PLoS ONE: S100A6 Protein negativ Reguliert CacyBP /SIP-vermittelte Hemmung der Magenkrebs-Zellproliferation und Tumorigenesis

Abstrakt

Calcyclin-bindendes Protein (CacyBP /SIP), auf der Grundlage ihrer Fähigkeit identifiziert, zur Interaktion mit S100 Proteine ​​in einer Calcium-abhängigen Weise wurde zuvor gefunden, die Proliferation und Tumorgenese von Magenkrebszellen in unserem Labor zu hemmen. Wichtig ist, bleiben die Auswirkungen der S100-Proteine ​​auf das biologische Verhalten von CacyBP /SIP bei Magenkrebs unklar. Wir berichten hier über die Konstruktion von eukaryotischen Expressionsvektoren für Wildtyp CacyBP /SIP und ein verkürztes Mutante die S100-Protein-Bindungsdomäne (CacyBP /SIPΔS100) fehlt. Die Ausdrücke des Wildtyp und verkürzten rekombinanten Proteine ​​wurden durch Transfektion von MKN45 Magenkrebszellen nachgewiesen. Co-Immunopräzipitation Assays gezeigt Interaktion zwischen S100A6 und Wildtyp CacyBP /SIP in MKN45 Zellen. Die Entfernung des S100-Protein-Bindungsdomäne reduziert drastisch die Affinität von CacyBP /SIP für S100-Proteine, wie durch reduzierte Coimmunpräzipitation von S100A6 durch CacyBP /SIPΔS100 angegeben. Der MTT-Test, FACS-Test wurden Klonogentest und Tumorxenotransplantates Experiment durchgeführt, um die Wirkung von CacyBP /SIP auf das Zellwachstum und tumorigenesis In-vitro-
und in vivo
zu beurteilen. Die Überexpression von CacyBP /SIP hemmte die Proliferation und Tumorgenese von MKN45 Magenkrebszellen; die Proliferation und tumorigenesis Raten wurden noch weiter durch die Expression von CacyBP /SIPΔS100 reduziert. Wir zeigten auch, dass S100 Proteine ​​negativ CacyBP /SIP-vermittelte Hemmung der Magenkrebs-Zellproliferation, die durch eine Wirkung auf die β-Catenin-Protein-Expression und Transkriptionsaktivierung von TCF /LEF regulieren. Obwohl der zugrunde liegende Wirkungsmechanismus eine weitere Untersuchung erfordert, bietet diese Studie neue Einblicke in die Interaktion zwischen S100-Proteinen und CacyBP /SIP, die unser Wissen über die S100-Proteine ​​bereichern könnten und für unser Verständnis der Entwicklung von Magenkrebs nützlich sein.

Citation: Ning X, Sun S, Zhang K, Liang J, Chuai Y, Li Y, et al. (2012) S100A6 Protein negativ reguliert CacyBP /SIP-vermittelte Hemmung der Magenkrebs-Zellproliferation und Tumorigenesis. PLoS ONE 7 (1): e30185. doi: 10.1371 /journal.pone.0030185

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Italien in

Empfangen: 27. Oktober 2011; Akzeptiert: 15. Dezember 2011; Veröffentlicht: 25. Januar 2012

Copyright: © 2012 Ning et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie wurde durch Zuschüsse von National Nature Science Foundation of China (Nr 30872964, Nr 30772461) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

S100-Proteine ​​sind die größte Untergruppe innerhalb der EF-Hand Ca ^{2 + -bindende Proteinfamilie und werden von ihren zell- und gewebespezifische Expressionsmuster charakterisiert. Diese Proteine ​​sind dafür bekannt, intrazelluläre Prozesse regulieren, wie beispielsweise die Zellzyklusübergang und das Zellwachstum, Differenzierung und Motilität [1]. Ein einzigartiges Merkmal dieser Proteine ​​ist, dass einzelne Mitglieder in spezifischen zellulären Kompartimenten lokalisiert sind, von denen einige in der Lage sind, auf Ca 2 + Aktivierung [2], [3] zu verlagern. Nach Translokation kann diese Proteine ​​die Ca 2 + Signal in einem zeitlichen und räumlichen Weise transduzieren durch mit unterschiedlichen S100-Protein-spezifische Ziele zu interagieren. Interessanterweise sind die meisten S100 Gene in einem Gen-Cluster auf dem menschlichen Chromosom 1q21, ein Ort der häufigen Chromosomenanomalien in [4]. Dieser Verband schlägt vor, eine Verbindung zwischen Chromosomenanomalien und die Deregulierung der S100 Genexpression in verschiedenen Tumoren. Bis heute haben viele Mitglieder der S100-Familie identifiziert worden, mit der Tumorentstehung und Metastasierung assoziiert ist [5], [6]. Jedoch werden die genaue Rolle und Bedeutung der S100-Proteine ​​in der Entwicklung und Förderung von Krebs schlecht verstanden. Verständnis der biologischen Funktion (en) der S100-Proteine ​​werden auf die Identifizierung von S100 Proteinzielen abhängen. Bis jetzt sind mehrere mögliche Proteinzielen, einschließlich Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Annexin II, Annexin VI, Annexin XI, Caldesmon und CacyBP /SIP, gezeigt wurde, mit S100-Proteine ​​ in vitro
in einem zu interagieren Ca 2 + -abhängigen Weise [5], [7].}

