PLoS ONE: Chrysin slopina auglio Promoter sukeltos MMP-9 raiška blokuoja AP-1 per slopinimas ERK ir JNK kelius skrandžio vėžys Cells

Anotacija

Mobilusis invazija yra svarbus mechanizmas vėžio metastazių ir piktybinių navikų , Matrikso metaloproteinazės-9 (MMP-9) yra svarbus proteolitinis fermentas, susijęs su vėžio ląstelių invazijos proceso. Aukštos raiškos lygiai MMP-9 skrandžio vėžio teigiamai koreliuoja su naviko agresyvumą ir turėti didelį neigiamą koreliaciją su pacientų išgyvenimo kartus. Neseniai mechanizmai slopina MMP-9, kurį pateikė fitonutrinai tampa vis tiriami. Chrysin, natūraliai cheminės augaluose, buvo pranešta, kad nuslopinti naviko metastazių. Tačiau chrysin poveikis MMP-9 raiškos skrandžio vėžio nebuvo gerai ištirtas. Šiame tyrime mes išbandė Chrysin poveikį MMP-9 raiškos skrandžio vėžio ląsteles ir nustatyti savo pagrindinį mechanizmą. Mes išnagrinėjo Chrysin poveikį MMP-9 raiškos ir veiklos per "RT-PGR, zymography, promotoriaus tyrimo ir Imunoblotingo žmogaus skrandžio vėžio AGS ląsteles. Chrysin slopinamas phorbol-12-miristatas 13-acetatas (PMA) indukuotų MMP-9 išraiška priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Naudojant AP-1 Decoy oligodeoxynucleotides, mes patvirtino, kad AP 1 buvo labai svarbus transkripcijos veiksnys MMP-9 raiška. Chrysin užblokuotas AP-1 per slopinimo c-Jun ir C-Fos fosforilinimo per blokuoja JNK1 /2 ir ERK1 /2 kelius. Be to, AGS ląstelės gydytiems su PMA parodė gerokai sustiprintas invazinis, kuris buvo iš dalies panaikintas Chrysin ir MMP-9 antikūnų. Mūsų rezultatai rodo, kad chrysin gali daryti bent dalį savo priešvėžinių poveikį kontroliuojant MMP-9 raiška per slopinimo AP 1 veiklos per iš JNK1 /2 ir ERK1 /2 signaliniu keliu, skrandžio vėžio AGS ląstelių bloką.

nurodomoji dalis: Sia Y Lian S Khoi PN, Yoon HJ Joo jūs, Chay KO, et al., (2015) Chrysin slopina auglio Rėmėjas sukeltos MMP-9 raiška blokuoja AP-1 per slopinimas ERK ir JNK kelius Skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 10 (4): e0124007. Doi: 10,1371 /journal.pone.0124007

Akademinė redaktorius: Pankaj K. Singh Nebraskos universitetas medicinos centras, JAV

Įstojo: Balandis 5, 2014 m Priėmė: Kovo 9, 2015 metų; Paskelbta: Balandžio 15, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Sia ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus

finansavimas:. Šis darbas parėmė tyrimų dotaciją (0720570) iš nacionalinio vėžio centro (www.ncc.re.kr), pagrindinis Mokslas tyrimų programos dotacija per nacionalines mokslinių tyrimų fondo Korėja (NRP) finansuoja švietimo, mokslo ir technologijos (2010-0009910, www.moe.go.kr) ministerijos, ir medicinos tyrimų centras (2012-000-9442) dotacija iš Korėjos mokslo ir inžinerijos fondo ( www.nrf.re.kr). Visi pirmiau minėti rėmėjai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

skrandžio vėžys šiuo metu užima antrą vietą pasaulio mirtingumo nuo vėžio, su maždaug 990,000 naujų atvejų ir 738,000 mirčių nuo vėžio, dėl visame pasaulyje kasmet, nors skrandžio karcinoma dažnis sumažėjo per pastaruosius kelis dešimtmečius [1,2]. Tolima organas ar audinys metastazės yra blogos prognozės ženklas pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. Metastazės yra labiausiai mirtinas charakteristika piktybinių navikų ir sudaro daugiau nei 90% naviko susijusių mirčių [2]. Ji buvo parodyta, kad chemoterapija ir radioterapija negali žymiai pratęsti ir pagerinti pacientų gyvenimo kokybę tiems atvejams, [3,4]. Auglio ląstelės metastazių yra labai sudėtingas procesas, apimantis iš dauginimosi, migracijos, invazijos, ir vėlesnis sukibimas ir angiogenezę kitų organų arba audinių [3].

