PLoS ONE: Chrysin Hemmt Tumor-Promotor-induzierte MMP-9-Expression durch Blockieren von AP-1 über Unterdrückung von ERK und JNK Pathways in Magenkarzinomzellen

Abstrakt

Zellinvasion ist ein entscheidender Mechanismus der Krebsmetastasen und Bösartigkeit. Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) ist ein wichtiges in der Invasion von Krebszellen beteiligt proteolytisches Enzym. Hohe Expression von MMP-9 bei Magenkrebs korrelieren positiv mit der Tumoraggressivität und haben eine signifikante negative Korrelation mit den Patientenüberlebenszeiten. Vor kurzem Mechanismen Unterdrückung von MMP-9 durch Phytochemikalien zunehmend untersucht geworden. Chrysin, eine natürlich vorkommende Chemikalie in Pflanzen wurde berichtet, Tumormetastasen zu unterdrücken. Allerdings haben die Auswirkungen von chrysin auf MMP-9-Expression in Magenkrebs nicht gut untersucht worden. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkung von Chrysin auf MMP-9-Expression in Magenkrebszellen, und bestimmt den zugrunde liegenden Mechanismus. Wir untersuchten die Wirkung von Chrysin auf MMP-9 Expression und Aktivität über RT-PCR, Zymographie, Promotor Studie und Western-Blotting in menschlichen Magenkrebszellen AGS. Chrysin gehemmt Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) -induzierte MMP-9-Expression in einer Dosis-abhängigen Weise. Mit AP-1 Decoy-Oligodesoxynukleotide, konnten wir bestätigen, dass AP-1 der entscheidende Transkriptionsfaktor für die MMP-9-Expression war. Chrysin blockiert AP-1 über die Unterdrückung der Phosphorylierung von c-Jun und c-Fos durch die JNK1 /2 und ERK1 /2-Wege blockiert. Weiterhin mit PMA vorbehandelt AGS Zellen zeigten deutlich verbesserte Invasivität, die teilweise durch Chrysin und MMP-9-Antikörpers außer Kraft gesetzt wurde. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Chrysin kann zumindest einen Teil seiner Anti-Krebs-Wirkung ausüben, indem sie über einen Block der JNK1 /2 und ERK1 /2 Signalwege bei Magenkrebs AGS-Zellen MMP-9-Expression durch Unterdrückung der AP-1-Aktivität zu steuern.

Citation: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin Hemmt Tumor-Promotor-induzierte MMP-9-Expression durch Blockieren von AP-1 über Unterdrückung von ERK und JNK Pathways in Magenkrebszellen. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10.1371 /journal.pone.0124007

Academic Editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA

Empfangen: 5. Oktober 2014; Akzeptiert: 9. März 2015; Veröffentlicht: 15. April 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten innerhalb des Papiers sind

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von einem Forschungsstipendium (0720570) vom National Cancer Center (www.ncc.re.kr), Basic Science Research Program Zuschuss durch die National Research Foundation unterstützt wurde von Korea (NRF) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (2010-0009910, www.moe.go.kr) und ein Medical Research Center (2012-000-9442) Zuschuss von der koreanischen Science and Engineering Foundation ( www.nrf.re.kr). Alle oben genannten Geldgebern hatte keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs derzeit an zweiter Stelle in der globalen Krebssterblichkeit mit schätzungsweise 990.000 neue Fälle und 738.000 Todesfälle durch Krebs weltweit jährlich führt, obwohl die Häufigkeit von Magenkarzinom in den letzten Jahrzehnten zurückgegangen ist [1,2]. Distant Organ oder Gewebe Metastasierung ist ein Zeichen der schlechten Prognose bei Patienten mit Magenkrebs. Metastasierung ist die fatal charakteristisch für maligne Tumoren, für mehr als 90% der tumorbedingten Mortalitäten Accounting [2]. Es hat sich gezeigt, dass die Chemotherapie und die Strahlentherapie können nicht wesentlich verlängern und die Lebensqualität der Patienten in solchen Fällen, [3,4] verbessern. Tumorzellen-Metastasen ein sehr komplexer Prozess ist, das aus der Proliferation, Migration, Invasion und die anschließende Anhaftung und Angiogenese in anderen Organen oder Geweben, [3].