Calcyclin-bindendes Protein (CacyBP /SIP), ein 30 kDa-Protein auf der Basis ihrer Fähigkeit identifiziert, mit S100A6 in einem zu interagieren Ca ^{2 + -abhängig in Ehrlich-Aszites-Tumor (EAT) Zellen [8], die zuvor als Mehrfacharzneimittelresistenz (MDR) -related Molekül gedacht wurde, bei Magenkrebs in unserem Labor [9]. Durch Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen CacyBP /SIP [10], haben wir, dass die Überexpression von CacyBP /SIP gezeigt, um die Proliferation und Tumorgenese von Nierenkrebszellen hemmt [11]. Weitere Studie hat vorgeschlagen, dass CacyBP /SIP das Wachstum von Magenkrebs unterdrückt [12]. Trotz dieser Fortschritte bleiben die Auswirkungen der S100-Proteine ​​auf CacyBP /SIP bei Magenkrebs unklar. Darüber hinaus über die Bindung SIAH1 und Skp1 sein Bestandteil einer Ubiquitinierung Anlage [13] CacyBP /SIP wurde. Und diese Ligase wurde beschrieben, den Abbau von nicht-phosphorylierten β-Catenin [13] zu regulieren.}

CacyBP /SIP könnte binden S100, SIAH1 und Skp1 von verschiedenen Regionen. Die N-terminale Region (aa 1-80) von CacyBP /SIP wurde SIAH1 haben Affinität gezeigt. Die C-terminale Region von CacyBP /SIP (aa178-229) ist bekannt, eine α-Helix zu bilden; Die Domain wird mit S100-Proteine, einschließlich S100A6 [14] in Wechselwirkung treten. Skp1 Bindungsdomäne überlappen, nicht mit dem S100-Bindungsregion und Skp1 bindet an das Mittelteil (aa78-155) von CacyBP /SIP [15], [16]. Um die Auswirkungen der S100-Proteine ​​auf das biologische Verhalten von CacyBP /SIP bei Magenkrebs zu beobachten, eukaryotische Expressionsvektoren für Wildtyp CacyBP /SIP und seiner verkürzten Mutante die S100-Protein-Bindungsdomäne (CacyBP /SIPΔS100) fehlten erfolgreich aufgebaut und effektiv ausgedrückt in MKN45 Zellen. Ein MTT-Test, FACS-Assay, Experiment Klonogentest und Tumorxenotransplantates wurden durchgeführt, um die Auswirkungen von CacyBP /SIP auf das Zellwachstum zu bewerten und tumorigenesis beide In-vitro-
und in vivo
. Die Ergebnisse dieser Studien können zur Aufklärung über die Auswirkungen der S100-Proteine ​​auf das biologische Verhalten von CacyBP /SIP in Magenkrebszellen beitragen.

Materialien und Methoden

Die Zelllinien und Tiere

die MKN45 Magenkrebs-Zelllinie, die den geringsten Ausdruck von CacyBP /SIP zu sein in unserer früheren Studie [12], wurde in unserem Labor aufbewahrt gefunden wurde. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, Penicillin (100 U /ml) und Streptomycin (100 ug /ml) in einem CO _{2 Inkubator (Forma Scientic, Marjetta, OH, USA). Balb /c Nacktmäusen bei 4-6 Wochen alt waren, waren von der Shanghai Cancer Institute für die zur Verfügung gestellt in vivo
tumorigenesis Studie. Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche der Vierten Military Medical University (: 11016 Zulassungsnummer) zugelassen. Alle Operation wurde unter Natriumpentobarbital Betäubung durchgeführt und wurde jede Anstrengung unternommen Leiden zu minimieren.}