Kadangi invazija yra vienas iš pagrindinių savybių piktybinių vėžio ląstelių, kontroliuoti invazija, yra svarbi gydymo taikinys. Mobilaus tarpląsteliniame (ECM) sąveika, atjungimas tarpląstelinės adhezijos, degradacija ECM ir limfinių ir kraujagyslių invazija yra svarbūs žingsniai vėžio invazijos ir metastazių [5]. Naviko invazija reikia didesnio išraišką matricos metaloproteinazėmis (MMP) [6]. MMPs, cinko priklausoma endopeptidases kurie indukuoja vėžinių ląstelių invaziją ir plitimu Žaisti esminius vaidmenis metastazių per ECM degradacijos ir baziniuose membranos šeimos [7]. Matrikso metaloproteinazės-9 (MMP-9), žinomas kaip 92 kDa tipo IV kolagenazės arba gelatinazė B, yra vienas iš svarbiausių MMP, ir yra koduojama MMP-9 geno žmonėms [8]. Buvo pranešta, kad padidėjusią MMP gali padidinti vėžinių ląstelių atšokimas ir metastazių, kurie susiję su piktybinių navikų ir skurdžių klinikinių rezultatų įvairiose vėžio, įskaitant skrandžio vėžio [9,10].

Dėl MMP- funkcija 9 piktybinių navikų žinoma, MMP-9 lygių slopinimas yra svarbus strategija kontroliuoti vėžį. Pastaraisiais metais vis daugiau ir daugiau dėmesio buvo skirta rasti MMP-9 inhibitorius, ypač iš natūraliai esančių medžiagų. Kim ir kt. atrado, kad silibinin slopina PMA-sukeltas MMP-9 raiška per slopinimo ERK fosforilinimo MCF-7 žmogaus krūties vėžio ląstelių [11]. Visai neseniai, Khoi ir kt. pranešė, kad (-) - Epigallocatechin-3-Gallate blokai nikotino sukeltas MMP-9 išraiška ir invaziškumo per NF-κB ir AP-1 slopinimo endotelio ECV304 ląstelių [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, iš natūraliai flavonoidų tipo, buvo žinoma, kad slopina angiogenezę ir metastazes [13,14]. Lin ir kt. parodė, kad chrysin slopina IL-6-sukeltas angiogenezę per down-regulation tirpios IL-6 receptorius /gp 130 /JAK1 /stat3 /VEGF signalinio kelio [13]. Neseniai jis pranešė, kad chrysin galėtų padidinti kaspaze priklauso apoptozę reglamentuoja takas HCT 116 ląstelių linijos ir CNE1 ląstelių [15]. Yang ir kt. atrado, kad chrysin slopinamas ląstelių invaziją priklausomai nuo dozės priklausomu būdu į TNBC ląstelių. Be to, chrysin mažėja metastazių susijusių molekulių vimentin, sraigė ir šliužas, ir blokuoja Akt signalinio kelio [16]. Tačiau, inhibicinį poveikį chrysin dėl MMP-9, o taip pat mechanizmo, kurie nebuvo gerai ištirtas, ypač skrandžio vėžio ląsteles. Šioje studijoje, mes ištirti Chrysin anketa poveikį PMA-sukeltas MMP-9 raiškos skrandžio vėžio, ir atskleidė savo pagrindinį mechanizmą.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis kultūra ir kultūra sąlygos

AGS žmogaus skrandžio vėžys ląstelių linija buvo gauta iš Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje (Manassas, VA, JAV). Ląstelės buvo auginamos RPMI-1640, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) ir 0,6% penicilino-streptomicino 37 ° C temperatūroje atmosferos sudėtyje yra 5% CO _{2. , Pagal kuriuos nustatomos chrysin dėl PMA sukeltos MMP-9 raiškos poveikį, ląstelės buvo iš anksto apdoroti skirtingų koncentracijų chrysin ir po to yra veikiamas su PMA. Iš MMP-9 RNR lygis (mRNR) buvo nustatomas pagal atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandinine reakcija (AT-PGR) analizės. Konkrečių signaliniu keliu į PMA-sukeltas MMP-9 raiškos vaidmuo buvo išnagrinėti iš anksto apdoroti AGS ląsteles su ERK 1/2 inhibitorių PD98059 (New England Biolabs, Beverly, MA), JNK inhibitoriaus SP600125 (CalBiochem, La Jolla CA), The p38 MAPK inhibitorius SB203580 (Calbiochem, La Jolla, Kalifornija) ir chrysin (Sigma-Aldrich, JAV) 1 val iki stimuliacijos su PMA.}

ląstelių gyvybingumas

Ląstelės ( 5 × 10 ^{3) buvo inkubuojamos 96 šulinėlių plokštelės RPMI su 10% FBS, kurių sudėtyje yra 0-100 mkm chrysin 24 valandas, ir ląstelių kvėpavimo buvo nustatomas pagal nustatytas 3- [4,5-dimetiltiazol-2 il] -2,5-diphenyltetrazolium bromidas (MTT; Sigma-Aldrich) Analizės. Po inkubacijos, 10 mikrol, 5 mg /ml MTT buvo įtraukta į kiekvieną iš 96-duobučių lėkštelėse šulinio ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 2 valandas. Formazano gautos granulės buvo ištirpinta 100% dimetilsulfoksido, o esant 570 nm absorbcijos buvo aptiktas su 96 duobučių ELISA skaitytuvu (Biotek Inc., WINOOSKI, VT, JAV).}

