PLoS ONE: Chrysin hemmer tumor Arrangøren-Induced MMP-9 Expression ved å blokkere AP-en via Undertrykkelse av ERK og JNK Pathways i Gastric Cancer Cells

Abstract

Cell invasjonen er en viktig mekanisme for kreft metastasering og malignitet . Matrise-metalloproteinase-9 (MMP-9) er en viktig proteolytisk enzym som er involvert i kreftcellen invasjon prosess. Høye uttrykk nivåer av MMP-9 i magekreft positivt korrelert med tumor aggressivitet og ha en betydelig negativ korrelasjon med pasientenes overlevelse ganger. Nylig mekanismer undertrykke MMP-9 av fytokjemikalier har blitt stadig mer etterforsket. Chrysin, en naturlig forekommende kjemisk i planter, er blitt rapportert å undertrykke tumormetastase. Men effekten av chrysin på MMP-9 uttrykk i magekreft har ikke blitt godt undersøkt. I denne studien har vi testet effekten av chrysin på MMP-9 uttrykk i magekreftceller, og bestemt dens underliggende mekanisme. Vi undersøkte effekten av chrysin på MMP-9 uttrykk og aktivitet via RT-PCR, zymografi, arrangøren studie, og western blotting i menneskelige magekreft AGS celler. Chrysin hemmet forbol-12-myristat 13-acetat (PMA) -indusert MMP-9-ekspresjon i en doseavhengig måte. Ved hjelp av AP-1 lokkefugl oligodeoksynukleotider, bekreftet vi at AP-en var den avgjørende Transkripsjonsfaktor for MMP-9 uttrykk. Chrysin blokkert AP-en via undertrykking av fosforylering av c-Jun og c-Fos gjennom å blokkere JNK1 /2 og ERK1 /2 veier. Videre AGS-celler forbehandlet med PMA viste markert forbedret invasivitet, som delvis ble opphevet ved chrysin og MMP-9-antistoffet. Våre resultater tyder på at chrysin kan utøve i det minste en del av sin anticancer virkning ved regulering av MMP-9-ekspresjon ved undertrykkelse av AP-1-aktivitet ved hjelp av en blokk av de JNK1 /2 og ERK1 /2 signalveier i magekreft AGS celler.

Citation: Xia Y, Lian S, Khoi PN, Yoon HJ, Joo YE, Chay KO, et al. (2015) Chrysin hemmer tumor Arrangøren-Induced MMP-9 Expression ved å blokkere AP-en via Undertrykkelse av ERK og JNK Pathways i Gastric kreftceller. PLoS ONE 10 (4): e0124007. doi: 10,1371 /journal.pone.0124007

Academic Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

mottatt: 5 oktober 2014; Godkjent: 09.03.2015; Publisert: 15 april 2015

Copyright: © 2015 Xia et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et forskningsstipend (0720570) fra National Cancer Center (www.ncc.re.kr), Basic Science Research Program stipend gjennom stiftelsen av den nasjonale forsknings Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2010-0009910, www.moe.go.kr), og en medisinsk Research Center (2012-000-9442) stipend fra den koreanske Science and Engineering Foundation ( www.nrf.re.kr). Alle ovennevnte organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

introduksjon til

mage~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP rangerer øyeblikket på andreplass i den globale kreftdødelighet, med anslagsvis 990.000 nye tilfeller og 738,000 kreftdødsfall som følge verdensbasis årlig, selv om forekomsten av magekreft har sunket de siste tiårene [1,2]. Distant organ eller vev metastase er et tegn på dårlig prognose hos pasienter med magekreft. Metastase er den mest fatale karakteristikken av ondartede svulster, sto for mer enn 90% av tumorrelatert dødelighet [2]. Det har vist seg at kjemoterapi og strålebehandling ikke i betydelig grad kan forlenge og forbedre livskvaliteten til pasientene i de tilfeller [3,4]. Tumorceller metastase er en meget kompleks prosess som består av proliferasjon, migrering, invasjon, og den påfølgende adhesjon og angiogenese i andre organer eller vev [3].

Siden invasjon er en av de grunnleggende egenskaper av ondartede kreftceller, kontrollerende invasjon, er et viktig terapeutisk mål. Cell-ekstracellulære matriks (ECM) interaksjoner, frakobling av intercellulær adhesjon, nedbrytning av ECM, og invasjonen av lymfe og blodårene er viktige skritt i kreft invasjon og metastasering [5]. Tumorinvasjon krever en økt ekspresjon av matriks-metalloproteinaser (MMP) [6]. MMP'er, en familie av sink-avhengige endopeptidaser som induserer kreft celle invasjon og spredning, spiller avgjørende roller i metastaser ved nedbrytning av ECM og basalmembranen [7]. Matrise-metalloproteinase-9 (MMP-9), også kjent som 92 kDa-typen IV kollagenase eller gelatinase B, er en av de viktigste MMPs, og blir kodet av MMP-9-genet hos mennesker [8]. Det har blitt rapportert at overekspresjon av MMP kan øke tumorcelle løsrivelse og metastasering, som er forbundet med kreft og fattige kliniske resultater i ulike kreftformer, inkludert magekreft [9,10].