Immunfluoreszenzfärbung

Die Zellen wurden auf gereinigte Deck plattiert und für 20 Minuten bei Raum mit 95% Alkohol fixiert Temperatur. Die Zellen an den Deckgläsern wurden mit PBS gewaschen und 10 min mit 0,5% Triton X-100 in PBS permeablized. Die Zellen wurden mit anti-S100A6-Antikörper (verdünnt 1:2000) inkubiert, nachdem sie mit 3% Rinderserumalbumin für 1 h blockiert. Die Zellen wurden dann mit FITC-konjugiertem anti-Maus-IgG (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, USA) inkubiert und montiert auf Glasobjektträger mit einer Mischung aus Glycerin und Polyvinylalkohol enthält, DABCO (1,4- diazobicylo- [2,2 , 2,] - Oktan). Immunofluoreszenz wurde mit einem MRC-1024 Laser-Scanning-konfokale Imaging System (Bio-Rad) analysiert.

Plasmidkonstruktion und Transfektion von Zellen

Oligonukleotidprimer enthält, die Eco
RI oder Eco RV Restriktions
Site wurden synthetisiert, jeweils für die Amplifikation der Sequenz von CDS CacyBP /SIP oder eine C-terminale Deletion (aa178-229) Mutante von CacyBP /SIP (Accession AF_314752). Die beiden Primer waren: 5'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3 '(sense) und 5' gcgatatctcaaaattccgtgtctcctttg 3 '(anti-sense); 5 'gggaattcgaatatggcttcagaagagcta 3' (sense) und 5 'ccgatatcacacaatataagaactgta 3' (anti-sense), respectively. Die PCR-Bedingungen waren: 5 min bei 94 ° für die anfängliche Denaturierung, gefolgt von 35 Zyklen von 45 sec bei 94 °, 45 s bei 60º und 60 s bei 72 °, mit einer endgültigen Verlängerung von 10 min bei 72 °. Die Längen der PCR-Produkte waren 687 bp für CDs, und 534 bp für die C-terminale Deletion. Jedes PCR-Produkt mit wurde ausgeschnitten EcoR
I und EcoR
V Restriktionsverdau und kloniert in ebenfalls verdaut pFLAG-CMV. Die neuen Vektoren wurden pFLAG-CacyBP (Wildtyp) und pFLAG-ΔS100 (CacyBP /SIPΔS100) benannt. Die Insert-Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Zelltransfektion wurde mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durchgeführt, wie vom Hersteller beschrieben. Kurz gesagt, wurden Zellen ohne Antibiotika zu 70-90% Konfluenz plattiert und gezüchtet. Sie wurden dann mit 1 ug pFLAG-CacyBP oder pFLAG-ΔS100 transfiziert. Bei 24 h nach der Transfektion G418 (350 mg /ml) wurde zu dem Kulturmedium für die Selektion von transfizierten Zellen zugegeben. Mischklone wurden für weitere 6 Wochen expandiert. Zellen, transfiziert mit leerem Vektor, pFLAG-CMV, wurden als negative Kontrolle verwendet. Diese stabilen Zelllinien wurden genannt MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 und MKN45-pFLAG für den Wildtyp, abgeschnitten und negativen Kontroll-Transfektanten sind.

Co-Immunpräzipitation

Die MKN45 Transfektanten waren in PBS gewaschen, geerntet und in einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM MgCl _{2, 150 mM NaCl, 0,2 mM EGTA und 1% Nonidet P-40 auf Eis lysiert. Die Extrakte wurden bei 12.000 rpm für 25 min bei 37 ° in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Überstände wurden für eine Immunpräzipitation Assay nach der Zugabe von Protease-Inhibitoren (10 mg /L Leupeptin, 5 mg /l Aprotinin, 20 mg /L Sojabohnen-Trypsininhibitor, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) und quantifiziert durch die Bradford-Methode verwendet. Die Überstände wurden mit 30 &mgr; l Protein-A /G-Sepharose und 1 &mgr; g nicht verwandten Antikörper für 1-3 h bei 37 ° (pre-Clearance) inkubiert. Die ungebundenen Fraktionen wurden dann mit Serum mit Antikörpern gegen CacyBP /SIP für 1,5 h bei 4 ° inkubiert. Die Mischung wurde dann mit zusätzlichem Protein A /G-Sepharose über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das Harz wurde dann dreimal in einem Puffer, 20 mM Tris- HCl (pH 7,5) und 150 mM NaCl enthielt, zweimal in einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 500 mM NaCl und schließlich in 20 mM Tris -HCl bei pH 7,5. Alle Puffer, die verwendet wurden, wurden mit Proteaseinhibitoren ergänzt. Das Harz und die gebundenen Proteine ​​wurden in einem SDS-Probenpuffer solubilisiert, für 5 min gekocht bei 98 °, und auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Die Expression von S100A6 wurde analysiert durch Western Blotting mit Antikörper gegen S100A6.}