Da invasion eine der grundlegenden Eigenschaften von malignen Krebszellen, Invasion zu steuern, ist ein wichtiges therapeutisches Ziel. Zell-extrazellulären Matrix (ECM) -Wechselwirkungen, Trennung der interzellulären Adhäsion, Abbau der ECM und die Invasion der Lymph- und Blutgefäße sind wichtige Schritte bei der Krebsinvasion und Metastasierung [5]. Tumorinvasion erfordert eine erhöhte Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) [6]. MMPs, eine Familie von zinkabhängigen Endopeptidasen, die Invasion von Krebszellen und zu verbreiten, spielen eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung durch den Abbau der ECM und der Basalmembran [7] induzieren. Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9), auch bekannt als 92 kDa-Typ IV-Kollagenase oder Gelatinase B, ist eine der wichtigsten MMPs, und wird von der MMP-9-Gen in Menschen [8] codiert wird. Es wurde berichtet, dass die Überexpression von MMPs Tumorzellablösung und Metastasierung zu erhöhen, die mit malignen Erkrankungen und schlechte klinische Ergebnisse bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich Magenkrebs assoziiert sind [9,10].

Aufgrund der Funktion von MMP- 9 im Zuge der Malignität ist die Unterdrückung von MMP-9 Ebenen eine wichtige Strategie zur Bekämpfung von Krebs. In den letzten Jahren mehr und mehr Aufmerksamkeit hat sich auf der Suche nach einem MMP-9-Inhibitor, insbesondere aus natürlich vorkommenden Materialien konzentriert. Kim et al. entdeckt, dass Silibinin hemmt PMA-induzierte MMP-9-Expression durch Unterdrückung der ERK-Phosphorylierung in MCF-7 menschlichen Brustkrebszellen [11]. In jüngerer Zeit Khoi et al. die gemeldet (-) - Epigallocatechin-3-gallat Blöcke Nikotin-induzierte MMP-9 Expression und Invasivität durch die Unterdrückung von NF &kgr; B und AP-1 in Endothelzellen ECV304-Zellen [12]. Chrysin, 5,7-Dihydroxyflavon, eine Art von natürlich vorkommenden Flavonoiden wurde Angiogenese und Metastasierung zu hemmen bekannt [13,14]. Lin et al. gezeigt, dass Chrysin-IL-6 induzierte Angiogenese durch Herunterregulierung des löslichen IL-6-Rezeptor /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF-Signalweg [13] unterdrückt. Kürzlich wurde berichtet, dass Chrysin die Caspase-abhängige Apoptose von TRAIL in HCT 116-Zelllinie und CNE1 Zellen [15] geregelt verbessern könnte. Yang et al. entdeckt, dass Chrysin Zellinvasion in einer dosisabhängigen Weise in TNBC Zellen unterdrückt. Außerdem nimmt chrysin metastasen verwandte Moleküle Vimentin, Schnecke und Schnecke, und blockiert den Akt-Signalweg [16]. Jedoch können die inhibitorischen Wirkungen von Chrysin auf MMP-9, sowie der Mechanismus nicht gut untersucht worden, insbesondere im Magenkrebszellen. In der vorliegenden Studie untersuchten wir chrysin die Auswirkungen auf die PMA-induzierte MMP-9-Expression bei Magenkrebs, und offenbarte ihr zugrunde liegenden Mechanismus.