Želatina zymography

Ląstelės gydytiems su arba be chrysin 1 valandą buvo gydomi 100 nM PMA 20 valandų. Po inkubacijos, mes surinkti žiniasklaidos plūduriuojančio skysčio ir atliekami želatinos zymography patikrinti MMP-9 aktyvumą. Vėliau, žiniasklaida buvo sumaišyti su tokiu pačiu kiekiu 2P-9 activityrazolium B [62,5 mmol Tris-HCl (pH6.8), 25% glicerolio, 4% SDS, ir 0,01% Bromfenolio blue] ir pakrautas į 7,5% akrilamido: bisakrilamido (29: 1; Bio-Rad, JAV) gelis, kurių sudėtyje yra 625 g /ml želatina (Sigma). Po to, kai elektroforezės gelis buvo plaunamas 2,5% Triton X-100 tris kartus (20 minučių per laiko), tada inkubuojami 24 valandas 37 ° C temperatūroje, inkubacinis neutralizatoriaus [50 mmol Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mm CaCl _{2 ir 1 mkm ZnCl 2]. Geliai buvo tamsintas su Coomassie briliantinis mėlynasis R250 (Bio-Rad, JAV) 3 valandas, tada išskalauti. Proteolytic veikla atsispindėjo kaip aiškių juostų prieš mėlyname fone tamsintas želatinos. Krovimo valdymo želatinos zymography: Coomassie Briliantinis mėlynasis R-250 dėmių už 10% natrio laurilsulfatas poliakrilamido gelis be želatinos, parodyti vienodą kiekį skysčio virš nuosėdų buvo pakrautas ant kiekvienos juostos}

atvirkštinės transkripcijos-PGR
<. p> viso RNR buvo išskirta iš AGS ląstelių naudojant TRIzol reagento (Invitrogen). Vienas mikrogramų visos RNR buvo naudojama pirmą krypties papildomos DNR sintezei naudojant atsitiktinius pradmenis ir M-MLV transkriptazės (PROMEGA). Komplementari DNR buvo atliktas PGR amplifikacijos su pradmenų rinkinius, skirtus GAPDH ir MMP-9 naudojant PGR pagrindinio mišinio tirpalą (introno, Korėja). Kad specifinius pradmenis sekos buvo taip: GAPDH jausmą, 5'-TTG TTG CCA TBS ATG ACC CC-3 'ir GAPDH Priešprasminis, 5'-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 bp); ir MMP-9 jausmą, 5'-AAG TGG ŠMC ŠMC ŠMC AAC -3 "ir MMP-9 Priešprasminis, 5'TTT-BMK, ATC AGC PGS Persijos GT-3" (497 bp); c-Birželio jausmas, 5'-GGA AAC GAA CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ", ir C-Birželio Priešprasminis, 5'-GAA BMK BTK KTG BTK, ATC TGT ŠMC GTT CTT-3" (287bp); C-Fos jausmas, 5'-PVG TBS GAT CAA ggg ARG CCA PVG PPK TCT-3 "ir C-Fos Priešprasminis, 5'-GAA TPI GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3" (246bp). PGR sąlygos buvo taip:.

matavimas MMP-9 promotoriaus veiklos denatūracijos 94 ° C temperatūroje 30 sekundžių, atkaitinimo 52 ° C temperatūroje 20 sekundžių ir pratęsiant 72 ° C temperatūroje 30 sekundžių

transkripcijos reguliacija MMP-9 buvo išnagrinėti trumpalaikis transfekciją MMP-9 promotoriaus-liuciferazė reporteris konstrukto (pGL4-MMP-9). Plazmidės pGL4-MMP-9 rengėjas (apimanti nukleotidų nuo -925 iki +13) buvo maloniai pateikė dr Young-Han Lee (Konkuk universiteto, Korėja). AGS ląstelės buvo pasėjamos ir augo, kol jie pasiekė 70% santakoje. Tada į pGL4-MMP-9 promotorinės plazmidės buvo pernešta į ląsteles naudojant FuGENE 6 (PROMEGA, JAV) pagal gamintojo protokolą. PRL-TK buvo pernešta kaip vidaus kontrolė. Ląstelės buvo inkubuotos transfekcijos terpėje 12 valandų ir po to yra veikiamas su PMA 4 valandas. Iš chrysin poveikis MMP-9 promotoriaus veiklos buvo nustatomas pagal iš anksto apdoroti ląsteles su chrysin 1 valandą prieš pridedant PMA. Bendro transfekciją tyrimai buvo atlikti buvimą arba nebuvimą ekspresijos vektorių, koduojančio dominuojančią neigiamą mutantas MEK-1 (PMCL-K97M), dominuojančią neigiamą mutantas JNK (PMCL-TAM67), ar dominuojančią neigiamas mutantas p38 MAPK (PMCL-mP38 ), kuris buvo maloniai pateikė dr GD Ahn (Kolorado universitetas-Boulder, CO) dr M.J. BIRRER (NVI, Rockville, MD), o dr J. Han (Scripps Research Institute, CA), atitinkamai. Ląstelės

Laikina buvo surinktos su ląstelių kultūra lizės reagento (Promega, JAV) ir liuciferazės veikla buvo nustatomas naudojant luminometer (Centro XS lb960 mikroplašu luminometer, BERTHOLD Technologies, JAV) pagal gamintojo protokolą. transfekavimas reporteris
AP 1