Western-Blot

Die Zellen wurden auf Eis in einem Puffer, der gesammelt und lysiert [50 mmol /l Tris-Cl (pH-Wert 7.5), 150 mmol /L NaCl, 0.2 mmol /l EDTA, 1 mmol /L PMSF und 1% NP 40] und dann mit dem Bradford-Methode quantifiziert. Ein Maß für 100 ug Lysaten wurde in 10% SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran elektrophoretisiert. Die Membranen wurden mit 10% fettfreie Milch bei Raumtemperatur über Nacht für 2 h inkubiert und mit Anti-CacyBP (1:1500) und anti-β-Actin-Antikörper (Sigma, 1:5000) bei 4 ° blockiert. Nach dreimaligem Waschen für jeweils 15 min in TBS mit 0,1% Tween 20 (TBST) ergänzt wurde die Membran mit Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Maus /Kaninchen-IgG-Antikörper (Amersham-Pharmacia Biotech, Beijing, China) für 2 h bei Raum inkubiert Temperatur. Verbesserte Chemilumineszenz (Amersham, Freiburg, Deutschland) wurde für den Nachweis verwendet.

Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) Assay

Die Zellen wurden ausgesät auf eine 96-Well-Platte bei 2,5 x 10 ^{3 Zellen /Vertiefung in RPMI 1640-Medium, 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum enthält. Jede Probe hatte drei Wiederholungen. Das Medium wurde 6 Tage lang bei 2-Tages-Intervallen ersetzt. Die Zellen wurden mit 50 ul 0,2% MTT für 4 h bei 37 ° C in einem 5% CO _{2 -Atmosphäre inkubiert. Folgende MTT Inkubation ein 150 ul Aliquot von 100% DMSO wurde zu jeder Kultur zugegeben, um die Kristalle aufzulösen. Lebensfähige Zellen wurden jeden Tag durch das Lesen der Absorption bei 490 nm unter Verwendung eines 96-Plattenleser, BP800 (Dynex Technologies, Chantilly, VA).}}

Zellzyklusanalyse

Subkonfluierende Zellen gezählt wurden gewaschen mit eiskaltem PBS, in 0,5 ml Ethanol suspendiert und dann bei 4 ° C für 30 min. Die Suspension wurde durch ein 50 um-Nylonnetz filtriert, und der DNA-Gehalt von gefärbten Kerne wurde mit einem Durchflusszytometer (EPICS XL, Coulter, Miami, FL) analysiert. Der Zellzyklus-Profil wurde Multicycle-DNA Cell Cycle Analysiert Software analysiert. Die proliferative Indizes (PI) wurden wie folgt berechnet:. PI = (G2 + S) /(G1 + S + G2)

Klonogentest

, um die Proliferationsrate einer einzelnen Zelle zu messen in-vitro-
, Platte klonogenen und Soft-Agar klonogenen Assays wurden durchgeführt [17]. klonogenen Assay für die Platte, 1 × 10 ^{3 Zellen wurden in eine 9 cm-Schale und kultiviert in RPMI 1640-Medium für zwei Wochen für die Koloniebildung zu ermöglichen. Die Kolonien wurden in 70% Ethanol fixiert, mit Giemsa-Lösung und gezählt. Für den Weichagar klonogenen Assay wurden die Zellen abgelöst und in 0,3% Agarose mit einer 0,5% Agarose-Unterlage (1 × 10 3 /Well in einer 24-Well-Platte) plattiert. Die Zahl der Herde > 100 &mgr; m wurde nach 20 Tagen gezählt}