Materialien und Methoden

Zellkultur und Kulturbedingungen

die AGS menschlichen Magenkrebszelllinie wurde von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI-1640 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 0,6% Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C in einer Atmosphäre mit 5% CO _{2. Um die Auswirkungen von Chrysin auf PMA induzierte MMP-9-Expression zu bestimmen, wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Chrysin vorbehandelt und anschließend mit PMA behandelt. Die Höhe der MMP-9 messenger RNA (mRNA) wurde durch reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) -Analyse bestimmt. Die Rolle der spezifischen Signalwege in der PMA-induzierte MMP-9 Expression wurden durch Vorbehandlung der Zellen mit dem AGS ERK 1/2 Inhibitor PD98059 (New England Biolabs, Beverly, MA), wobei die JNK-Inhibitor SP600125 (Calbiochem, La Jolla suchten , CA), die p38 MAPK-Inhibitor SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA) und Chrysin (Sigma Aldrich, USA) für 1 Stunde vor der Stimulation mit PMA.}

die Lebensfähigkeit der Zellen

die Zellen ( 5 x 10 ^{3) wurden in einer Platte mit 96 Vertiefungen in RPMI mit 10% FBS, enthaltend 0-100 uM Chrysin für 24 Stunden inkubiert und die Zellatmung durch ein etabliertes 3- [4,5-Dimethylthiazol-2 bestimmt -yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; Sigma-Aldrich) -Assay. Nach der Inkubation wurden 10 &mgr; l von 5 mg /ml MTT zu jeder Vertiefung der Platten mit 96 Vertiefungen zugegeben und inkubiert bei 37 ° C für 2 Stunden. Die Formazan-Granula wurden in 100% Dimethylsulfoxid erhalten gelöst und die Extinktion bei 570 nm mit einer 96-Well-ELISA-Lesegerät (Biotek Inc., Winooski, VT, USA) nachgewiesen.}

Gelatin Zymographie

Die Zellen vorbehandelt mit oder ohne 1 Stunde Chrysin wurden mit 100 nM PMA für 20 Stunden. Nach der Inkubation sammelten wir die Medienüberstand und durchgeführt Gelatinzymographie die MMP-9-Aktivität zu überprüfen. Anschließend wurde das Medium mit einem gleichen Volumen von 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% Glycerol, 4% SDS und 0,01% Bromphenolblau] vermischt und in einem 7,5% Acrylamid geladen: Bisacrylamid (29: 1; Bio-Rad, USA) Gel mit 625 &mgr; g /ml Gelatine (Sigma). Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 2,5% Triton X-100 dreimal gewaschen (20 Minuten pro Zeit), dann 24 Stunden bei 37 ° C inkubiert, in Inkubationspuffer [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl _{2 und 1 &mgr; M ZnCl 2]. Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) für 3 Stunden gefärbt und anschließend gespült. Proteolytische Aktivität wurde als klare Banden gegen den blauen Hintergrund der gefärbten Gelatine reflektiert. Belastungskontrolle für Gelatinzymographie: Coomassie Brilliant Blue R-250-Färbung für 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel ohne Gelatine, gleiche Menge an Überstand zu zeigen, wurde auf jede Spur geladen}

Reverse Transkription-PCR
<. p> Gesamt-RNA wurde aus den Zellen unter Verwendung von AGS TRIzol-Reagens (Invitrogen) extrahiert. Eine ug Gesamt-RNA wurde für die Erststrang-komplementären DNA-Synthese unter Verwendung von Zufallsprimern und M-MLV-Transkriptase (Promega) verwendet. Die komplementäre DNA wurde einer PCR Amplifikation mit Primer-Sets für unterzogen GAPDH und MMP-9 eine PCR Master-Mix-Lösung (Intron, Korea) verwendet wird. Die spezifischen Primer-Sequenzen waren wie folgt: GAPDH Sinn, 5'-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 'und Antisense-GAPDH, 5'-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 bp); und MMP-9 Sinn, 5 'AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT-3' und MMP-9-Antisense, 5'-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3 '(497 bp); c-Jun Sinn, 5'-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 'und c-Jun-Antisense, 5' GAA CCC CTC CTC CTG ATC TGT CAC GTT CTT-3 '(287bp); c-Fos Sinn, 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA ACA CAG TCT-3 'und c-Fos-Antisense, 5'-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3' (246bp). Die PCR-Bedingungen waren wie folgt:. Denaturierung bei 94 ° C für 30 Sekunden, Annealing bei 52 ° C für 20 Sekunden und Verlängerung bei 72 ° C für 30 Sekunden