AP-1 liuciferazė reporteris plazmidės buvo įsigytas iš Klontex (Palo Alto, CA, USA). Kai AGS ląstelės pasiekė 60-70% santaką, jie buvo plaunamas Opti-MEM terpėje ir transfekuota su PGL-3 vektoriumi, turinčiu AP-1 reporteris naudojant FuGENE 6 (PROMEGA) pagal gamintojo protokolą. Reporter-perkeltų ląstelės buvo išvalytos su Chrysin 1 valandą ir tada gydomi 100 Nm PMA 4 valandas ir liuciferazės veikla buvo matuojamas naudojant luminometer.

transfekciją AP-1 masalui oligodeoxynucleotides

remiantis AP-1 jungimosi vieta ATGAGTCAT, mes sukūrėme AP-1 Decoy phosphorothioated dvigrandę oligo deoksinukleotido (ODNs) taip, 5'-CGsT CTT KTG AGT CAT GAA TTC ATG AKTAS PVG ARG ACsG-3 ", ir 3 "-GsCA GAA GAA TBS GTA CTT ARG BLSK TGA GTC TTC TsGC-5". Kai AGS ląstelės išaugo iki 60-70% santakoje, AP 1 ODNs ir pGL4-MMP-9 promotorinės plazmidės buvo bendrai perkeltų į ląsteles naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, JAV) pagal gamintojo protokolą. Po inkubacijai 20 valandų, transfekuotos ląstelės buvo gydomi PMA 4 valandas ir liuciferazės veikla buvo matuojamas naudojant luminometer.

Vakarų dėmė analizė

AGS ląstelės gydomi PMA buvo plaunami fosfato buferiniame valgomosios druskos tirpale (PBS), individualus naudojant Tripsinas-EDTA buferinio tirpalo, ir saugomi -70 ° C temperatūroje, kol bus reikalingas. Korinio ryšio baltymas buvo ekstrahuojamas Ripa buferio [1% NP-40, 0,5% natrio deoksicholatas, 0,1% natrio laurilsulfatas (SDS)] ir proteazės inhibitorių (aprotinino, leupeptiną, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidino, tripsino inhibitoriaus, natrio orthovanadate ). Penkiasdešimt mikrogramų baltymų tada buvo atskirta 10% SDS-poliakrilamido gelyje ir perkelti į Hybond-P membranomis (Amersham Pharmacia Biotech). Membranos buvo blokuojami TBST tirpalas, kuriame yra 5% liesas pienas, inkubuojamos su pirminiais antikūnais A blokuojančiu tirpalu per naktį 4 ° C, ir tris kartus plaunamos 0,1% Tween-20 Tris buferio druskų tirpalu (TBST) po 10 minučių intervalais , Krienų peroksidazės-konjuguoto antrinis antikūnas ( "Amersham, Arlington Heights, IL, JAV) buvo naudojamas aptikti imunoreaktyvių baltymus cheminės liuminescencijos. buvo naudojami šie antikūnai: Anti-PHOSPHO-P44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Mobilusis Signalizacijos įranga, Danvers, MA, JAV), anti-PHOSPHO-JNK /SAPK (Mobilusis Signalizacijos technologijos), anti-MMP- 9 (Mobilusis Signalizacijos technologijos), anti-PHOSPHO-c-Fos (Mobilusis Signalizacijos technologijos), ir anti-PHOSPHO-c-Bir (Mobilusis Signalizacijos technologijos). Bendra baltymo koncentracija buvo tiriami, plaunant bloting membraną su desorbcijos tirpalo, kurį sudaro 100 mM 2-merkaptoetanolio, 2% SDS, ir 62,5 mmol Tris-HCl (pH 6,7) 30 minučių 50 ° C temperatūroje, ir membrana buvo tada naujo tyrinėjo su arba anti-β-aktino (Cell Signalizacijos technologijos), anti-viso ERK1 /2 (Mobilusis Signalizacijos technologijos), anti-viso JNK /SAPK (Mobilusis Signalizacijos technologijos), anti-c-Fos (Santa Krusas biotechnologijos , Inc, CA, JAV) arba anti-c-birželis (Santa Cruz).

Matrigel invazija tyrimas

mobilųjį invazija tyrimas buvo atliktas naudojant 10 šulinėlių chemotasis kamerą (Neurolingvistinis zondas, Gaithersburg, Maryland, JAV), kurios 8 mkm porų membranos (neuro zondas) su su 10% FBS, kurių sudėtyje yra RPMI kaip į apatinę kamerą chemoattractant. AGS ląstelės (10 ^{5 280 mikrol) buvo pridėta prie viršutinės kameroje su PMA į chrysin buvimą, MMP-9 antikūno arba nespecifinio IgG, ir inkubuojami įsiveržti į Matrigel už 24 val. Siekiant nustatyti, kad chrysin ir signalizavimo inhibitorių poveikį PMA-sukeltos ląstelių invaziją, AGS ląstelės buvo iš anksto inkubuojamas su chrysin, kurkumino, PD98059, arba SP600125 už 1 valandą, ir inkubuojami su PMA už 24 valandų invazijos laikotarpiu. Į ne užplūsta ląsteles ant viršutinio paviršiaus kiekvieną membrana buvo pašalinta iš kameros, ir užplūsta ląsteles ant apatinio paviršiaus kiekvieno membrana buvo tamsintas su Quick-Diff dėmių Kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) , Po dviejų vandens plovyklos, kamerose buvo leista išdžiūti. Invazija ląstelių skaičius buvo skaičiuojamas naudojant fazinio kontrasto mikroskopu.}