Das Tumorwachstum in Nacktmäusen

logarithmisch wachsende Zellen (1 × 10 ^{7-Zellen) wurden in 0,1 Trypsin behandelt, erneut suspendiert. ml D'Hanks-Lösung und in den Hals hypodermia jedes athymischen Nacktmaus injiziert. Die Mäuse wurden dann für Tumorvolumen, allgemeine Gesundheit überwacht wird, und die Gesamtkörpergewicht. Die Größe der Masse subkutanen Tumor wurde fünf Wochen nach Abgreifhöhe gemessen. Das Tumorvolumen wurde nach der folgenden Formel berechnet: 0,5 × Länge × Breite 2. Jede Versuchsgruppe bestand aus fünf Mäusen.}

Reporter-Gen-Assay

Um die Wirkung von CacyBP /SIP und CacyBP /SIPΔS100 auf der Transkriptionsaktivität von TCF /LEF-Assay wird die Reportergen-Assay wurde durchgeführt, wie beschrieben [18]. Kurz gesagt, wurden mit cotransfiziert in Zellen einer 24-Well-Platte (50.000 Zellen pro Vertiefung) oder ohne pFLAG-CMV, pFLAG-CacyBP, pFLAG-ΔS100 und dem Reporter-Plasmid, pTOPFLASH, unter Verwendung von Wildtyp-Tcf /Lef-Bindungsstellen enthalten, Lipofectamine 2000; pRL-TK Renilla
Luciferase-Reporter diente als Kontrolle für die Transfektionseffizienz. Die Luciferase-Aktivität wurde in einem Luminometer unter Verwendung des Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega, Southampton, U.K.) gemessen und quantitativ bestimmt. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und zweimal wiederholt durchgeführt. Ergebnisse sind als Mittelwert des Verhältnisses zwischen der Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität und die Renilla-Luciferase-Aktivität ausgedrückt.

Statistical analysis

Alle Daten wurden analysiert unter Verwendung des SPSS Statistiksoftware (SPSS, Inc., Chicago, Illinois), und P
< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Bedeutung des Unterschieds in der Häufigkeit von CacyBP /SIP-positive Anfärbung zwischen benachbarten Tumorproben und Tumoren wurden durch Chi-Quadrat-Test analysiert. Student t
Test und Einwegvarianzanalyse und Dunnett-Mehrfachvergleichstests gefolgt wurden für die Analyse anderer Daten verwendet werden.

Ergebnisse |

Endogene Expression von S100A6 in Magenkrebs Zelllinie MKN45

S100A6 wurde als Modell ausgewählt, um die Wirkung der S100-Proteine ​​auf die biologische Funktion von CacyBP /SIP zu beobachten. Die endogene Expression von S100A6 in MKN45 Magenkrebs-Zelllinie wurde zunächst durch Western-Blot und Immunfluoreszenz-Färbung nachgewiesen. Wie in gezeigt. 1A, S100A6 wurde in MKN45-Zellen exprimiert. Immunfluoreszenzfärbung zeigt an, dass S100A6 hauptsächlich in der Kernmembran verteilt wurde mit sehr wenig im Kernplasma der MKN45 Zellen gefunden (Abb. 1B).

Die Wechselwirkung von S100A6 und CacyBP /SIP in Magenkrebszellen MKN45

in einem früheren Bericht, CacyBP /SIP, die auf einem relativ niedrigen Niveau in MKN45 Zellen wurde in mehrere verschiedene Arten von Magenkrebs-Zelllinien [12] weit, ausgedrückt wurde. Um die Wechselwirkung zwischen S100A6 und CacyBP /SIP, Wildtyp und Mutante (aa178-229) CacyBP /SIP-cDNAs wurden kloniert in die pFLAG-CMV-Vektor und stabil transfizierte in MKN45 Zellen zu bewerten. Wir untersuchten die Expression von CacyBP /SIP in diesen stabilen Zelllinien durch Western-Blot. Wie in gezeigt. 2A, FLAG-markierten CacyBP /SIP erkannt wurde in der Wildtyp und Mutante CacyBP /SIP-Transfektanten mit Anti-Flag-Antikörper, während kein Signal in den Zellen gefunden wurde, mit leerem Vektor transfiziert.