Messung von MMP-9-Promotor-Aktivität

die transkriptionelle Regulation von MMP-9 wurde durch die transiente Transfektion einer MMP-9-Promotor-Luciferase-Reporterkonstrukt (pGL4-MMP-9) untersucht. Das Plasmid pGL4-MMP-9-Promotor (Spanning Nukleotide von -925 bis +13) wurde von Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Korea) freundlicherweise zur Verfügung gestellt. AGS-Zellen wurden ausgesät und gezüchtet, bis sie 70% Konfluenz erreicht. Dann wurden die pGL4-MMP-9-Promotor-Plasmide in die Zellen transfiziert unter Verwendung von FuGENE 6 (Promega, USA) nach dem Protokoll des Herstellers. PRL-TK wurde als interne Kontrolle transfiziert. Die Zellen wurden für 12 Stunden in dem Transfektionsmedium inkubiert und anschließend mit PMA für 4 Stunden behandelt. Die Wirkungen von Chrysin auf MMP-9-Promotor-Aktivität wurden durch Vorbehandeln Zellen mit Chrysin für 1 Stunde vor der Zugabe von PMA bestimmt. Die Cotransfektion Studien wurden in der Gegenwart oder Abwesenheit des Expressionsvektors codiert, die dominant negative Mutante MEK-1 (pMCL-K97M), dominant-negative Mutante JNK (pMCL-TAM67) oder dominant-negative Mutante p38 MAPK (pMCL-MP38 durchgeführt ), die von Dr. NG freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden Ahn (University of Colorado-Boulder, CO), Dr. M. J. Birrer (NCI, Rockville, MD), und von Dr. J. Han (Scripps Research Institute, CA), respectively. Die Zellen wurden mit einer Zellkultur-Lyse-Reagens (Promega, USA) geerntet und die Luciferase-Aktivitäten wurden unter Verwendung eines Luminometers (Centro XS lb960 Mikroplatten-Luminometer Berthold Technologies, USA) bestimmt nach dem Protokoll des Herstellers.

Transient Transfektion von AP-1-Reporter

Die AP-1 Luciferasereporterplasmid wurde von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erworben. Wenn AGS-Zellen 60-70% Konfluenz erreichten, wurden sie mit Opti-MEM-Medium gewaschen und transfiziert mit einem pGL-3-Vektor, der die AP-1 Reportergen unter Verwendung FuGENE 6 (Promega) nach dem Protokoll des Herstellers enthält. Reporter-transfizierten Zellen wurden mit Chrysin für 1 Stunde vorbehandelt und dann mit 100 nM PMA behandelt für 4 Stunden und die Luciferase-Aktivitäten wurden unter Verwendung eines Luminometers gemessen.

Transfection von AP-1 Decoy-Oligodesoxynukleotide

basierend auf der AP-1-Bindungsstelle ATGAGTCAT entwarfen wir die AP-1 Decoy phosphorthioierte doppelsträngigen Oligo Desoxynukleotid (ODNs), wie folgt, 5'-CGST CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 'und 3 '-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TSGC-5'. Wenn die AGS-Zellen 60-70% Konfluenz wuchs, AP-1 und ODNs pGL4-MMP-9-Promotor-Plasmide wurden co-transfiziert in Zellen unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) nach dem Protokoll des Herstellers. Nach Inkubation für 20 Stunden wurden die transfizierten Zellen für 4 Stunden mit PMA behandelt, und die Luciferase-Aktivitäten wurden unter Verwendung eines Luminometers gemessen.