Statistika

Duomenų rodomi kaip vidurkis ± SD, ir atstovauti mažiausiai trejus atskirus atliktų eksperimentų trimis egzemplioriais vidurkį. Skirtumai tarp kas du duomenų rinkiniai buvo nustatyti T-testų. aprašyti kaip reikšmingas tekste skirtumai atitinka P
. < 0,05

Rezultatai

slopinantis poveikis Chrysin apie PMA skatino MMP-9 raiška

ištirti slopino iš chrysin kovos su MMP-9 ląstelę, AGS ląstelės gydytiems su chrysin buvo inkubuojami su PMA, ir buvo atlikta želatina zymography ir AT-PGR analizė. Kaip parodyta Fig 1A, PMA-stimuliuojama MMP-9 buvo slopinamas chrysin priklausomai nuo dozės priklausomu būdu, kaip parodyta per želatina zymography tyrimu. Prieš mūsų eksperimento, ar chrysin tiesiogiai slopino MMP-9 veikla arba slopino MMP-9 išraiška vis dar buvo nežinomas. Norint atsakyti į šį klausimą, mes bendradarbiaujame inkubuojami AGS-sekretuojamas MMP-9 su Chrysin 3 valandas, o želatina zymography buvo atliekama siekiant patikrinti galutinį lygį MMP-9 veiklai. Kaip pav 1B rodo, chrysin negalėjo turėti įtakos išsiskiria MMP-9 veiklą. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad Chrysin slopinimas nuo MMP-9 gali būti per slopinimo MMP-9 raiška. Norėdami patikrinti šią hipotezę, atvirkštinės transkripcijos PGR ir buvo atlikta MMP-9 promotorinės tyrimai patikrinti MMP-9 transkripcijos lygį. Kaip parodyta Fig 1C, po to, kai gydomas su chrysin, PMA-sukeltas MMP-9 mRNR sumažėjo priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Be to, MMP-9 promotorius liuciferazės veikla buvo slopinamas chrysin priklausomai nuo dozės priklausomu būdu (pav 1D). Ir imunoblotingu taip pat parodė, slopinantį poveikį chrysin apie MMP-9 raiškos (pav 1E). Į Chrysin koncentracijos naudojami šiame tyrime nebuvo įtakoti ląstelių gyvybingumo (pav 1f). Šie rezultatai rodo, kad chrysin slopina MMP-9 veiklą AGS ląsteles įvairiais transkripcijos veiksmingumo sumažėjimą.

vaidmuo AP-1 PMA-sukeltos MMP-9 raiškos

Kaip pranešė ankstesnis literatūros, AP-1 yra svarbiausias transkripcijos faktorius, į MMP-9 raiškos [17]. Šiame tyrime, patvirtinti, kad AP-1 kritiškai reikalingas šiame kurse mes dirbo AP-1 Decoy phosphorothioated dvigrandę oligodeoxynucleotide (ODNs) ir pGL3-AP-1 liuciferazės plazmidės bendrai transfekcijai į AGS ląsteles. Bendrai transfekuotos ląstelės buvo gydomi PMA, ir liuciferazės veikla buvo nustatomi, naudojant luminometer. Kaip parodyta Fig 2A, kad PMA-indukuotos MMP-9 promotorius liuciferazės veikla buvo slopinamas AP-1 jaukas. Nuosekliai, AP 1 Decoy slopina PMA-sukeltas MMP-9 iRNR raiška (pav 2b). Buvo parodyta, kad numušti AP-1 komponento C-fos ir C-Bir taip pat sumažėjo PMA-sukeltas MMP-9 raiška (pav 2c). Be to, kurkuminas, AP-1 inhibitorius, taip pat dirbo patikrinti AP-1 vaidmenį PMA-sukeltas MMP-9 raiška. Kaip RT-PGR duomenys rodo,, Kurkuminas slopinamas PMA-sukeltas MMP-9 išraiška priklausomai nuo dozės priklausomu būdu (pav 2D). Minėti duomenys rodo, kad AP-1 yra esminis veiksnys MMP-9 išraiška. Po įrodant lemiamą vaidmenį AP-1 aukšto lygio MMP-9 raiškos, mes iškėlė hipotezę, kad Chrysin slopinimu MMP-9 raiškos mechanizmas buvo per AP 1 veiklos slopinimas. Vėliau, AGS ląstelės transfektuotose AP-1 liuciferazės reporteris plazmidės buvo išvalytos su Chrysin, tada skatino PMA. Kaip parodyta Fig 2E, chrysin slopinamas PMA-sukeltas AP-1lucifease veiklą priklausomai nuo dozės priklausomu būdu, kuriame nurodyta, kad chrysin turi gebėjimą sumažinti AP-1 aktyvumą.