Die Interaktion zwischen S100A6 und CacyBP /SIP in Transfektanten MKN45-Zellen wurde dann durch Co-Immunpräzipitation ausgewertet. Nach der Inkubation mit anti-CacyBP Antikörper wurden Immunpräzipitat von S100A6-Antikörper nachgewiesen. Wie in gezeigt. 2B, eine Wechselwirkung zwischen S100A6 und Wildtyp CacyBP /SIP in MKN45-CacyBP Zelllysaten beobachtet wurde; jedoch mutant CacyBP /SIP, die aus der aa178-229 Region trunkiert wurde, erzeugt wenig Signal in dem Co-Immunpräzipitationstest. Daher wurde das trunkierte Mutante CacyBP /SIP CacyBP /SIPΔS100 genannt und stellt ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Effekte von S100A6 auf das biologische Verhalten von CacyBP /SIP in Magenkrebszellen.

Effekte von S100A6 auf die Zellproliferation induziert durch CacyBP /SIP in der Linie Magenkrebszelle MKN45 in-vitro-

MTT und FACS-Assays durchgeführt wurden, um die Wirkung von S100A6 auf die Zellproliferation von CacyBP /SIP in MKN45 Zellen induziert zu untersuchen in-vitro-
. Im Vergleich zu den leeren Vektor-Transfektanten, MKN45-pFLAG, sowohl Wildtyp und CacyBP /SIPΔS100 Transfektanten zeigten eine signifikant verminderte Raten der Zellproliferation durch den MTT-Assay ( P
< 0,05) (Abb. 3A). CacyBP /SIPΔS100 Transfektanten zeigte jedoch eine deutlich verringerte Wachstumsrate im Vergleich zu Wildtyp-CacyBP /SIP-Transfektanten ( P
< 0,05).

Die Ergebnisse der Zellzyklus-Analyse durch FACS in ähnlicher Weise zeigen, dass der Überexpression entweder Wild oder mutierten CacyBP /SIP reduziert MKN45 Proliferation. Jedoch war die durchschnittliche proliferative Indizes (PI) von MKN45-ΔS100 Zellen (0,19 ± 0,03) niedriger als die von MKN45-CacyBP Zellen (0,29 ± 0,02) ( P
< 0,05) (Fig. 3B) . Zusammengenommen zeigen diese Daten stark, dass Wildtyp CacyBP /SIP, die Proliferation von MKN45 Zellen hemmt, während CacyBP /SIPΔS100 diese Hemmung der Proliferation intensiviert.

Effekte von S100A6 auf tumorigenesis induziert durch CacyBP /SIP im MKN45 Magenkrebs-Zelllinie in-vitro-
und in vivo

Anchorage-unabhängiges Wachstum ist eine wichtige Eigenschaft von in-vitro-
Tumorwachstum. Daher untersuchten wir, ob upregulation von CacyBP /SIP-Expression in den Medien und Soft-Agar MKN45 Zellwachstum gehemmt. Wie in gezeigt. 4A und B, CacyBP /SIP-Expression resultierte in einer deutlichen Reduktion der MKN45 Zellwachstum in einem Koloniebildungstest mit einer durchschnittlichen Reduktion von 32,1% in der mittleren und 62,0% in Weichagar ( P
< 0,05) . Allerdings Transfektion von CacyBP /SIPΔS100 führte zu einem noch größeren Rückgang des Wachstums mit einer durchschnittlichen Abnahme der Preise von 84,2% in mittleren und 82,8% in Soft-Agar ( P
< 0,01).

um diesen Effekt zu bestätigen in vivo
, wir MKN45-CacyBP, MKN45-ΔS100 und MKN45-pFLAG Zellen um den Hals hypodermia von Nacktmäusen subkutan injiziert. Nach drei Wochen war der durchschnittliche Tumorvolumen in jeder Gruppe von dem der anderen signifikant unterschiedlich. In der 5 ^{th Woche, die durchschnittliche Tumorvolumen in der MKN45-pFLAG Gruppe betrug 776,9 ± 90,9 mm 3, die als die der MKN45-CacyBP Gruppe signifikant ist (578,9 ± 51,2 mm 3 () P
< 0,05), und sogar mehr als das der MKN45-ΔS100 Gruppe (364,9 ± 71,9 mm 3) ( P
< 0,05) (Abb. 4C).}