Western blot analysis

AGS mit PMA behandelten Zellen in Phosphat gewaschen Kochsalzlösung (PBS), freistehend Trypsin-EDTA-Puffer verwendet, und bei -70 ° C gelagert, bis sie benötigt werden. Das zelluläre Protein wurde mit einem RIPA-Puffer [1% NP-40, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS)] extrahiert und Protease-Inhibitoren (Aprotinin, Leupeptin, Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), Benzamidin, Trypsin-Inhibitor, Natriumorthovanadat ). Fünfzig Mikrogramm der Proteine ​​wurde dann durch 10% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Hybond-P-Membranen (Amersham Pharmacia Biotech). Die Membranen wurden in einer TBST-Lösung, enthaltend 5% Magermilch, inkubiert mit einem primären Antikörper in einer Blockierungslösung über Nacht bei 4 ° C blockiert und dreimal mit 0,1% Tween-20 in Tris bei 10-Minuten-Intervallen Salzlösung (TBST) gepuffert . Meerrettich-Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) wurde verwendet, um die immunoreaktiven Proteine ​​durch Chemilumineszenz zu detektieren. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: anti-Phospho-p44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), Anti-Phospho-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP 9 (Cell Signaling Technology), anti-Phospho-c-Fos (Cell Signaling Technology), und anti-Phospho-c-Jun (Cell Signaling Technology). Die Gesamtproteinspiegel wurden durch Waschen der geblotteten Membran mit einer Abziehlösung 2-Mercaptoethanol, 2% zusammengesetzt aus 100 mM SDS analysiert, und 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) für 30 Minuten bei 50 ° C, und die Membran wurde dann re-sondiert mit entweder dem anti-β-Actin (Cell Signaling Technology), Anti-gesamt-ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), Anti-gesamt-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) oder anti-c-Jun (Santa Cruz).

Test
Matrigel Invasion

die Zellinvasion Assay wurde die 10-Well-chemotasis Kammer durchgeführt (Neuro Sonde, Gaithersburg, Maryland, USA) mit 8 uM Porenmembran (Neuro Probe) mit 10% FBS RPMI als chemische Lockstoffe in der unteren Kammer enthält. AGS-Zellen (10 ^{5 in 280 &mgr; l) wurden in Gegenwart von Chrysin, MMP-9-Antikörper oder unspezifische IgG, mit PMA zu der oberen Kammer hinzugefügt und inkubiert, um die Matrigel für 24 Stunden eindringen. Um die Wirkung von Chrysin und Signalisierungs Inhibitoren auf PMA-induzierte Zellinvasion, AGS-Zellen wurden vorinkubiert mit Chrysin, Curcumin, PD98059 oder SP600125 für 1 Stunde inkubiert und mit PMA für 24-Stunden-Invasionsperiode zu bestimmen. Die nicht-eindringenden Zellen auf der oberen Oberfläche jeder Membran wurden aus der Kammer entfernt und die Zellen auf der unteren Oberfläche jeder Membran wurden gefärbt mit dem Quick-Diff stain-Kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) eindringenden . Nach zwei Waschungen mit Wasser wurden die Kammern an der Luft trocknen gelassen. Die Anzahl der eindringenden Zellen wurde mit einem Phasenkontrastmikroskop gezählt.}

Statistik

Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt ist, und stellen den Mittelwert von mindestens drei getrennten Experimenten in dreifacher Ausführung durchgeführt. Unterschiede zwischen jeweils zwei Datensätzen wurden durch t-Tests bestimmt. Unterschiede als signifikant im Text beschriebenen entsprechen P
. ≪ 0,05

Ergebnisse

• PLoS ONE: Verlust der Expression von Reprimo, eine p53-induzierte Gene Zellzyklusarrest, korreliert mit einer invasiven Stadium der Tumorprogression und p73 Expression in Magen Cancer
• PLoS ONE: Deregulation zwischen miR-29b /c und Dnmt3a mit epigenetische Silencing des CDH1 Gen assoziiert, Affecting Zellmigration und Invasion in Gastric Cancer