Chrysin slopina PMA-sukeltas MMP-9 išraiška, slopindamas transkripcijos faktorius AP-1 per c-Jun slopinimo ir c-Fos fosforilinimo

Jis yra gerai žinoma, kad c-Dec ir c-Fos yra komponentai AP-1 keliu [18]. Mes norėjome nustatyti už Chrysin anketa slopinamasis poveikis AP-1 mechanizmą, ir ištirti, ar chrysin tikrųjų darė savo įtaką c-Jun ir C-Fos. Mes matuojamas viso mRNR tiek c-Jun ir C-Fos sumą RT-PGR. Kaip parodyta pav 2F, chrysin neslopina ekspresijos lygį c-Jun ir C-Fos mRNR. Be to, išbandyti, jei chrysin slopina c-Jun ir C-Fos aktyvavimo, imunoblotingu buvo atliekama siekiant stebėti fosforilinto c-Jun ir C-Fos. Pav 2G ir 2F rodo, kad chrysin padarė slopinti PMA-sukeltas c-Jun ir C-Fos fosforilinimo dozės priklausomu būdu.

Chrysin slopina c-Jun ir C-Fos fosforilinimo blokavimo JNK ir ERK signalizacijos kelias

kitas tiriama, kaip chrysin slopino c-Jun ir c-Fos fosforilinimas. Dėl svarbaus vaidmens MAPK vaidina AP-1 aktyvavimo, mes ištyrė MAPK keliu vaidmenį MMP-9 raiška. Kaip parodyta Fig 3A, tarp MAPKs inhibitorių, PD98059 (ERK1 /2 inhibitorius), SP600125 (JNK1 /2 inhibitorius), ir SB203580 (p38 MAPK inhibitorius), tik PD98059 ir SP600125 galėjo slopinti PMA-sukeltas MMP-9 išraiška , kuris nurodė, kad ERK1 /2 ir JNK1 /2 keliai gali būti labai svarbus PMA-sukeltas MMP-9 raiška. Be to, su MEK-dominuojančia neigiamas plazmidžių PMCL-K97M, JNK dominuojantis neigiamas plazmidės PMCL-TAM67 ir p38 MAPK dominuojantis neigiamas plazmidės PMCL-mP38, mes patvirtino svarbiausius vaidmenis ERK ir JNK į MMP-9 raiškos skrandžio vėžio AGS ląstelių (pav 3b). Be to, kaip parodyta pav 3C, ERK1 /2 ir JNK1 /2 kritiškai reikalingas AP 1 aktyvavimo PMA, parodė per mūsų eksperimento su Mek ir JNK dominuojančių neigiamų plazmidės. Mes šalia patikrino JNK1 /2 ir ERK1 /2 vaidmenis c-Jun ir C-Fos aktyvacijos. Kaip parodyta pav 3D, SP600125 ir PD98059 slopino PMA-sukeltas C-Bir ir C-Fos fosforilinimas, atitinkamai, nurodant, kad JNK1 /2 kritiškai prieš c-Jun, o ERK1 /2 kritiškai prieš c-Fos. Kadangi mes atradome, kad JNK1 /2 ir ERK1 /2 suvaidino pagrindinius vaidmenis MMP-9 raiškos per AP-1, mes iškėlė hipotezę, kad chrysin gali dirbti per iš JNK1 /2 arba ERK1 /2 slopinimo slopinti MMP-9 raiška. Norėdami patikrinti savo hipotezę, imunoblotingu buvo atliktas siekiant nustatyti Chrysin poveikį JNK1 /2 arba ERK1 /2 fosforilinimo. Kaip pav 3e ir 3f parodo, kad PMA gydymas lėmė nepaprastą padidėjimo JNK1 /2 ir ERK P42 /44 fosforilinimo; Tačiau, atsižvelgiant į Chrysin akivaizdoje, PMA-sukeltas JNK1 /2 ir ERK1 /2 fosforilinimas buvo slopinamas dozės priklausomu būdu.

poveikis Chrysin mobiliųjų invazijos

Ji buvo žinoma kad aukšto lygio MMP-9 raiškos yra svarbu, kad invazinio vėžio ląstelių fenotipo. Išnagrinėti Chrysin poveikį PMA-sukelto ląstelių invazija, mes išanalizavome ląstelių invaziją per modifikuoto Boyden invazijos kamerą. AGS ląstelės inkubuojamos PMA lėmė didelio skaičiaus įsiveržė ląstelių, kurios išlaikė per dirbtinio Matrigel. Tačiau, atsižvelgiant į Chrysin arba MMP-9 antikūnų buvimas, iš okupuotų ląstelių skaičius sumažėjo, rodo, Chrysin gali slopinti PMA-sukeltą ląstelių invazinis slopindamas MMP-9 raiška (pav 4a ir 4b). Be to, pav 4C parodė, chrysin sumažėjo PMA-sukeltas AGS invazija į nuo dozės priklausomu būdu. Be to, mes tyrė signalizacijos inhibitorių poveikį PMA-sukeltas AGS ląstelių invaziją. Kaip parodyta pav 4D, chrysin, kurkuminas, PD98059 ir SP600125 slopino ląstelių invaziją sukeltas PMA, nurodant, kad chrysin tikriausiai slopina PMA-sukeltas MMP-9 per AP 1 slopinimas, kuris priklauso nuo blokuoja JNK1 /2 ir ERK1 /2 kelius .

