-Aktivität von CD8 zytotoxischen Zellen, dendritischen Zellen und natürlichen Killerzellen [14] überwinden können. So Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismus der Treg-Anreicherung in Magenkrebs wird für die Ausrichtung Tregs für eine vorteilhafte klinische Ergebnis von Wert sein. Obwohl die Mechanismen nicht gut verstanden sind, haben einige Studien gezeigt, dass TGF-β1 daran beteiligt ist [15].

In dieser Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass Magenkrebs einen selektiven Vorteil durch die Induktion von Treg unter Hypoxie erwerben über TGF-β1-Signalweg dadurch Immunüberwachung zu entziehen. Um unsere Hypothese zu demonstrieren, analysierten wir die Expression von Hypoxie-induzierbaren Faktor 1α (HIF-1α) und Foxp3 in Magenkrebsgewebe, beurteilt die Wirkung von Hypoxie auf TGF-β1-Produktion in Krebszelllinien und erläutert schließlich die Rolle der Hypoxie vermittelnde Treg-Anreicherung in Magenkrebs.

Materialien und Methoden

Patienten und Proben

in Paraffin eingebettet, in Formalin fixierten Tumorschnitte wurden von 99 Patienten mit Magenkrebs erhalten, das wurde eine chirurgische Resektion von Dezember 2006 bis Februar 2008 im Zweiten Clinical Medical School of Yangzhou University. Follow-up-Daten wurden ab Oktober 2012 mit einem medianen Follow-up von 53 Monaten (Bereich 4-70 Monate) zusammengefasst. Das Gesamtüberleben (OS) wurde ab dem Zeitpunkt der Operation definiert zum letzten Follow-up oder Zeitpunkt des Todes.

Periphere Blutproben wurden vor von 20 Patienten mit Magenkrebs 1 Tag gesammelt und 10 Tage nach der Operation von Juli 2012 bis Oktober 2012 Sera bei -80 ° eingefroren wurden C unmittelbar nach der Zentrifugation für die zukünftige Verwendung. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden sofort von einem Ficoll-Dichtegradienten isoliert.

Keiner der Patienten Immunsuppressiva oder Chemotherapie vor der chirurgischen Resektion erhalten hatte. Die Studie wurde von der Ethikkommission (Ethikkommission der zweiten klinischen Medical School of Yangzhou University, Yangzhou) genehmigt, und eine schriftliche Zustimmungen wurden von allen Studienteilnehmern erhalten.

immunhistochemischen Färbung

Serienschnitte (5 um) von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettete Proben wurden hergestellt. Die Schnitte wurden in abgestuften Alkohol entparaffiniert und rehydratisiert. Antigen Retrieval wurde durch Behandeln der Objektträger in EDTA-Puffer in einer Mikrowelle für 10 Minuten durchgeführt. Kaninchen-anti-human HIF-1α primären Antikörper (Bioworld, USA), Maus-anti-Human-TGF-β1-Antikörper (Santa Cruz, USA) und Maus-anti-human-Antikörper Foxp3 (Abcam, USA) wurden die primären Antikörper verwendet. Diaminobenzidin (DAB) wurde für das Substrat folgende Gegenfärbung mit Hämatoxylin für einzelne Färbung verwendet. Doppelfärbung wurde mit 2 verschiedenen Chromogene ausgeführt. DAB Chromogen (braune Farbe) für HIF-1α und schnell rot Chromogen (rote Farbe) für TGF-β1 oder Foxp3

Immunoreactivity Scoring

HIF -1α Kernfärbung wurde nach der beschriebenen Methode [16], Färbung Score = Intensität der Immunreaktivität (IR) × Anteil der positiv gefärbten Zellen ausgewertet. IR-Intensität wurde in vier Kategorien geschichtet: 0, keine IR; 1, schwach IR; 2, mäßig starke IR; und 3, starker IR. Der Anteil der positiven Zellen wurde in fünf Gruppen eingeteilt: 0, keine Färbung; 1, < 2% Färbung; 2, 2-10% Färbung; 3, 11-29% Färbung; und 4 >. 30% Färbung

Eine modifizierte Scoring-System wurde für Foxp3 ^{+ Zellen verwendet [17]. Zehn Felder wurden bei hoher Leistung für Foxp3 gezählt. Die absolute Zahl der Lymphozyten pro High-Power-Bereich (HPF 400) bestimmt. Die mittlere Anzahl der positiven gefärbten Zellen pro Hochleistungsfelder berechnet.}

Zellkultur und Hypoxie Induktion

menschlichen Magenkrebszelllinien, AGS und BGC823, aus dem Shanghai Institute of Cell erhalten Biologie, chinesische Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China). Alle Zellen wurden in 5% CO _{2 bei 37 ° C in DMEM oder RPMI 1640 (HyClone Tianjin, China), ergänzt mit 10% FBS (Gibco, Australien), 100 U /ml Penicillin und 100 mg /ml Streptomycin propagiert ( HyClone Tianjin, China). Für Hypoxie-Experimente wurden die Zellen in 6-Well-Platten zweimal mit PBS gewaschen, wenn sie 60-80% Konfluenz wuchs, gehalten in einem serumfreien AIMV Medium (Invitrogen, USA) für eine Inkubation über Nacht und dann in einem modularen platziert Inkubatorkammer (Ruskinn Works, YK) für 24 h unter hypoxischen (1,0% O 2) oder normoxischen (21% O 2) Bedingungen, die beide mit 5% CO 2 bei 37 ° C. Überstände wurden bei -80 ° C für die spätere Bestimmung der Konzentrationen von TGF-β1 und für die Co-Kultur-Assay gesammelt und gespeichert. Alle In-vitro-
Validierungsexperimente wurden mindestens dreifach durchgeführt.}