Effekte von S100A6 auf CayBP /SIP-vermittelte β-Catenin-Abbau

Als eine Komponente des Ubiquitin-Ligase-Komplex, CacyBP /SIP in den Abbau von unphosphoryliertem β-Catenin durch beteiligt ist Skp1 und SIAH1 verbindlich. So Expression von β-Catenin wurde der Einfluss von S100 auf SIAH1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin Ligase, um indirekt zu bewerten detektiert. Erstens zeigte Co-Immunopräzipitation, dass trunkierte mutant CacyBP /SIP bind sowohl Skp1 und SIAH1 (Fig. 5A), was darauf hindeutet, S100A6 nicht die Bildung von SIAH1-CacyBP /SIP-Skp1 unbiquitin Ligase-Komplex beeinflusste. Zweitens wird β- Catenin-Protein in MKN45-ΔS100 Zellen signifikant verringert, im Vergleich zu MKN45-CacyBP Zellen, während ohne Veränderung in der mRNA auftrat (Fig. 5B). Darüber hinaus, weil β-Catenin als Kofaktor für die Aktivierung des Transkriptionsfaktors, Tcf /LEF erforderlich ist, bestimmt wir die Auswirkungen der CayBP /SIPΔS100 auf Tcf /LEF-Aktivität transiente Transfektion Reportergen-Assays verwendet. Die Expression von CacyBP /SIPΔS100 führte zu niedrigeren Tcf /LEF-Aktivität als der Wildtyp CacyBP /SIP (Abb. 5C). MG132 könnte Inhibitor des Proteasoms, die Wirkung von sowohl Wildtyp CacyBP /SIP und CacyBP /SIPΔS100 auf Tcf /LEF-Aktivität beseitigen. Zusammengenommen entnehmen wir, dass S100A6 CayBP /SIP-vermittelte β-Catenin-Abbau beeinflussen könnten mit CayBP /SIP über die Interaktion.

Diskussion

S100-Familie Proteine ​​aufgrund ihrer unterschiedlichen Expression gewonnen Interesse an Tumor Gewebe und ihre Beteiligung an der Tumorprogression und Metastasierung [19] - [22]. S100-Proteine ​​interagieren mit einigen Zielproteine ​​in calciumabhängige oder calciumunabhängige Art und Weise und ferner regulieren Funktion dieser Ziele [5], [23]. CacyBP /SIP ist ein neues Zielprotein, das mit S100-Proteine, einschließlich S100A6, S100A1, S100B und S100P, aber nicht beschränkt auf S100A4, Calbindin D, Parvalbumin oder Calmodulin interagieren kann [8], [16]. Vorherige Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass die Überexpression von CacyBP /SIP könnte die Proliferation und Tumorgenese von Magenkrebs und Nierenzellkarzinom [11], [12] hemmen. Trotz dieser Fortschritte bleiben die Auswirkungen der S100-Proteine ​​auf CacyBP /SIP untersucht werden.

Um die Regulierung der S100-Proteine ​​auf CacyBP /SIP-Funktion aufzuklären, bauten wir die abgeschnittene CacyBP /SIP-Mutante ohne S100-Protein-Bindungsdomäne , so dass mutierte Protein konnte nicht S100-Proteine ​​interagieren und behält Fähigkeit, mit SIAH1 und Skp1 zu interagieren. In dieser Studie wurden eukaryotische Expressionsvektoren für Wildtyp CacyBP /SIP und seine verkürzten Mutante effektiv MKN45 Zellen exprimiert wird. Co-Immunpräzipitation zeigten eine Interaktion zwischen S100A6 und Wildtyp CacyBP /SIP in MKN45 Zellen. Jedoch CacyBP /SIPΔS100 zeigte wenig Signal durch die Co-Immunopräzipitation, eine schwache oder keine Wechselwirkung mit S100A6 anzeigt. MTT-Test, FACS-Assay, Experiment Klonogentest und Tumorxenotransplantates in Nacktmäusen durchgeführt wurden, die Wirkung von Wild und mutierten CacyBP /SIP auf das Zellwachstum zu testen und tumorigenesis beide In-vitro-
und in vitro
. Diese Experimente zeigten, dass die Überexpression von CacyBP /SIP könnte die Proliferation und Tumorentstehung von MKN45 Magenkrebszellen hemmen. Wichtig ist, dass mit CacyBP /SIPΔS100 transfizierten Zellen zeigten intensivere Effekte im Vergleich zu Wildtyp-Transfektanten, was darauf hindeutet, dass S100-Proteine ​​könnten sich negativ auf die Hemmung der Zellproliferation von CacyBP /SIP in Magenkrebszellen.