Diskusijos

NATŪRALIŲ junginiai, kurių priešvėžinių veiklą kištis auglių vystymuisi ir vėžio progresavimą slopina įvairius mechanizmus, įskaitant ląstelių migracija, invazijos ir metastazių. Chrysin, natūrali flavonoidų plačiai randamas daugelyje augalų ekstraktų, medus, ir propolio, turi cheminių profilaktikos savybes, tokias kaip antiproliferacinis ir pro-apoptozę veiklą nuo įvairių vėžio [19,20]. Tačiau, anti-invazija savybės chrysin nebuvo gerai tiriamas skrandžio vėžio ląsteles. Ji yra gerai žinoma, kad MMPs yra jėga ekstraląstelinės matricos naikinimo, taip pat pagrindiniai induktoriai ląstelių invazijos. Mes ištirti slopinamąjį poveikį Chrysin apie MMP raiškos skrandžio vėžio ląsteles. Chrysin slopinamas MMP-9 išraiška (1 pav) ir kiti MMP, pavyzdžiui, MMP-2 ir MMP-7 (duomenys neparodyta). Šis reglamentas mechanizmas Chrysin gali būti priklausė nuo kiekvieno MMP ir šiame tyrime mes orientuojamės į MMP-9 reglamente numatytos.

PMA, phorbol-12-miristatas 13-acetatas, baltymų kinazės aktyvatorius, dažniausiai naudojamas kaip biomedicininių tyrimų priemonė modelių kancerogenezėje. Šiame tyrime mes atradome PMA padidėjo MMP-9 Aktyvumas per ląstelę savo išraiška lygiu. Atsižvelgiant į chrysin buvimą, PMA-sukeltas MMP-9 mažinamos chrysin-nuo dozės priklausomu būdu (pav 1A). Tačiau, atrodo, kad chrysin slopina MMP-9 ne todėl, kad slopinimo MMP-9 fermentų aktyvumo, tačiau dėl savo slopinimo MMP-9 išraiška. Ištirti mechanizmą, pagal kurį chrysin slopina PMA-sukeltas MMP-9 raiška, bandėme atrasti esminę transkripcijos faktorių (-ius) PMA- sukeltas MMP-9 raiškos keliu. Buvo pranešta, kad AP 1 yra teigiamas reguliatorius MMP: AP-1 elementas yra tarp -72 ir -66 vaidina svarbų vaidmenį transkripcijos reguliavimo MMP-1 geno ekspresijos ir mutacijos šio elemento ženkliai sumažinti bazinio veikla ir reakciją į MMP-1 promotoriaus išorės dirgiklius [21]. Į MMP-9 promotoriaus tiekėjų reglamentavimo seka, yra du AP 1 privalomi svetainės (-533 ir -79), kuri atlieka esminius vaidmenis MMP-9 raiškos žmogaus Caski ląstelių [22]. Mūsų tyrimo duomenimis, AP-1 masalui oligodeoxynucleotides, AP 1 inhibitoriaus Kurkuminas, c-Jun ir C-Fos siRNA kišosi su PMA-sukeltas MMP-9 raiškos (pav 2A-2d), kuriame numatyta tiesioginių įrodymų, kad AP-1 yra kritiškai kad būtų padidintas MMP-9 transkripciją į skrandžio vėžio ląsteles. Remiantis pirmiau minėtus rezultatus, mes daryti išvadą, kad chrysin slopina MMP-9 raiškos slopinimo AP-1 aktyvumui. Pav 2E rodo, kad mūsų spekuliacijos patvirtinimą: chrysin gali žymiai sumažinti AP-1 aktyvumo priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Atitiko mūsų šio atradimas, kad chrysin slopina AP-1 tiksliniai genas per slopinant AP-1 aktyvumą, ji taip pat buvo pranešė, MMP-9, kad chrysin slopinamas kitų AP-1 tikslines genus, pavyzdžiui, VEGF, COX-2 ir ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. Suderinti su kitais duomenimis, jis buvo atrasta, kad luteolinas, augalų flavonoidų su panašia struktūrą Chrysin gerokai slopina LPS-sukeltas DNR surišimo [26] veiklą AP-1. Tačiau, slopinantis gebėjimas ir mechanizmas chrysin AP-1 nebuvo visiškai ištirtas prieš šiame tyrime. Todėl kitą kartą studijavo mechanizmą, pagal kurį chrysin slopina AP-1.