Immunofluoreszenz

Die Zellen (1 x 10 ^{5 /Vertiefung) auf Deckgläser in ein plattiert 24-Well-Platte für eine 24-h-Kultur. Anschließend wurden sie für 30 min in kaltem Methanol fixiert weitere 30 min permeabilisiert mit 0,5% TritonX-100 zu sein. Zellen wurden 30 min dreimal, blockiert mit 10% Ziegenserum in PBS gewaschen und inkubiert mit Anti-Human-TGF-β1-Antikörper (Santa Cruz, USA) und anti-human HIF-1α-Antikörper (Epitomics, USA) in einem Gefrierschrank bei über Nacht 4 ° C. Der primäre Antikörper wurde mittels Alexa488-konjugiertem zweiten Antikörper (Invitrogen, USA) und Alexa Fluor 594-konjugiertem zweiten Antikörper (Invitrogen, USA), die jeweils detektiert. Die Deckgläser wurden unter OLYMPUS florescence Mikroskopie untersucht.}

RNA-Extraktion und quantitative Real-time PCR (qPCR)

Jeder der beiden Zelllinien oben beschrieben, in drei Vertiefungen unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen kultiviert wurde , wie oben beschrieben. Gesamt-RNA wurde sofort aus normoxischen oder hypoxischen Zellen am Ende des Experiments isoliert, unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen, USA). Gesamt-RNA (5 ng) wurde revers transkribiert unter Verwendung von cDNA Reverse Transkription-Kits (Takara, Dalian, China), entsprechend den Anweisungen des Herstellers. qPCR wurde in einem SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Dalian, China) durchgeführt. Falten Sie Veränderungen in der Expression von jedem TGF-β1 mRNA relativ zu GAPDH wurden auf der Schwellenzyklus (Ct) als 2 ^{-Δ (ACt) berechnet, wobei ACt = Ct _{Ziel - Ct GAPDH und Δ (ACt) = ACt Hypoxie - ACt Normoxie. Die TGF-β1-Primer waren: vorwärts, 5'-GCCAG AGTGG TTATC TTTTG ATG-3 '; umkehren, 5 'AGTGT GTTAT CCCTG CTGTC AC-3' und die GAPDH-Primer waren: vorwärts, 5 'GGACC TGACC TGCCG TCTAG AA-3'; umkehren, 5'-GGTGT CGCTG TT GAAGT CAGAG-3 '. qPCR wurde in dreifacher Ausfertigung.}}

Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA)

Die Konzentration von TGF-β1 in den Kulturüberständen und Seren durchgeführt wurde bestimmt mit einem ELISA-Kit (eBioscience, San Diego mit, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Isolierung und Kultur von T-Zellen

PBMCs von Spendern wurden indirekt mit Biotin-Antikörper bocktail markiert und Anti-Biotin-MicroBeads. CD4 ^{+ T-Zellen wurden durch negative Selektion getrennt nach den Anweisungen des Herstellers (Miltenyi Biotec, Deutschland). CD4 + T-Zellen wurden direkt markiert mit CD25-Mikroperlen und CD4 + CD25 - T-Zellen durch negative Selektion isoliert wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Reinheit > 95%; Miltenyi Biotec, Deutschland) . Die Überstände aus kultivierten AGS-Zellen unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen gesammelt wurden verdünnt mit frischem AIMV Medium (1.03), die so genannte normoxic Medium und hypoxischen Medium sind. Insgesamt 1,0 x 10 6 /ml CD4 + CD25 - T-Zellen wurden stimuliert mit Anti-CD3 /CD28-beschichteten Kügelchen (01.05; Invitrogen, USA) ± IL-2 (200 U /ml; Peprotech) für 72 h in AIM-V serumfreies Medium (Kontrollmedium), normoxischen oder hypoxischen Medium Medium. In einigen Experimenten wurden rekombinantes menschliches TGF-β1 (2 ng /ml; R & D Systems, USA) und TGF-β1-Rezeptor-Kinase-Inhibitor, LY-364.947. (5 uM; Merck, Deutschland) wurden zu den Kulturen hinzugefügt}

Durchflusszytometrie

Phänotyp Analyse von Tregs wurde mit einem BD FACS AriaII ausgeführt Durchflusszytometer (BD, USA). Kurz gesagt, wurden die Zellen mit CD4-FITC und Foxp3-PE (eBioscience, San Diego, CA) nach dem Protokoll des Herstellers markiert. Um zu analysieren, um die Prävalenz von Treg, CD4 ^{+ Foxp3 + T-Zellen nach der Gating auf CD4 ausgewertet + T-Zellen und wurden als ein Prozentsatz der gesamten CD4 + T-Zellen exprimiert.}

Statistische Analyse

wurden Statistische Analysen auf SPSS 17.0 für Windows durchgeführt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit einem one-way ANOVA, Mann-Whitney-U-Test oder χ ^{2-Test analysiert, gegebenenfalls. Die Korrelation wurde durch ein Pearson-Korrelationssucht. Kumulative Überlebenszeit wurde über Kaplan-Meier und analysiert über das Log-Rank-Test berechnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM. Die statistische Signifikanz wurde eingestellt auf P
. ≪ 0,05}

Ergebnisse

• PLoS ONE: Die miR-184 Binding-Site-rs8126 T > C Polymorphismus in TNFAIP2 ist im Zusammenhang mit Risiko von Magen Cancer
• PLoS ONE: Kurzfristige klinische Implikationen der Accessory linken Leberarterie bei Patienten Radical Gastrektomie für Magen Cancer