Der Mechanismus induziert regulieren eingesetzt von S100A6 CacyBP /SIP-Funktion liegen könnte in Protein-Interaktionen und Funktionen zu modulieren. CacyBP /SIP identifiziert in Ubiquitinierung und den Abbau von β-Catenin beteiligt sein [24] - [28]. β- Catenin gefunden wurde in proliferierenden Zellen und in vielen Tumoren [29] überexprimiert oder aktiviert zu werden, - [31]. Fukushima et al. [32] festgestellt, dass CacyBP /SIP-Knockout-Zellen beeinträchtigt Show (Catenin-Abbau und einer defekten G1 Zellzyklus-Kontrollpunkt, was darauf hinweist, dass die β-Catenin-Abbauweg vermittelt durch CacyBP /SIP einen wesentlichen Kontrollpunkt Progression für thymocyte Entwicklung und Zellzyklus definiert. Unsere früheren Studien zeigten auch, dass CacyBP /SIP Wachstum und die Proliferation von Magenkrebszellen hemmt teilweise über den Abbau von β-Catenin. Ob S100 CacyBP /SIP-vermittelte Ubiquitin-Ligase behält unbekannt reguliert. Accumulating Beweise zeigten, dass einige Mitglieder der S100-Proteinfamilie regulieren könnten die Aktivierung ihrer Zielproteine ​​[33], [34]. Eine kürzlich entdeckte Hefe-Homolog von CacyBP /SIP, SGT1, nicht nur mit S100-Proteine ​​in Calcium reguliert-Weise in Wechselwirkung tritt, sondern ordnet auch mit Skp1 Skp1 /cullin1 /F zu bilden, -.. Box-Ubiquitin-Ligase-Komplex [35] Es hat sich gezeigt, dass S100A6 die Phosphorylierung von SGT1 durch Casein-Kinase hemmen könnte II um die Aktivität zu beeinflussen [36] In unserem vorliegenden Experiment haben wir auch festgestellt, dass CacyBP /SIPΔS100 Fähigkeit behalten, mit zu assoziieren Skp1 und SIAH1, S100 Molekül was darauf hindeutet, beeinflussen könnten, nicht die Bildung von SIAH1 /Skp1 /CacyBP Ubiquitin-Ligase-Komplex. Dennoch ist β-Catenin-Protein ohne eine Änderung der mRNA-Ebene in CacyBP /SIPΔS100 transfizierten Zellen deutlich geringer als der Wildtyp Transfektand Zellen. Die Transkriptionsaktivität von TCF /LEF, ein Zielgen von β-Catenin wurde in Verbindung mit mutierten CacyBP /SIP verringert, ohne S100 Bindung im Vergleich zum Wild CacyBP /SIP. Accoding dieser Ergebnisse postulieren wir, dass S100-Protein könnte die Aktivität von SIAH1-CacyBP /SIP-Skp1 Ubiquitin-Ligase durch Wechselwirkung mit CacyBP /SIP negativ regulieren. So blockiert die Kombination von S100 und CacyBP /SIP könnte β-Catenin-Abbau zu fördern, führen die Vermehrung von Krebszellen zu hemmen. Diese Spekulation kann teilweise von Lee et al unterstützt werden, daß in Zellen mit verminderter Höhe der S100A6 die Menge an β-Catenin reduziert [26]. Die Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit Daten, die die Hochregulation der S100-Proteine ​​und mangelhafte Abbau von β-Catenin in Tumor und wuchernden Zellen in Bezug auf [37]. Darüber hinaus wurde CacyBP /SIP gezeigt mit Tubulin und ERK1 /2 und spielen eine wichtige Rolle bei der Umlagerungen des Zytoskeletts, Zelldifferenzierung oder Degeneration [38] zu interagieren - [42].

Schlussfolgerungen

S100A6-Protein reguliert negativ CacyBP /SIP-vermittelte Hemmung der Proliferation Magenkrebszelle, teils durch Wirkung auf die β-Catenin-Abbau und die transkriptionelle Aktivierung von TCF /LEF. Allerdings erfordern die zugrunde liegenden Mechanismen für die Regulierung von S100A6 auf Protein-Ubiquitinierung und andere Funktionen über CacyBP /SIP-abhängigen Weg weitere Untersuchungen.

• PLoS ONE: Aktivieren Transcription Factor 4 Verleiht ein Multidrug-Resistenz Phänotyps Magenkrebszellen durch Trans von SIRT1 Expression
• PLoS ONE: Polymorphismen und ein Haplotyp in Heparanase Gene Verbände mit der Progression und Prognose von Magenkrebs in einem nordchinesischen Bevölkerung