Be tarpininkavimo MMP-9 raiška, AP 1 taip pat ir skatina invazijos aktyvatorių išraišką ir malšina invazija slopintuvai. Kaip, pavyzdžiui, AP-1 yra esminis transkripcijos faktorius invazinių susijusių genų [27] reguliavimo. AP 1 susideda vienos iš birželis šeimos narių ar heterodimerus tarp narių c-Fos ir C-Birželio šeimų homodimerami. Tiek C-Jun C-Fos fosforilinarai ir aktyvuoja ERK, p38 ir JNK kinazės sistemos [28-30]. Siekiant ištirti, Chrysin slopinimu AP-1 mechanizmą, mes ištirti, C-Bir ir C-Fos du pagrindiniai komponentai AP-1. Mes nustatėme, kad chrysin slopinamas C-Bir ir C-Fos aktyvacijos blokuoja jų atitinkamą fosforilinimas. Suderinamas su mūsų išvadomis, kai ankstesnę literatūra taip pat pranešė, kad kiti flavonai pvz kvercetino,

sumažėjo AP-1 aktyvumą per sulaiko C-Birželio anketa perkėlimas į branduolį [31]. Mes buvome labiau domina Chrysin anketa slopinančio mechanizmo c-Jun ir C-Fos. JNK (c-Birželio N-terminalas kinazės), priklausanti MAPK (mitogenas aktyvuota baltymų kinazės) šeimos narys, kuris reguliuoja biologinių procesų padariusiems Tumorigenesis asortimentą, laikoma esminė kinazės c-Jun aktyvavimo [32] , ERK tarpląsteliniai signalizacijos reguliuojama kinazės, vaidina svarbų vaidmenį įvairių mobiliojo ryšio procesų, pavyzdžiui, platinimo, diferenciacijos ir vystymosi [33] Reglamento, ir buvo pranešta, kad svarbų kinazės reglamentuojantis C-Fos aktyvacijos [34]. Šioje studijoje, randame tiesioginių įrodymų skrandžio vėžio AGS ląstelių, JNK yra kritiškai reikalingas C-Jun aktyvavimo, o ERK yra kritinė kinazės C-Fos aktyvavimo (pav 3D).

Remiantis pirmiau sudarymo, siekiant toliau tirti chrysin anketa mechanizmą slopina MMP-9, mes atradome, kad chrysin turėjo galimybę blokuoti JNK1 /2 ir ERK1 /2 fosforilinimas (pav 3e ir 3f). Pagal šį rezultatą, slopinimas kitų flavonai apie ERK1 /2 taip pat buvo pranešta.

Liu et al., Pranešama, kad apigeninas A polyphenolic flavone (4,5,7-trihydroxyflavone), rasta žolių ir žaliųjų lapinių daržovių įvairovė, slopina ląstelių migraciją per iš ERK1 /2 fosforilinimo slopinimo žmogaus šlapimo pūslės lygiųjų raumenų ląstelėse [35]. Jis taip pat buvo aptikta Išikavos et al. kad O _{2O 2 padidina apoptozę, todėl greitai fosforilinimo JNK, ERKs ir p38 MAPK, o kvercetino galima panaikinti šių trijų MAPKs aktyvacijos reaguojant į H 2O 2 [ ,,,0],36].}

Šiame tyrime mes ištirti slopinantį poveikį chrysin apie MMP-9 raiškos ir atskleidė sukeliančiam mechanizmui skrandžio vėžio AGS ląstelių pirmą kartą. Remiantis mūsų duomenimis, mes aprašome hipotetinę schematiškai modelį, iliustruojantį Chrysin mechanizmą slopina MMP-9 raiška, kaip parodyta pav 5. Tolesni tyrimai turėtų būti atliekami siekiant ištirti, ar yra esminis fermentas prieš tiek JNK1 /2 ir ERK1 /2, kritiškai kontroliuoti JNK1 /2 ir ERK1 /2 fosforilinimas. Jei taip, chrysin gali tiesiogiai bendrauti su eterinio fermento, kuris turi būti kruopščiai ištirti, kaip galimą anti-vėžio terapinio.

Įvairūs pagalbinis gydymo strategijas, siekiant slopinti auglio metastazių ir užkirsti kelią auglio augimą buvo išnagrinėti ir teikti daug galimybių už pacientų išieškojimus. Neseniai iš natūralių fitonutrinai naudojimas gavo išsamų tyrimą dėl vėžio prevencijos [37]. Be to, su maistu gaunamo fitonutrinai neseniai gavo dėmesio skrandžio vėžio prevencijos [38]. Šiame tyrime mes nustatėme, kad Chrysin gydytų ląstelės gali sumažinti vėžio invazinis per slopina MMP-9 raiška per JNK /C-Bir ir ERK /C-Fos signalizacijos būdus slopinimas. Šie duomenys gali suteikti naudingos įrodymų kuriant ateities priešvėžinių terapija skrandžio vėžio.

• PLoS ONE: nuostoliai išraiškos Reprimo A p53 sukelta ląstelių ciklo arešto Gene, yra susijęs su Invazinių etapo naviko progresavimas ir P73 raiškos skrandžio vėžio
• PLoS ONE: panaikinimas tarp Pasaulis-29b /c ir DNMT3A yra susijęs su epigenetinius nutildyti iš CDH1 Gene, turinčių įtakos ląstelių migraciją ir invazija į skrandžio vėžio