På grunn av funksjonen til MMP- 9 i løpet av malignitet, er undertrykkelse av MMP-9 nivåer en viktig strategi for kontroll av kreft. I de senere år har stadig større oppmerksomhet blitt fokusert på å finne en MMP-9-inhibitor, spesielt fra naturlig forekommende materialer. Kim et al. oppdaget at silibinin inhiberer PMA-induserte MMP-9 uttrykk gjennom undertrykkelse av ERK-fosforylering i MCF-7 humane brystcancerceller [11]. Flere nylig, Khoi et al. rapporterte at (-) - Epigallocatechin-3-gallate blokker nikotin-indusert MMP-9 uttrykk og invasivitet ved undertrykkelse av NF-kB og AP-1 i endotelceller ECV304 celler [12]. Chrysin, 5,7-dihydroxyflavone, en type av naturlig forekommende flavonoid, har vært kjent for å hemme angiogenese og metastase [13,14]. Lin et al. viste at chrysin undertrykker IL-6-indusert angiogenese gjennom nedregulering av den løselige IL-6 reseptor /gp130 /JAK1 /STAT3 /VEGF-signaleringsreaksjonsveien [13]. Nylig er det rapportert at chrysin kan styrke caspase-avhengig apoptose regulert av TRAIL i HCT 116 cellelinje og CNE1 celler [15]. Yang et al. oppdaget at chrysin trykkes celle invasjon i en doseavhengig måte i TNBC celler. Videre chrysin reduserer metastaserelaterte molekyler vimentin, snegl og dorsk, og blokkerer Akt signalveien [16]. Men de inhiberende virkninger av chrysin på MMP-9, samt den mekanisme, er ikke blitt godt undersøkt, særlig i magekreftceller. I denne studien undersøkte vi chrysin effekter på PMA-indusert MMP-9 uttrykk i magekreft, og avslørte sin underliggende mekanisme.

Materialer og metoder

Cellekultur og dyrkningsforhold

AGS humane magecancercellelinje ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellene ble dyrket i RPMI-1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 0,6% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en atmosfære inneholdende 5% CO _{2. For å bestemme effekten av chrysin på PMA indusert MMP-9-ekspresjon ble cellene forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av chrysin og deretter behandlet med PMA. Nivået av MMP-9 budbringer RNA (mRNA) ble bestemt ved revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse. Rollen til de spesifikke signalveier i PMA-induserte MMP-9-ekspresjon ble undersøkt ved forbehandling av AGS-celler med ERK 1/2 inhibitor PD98059 (New England Biolabs, Beverly, MA), JNK-inhibitor SP600125 (Calbiochem, La Jolla , CA), p38 MAPK inhibitor SB203580 (Calbiochem, La Jolla, CA), og chrysin (Sigma Aldrich, USA) for en time før stimulering med PMA.}

Celleviabilitet

Cells ( 5 x 10 ^{3) ble inkubert i en 96-brønns plate i RPMI med 10% FBS inneholdende 0-100 mM chrysin i 24 timer, og cellerespirasjon ble bestemt ved en etablert 3- [4,5-dimetyltiazol-2- -yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma-Aldrich) assay. Etter inkuberingen, 10 ul 5 mg /ml MTT ble tilsatt til hver brønn i 96-brønners plater og inkubert ved 37 ° C i 2 timer. Formazangruppen granuler som ble oppnådd ble oppløst i 100% dimetylsulfoksyd, og absorbansen ved 570 nm ble påvist med en 96-brønns ELISA-leser (Biotek Inc., Winooski, VT, USA).}

Gelatin zymografi

celler forbehandlet med eller uten Chrysin i 1 time ble behandlet med 100 nM PMA i 20 timer. Etter inkubasjon samles vi media supernatanten og utført gelatin zymografi å sjekke MMP-9 aktivitet. Deretter ble mediet blandet med et likt volum av 2P-9 activityrazolium b [62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8), 25% glyserol, 4% SDS og 0,01% bromfenolblått] og fylt i en 7,5% akrylamid: akrylamid (29: 1; Bio-Rad, USA) gel inneholdende 625 pg /ml gelatin (Sigma). Etter elektroforese ble gelen vasket med 2,5% Triton X-100 tre ganger (20 minutter per gang), deretter inkubert i 24 timer ved 37 ° C, i inkuberingsbuffer [50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, 5 mM CaCl _{2, og en mikrometer ZnCl 2]. Geler ble farget med Coomassie Brilliant Blue R250 (Bio-Rad, USA) i 3 timer, og deretter skylles. Proteolytisk aktivitet ble reflektert som klare bånd mot blå bakgrunn av farget gelatin. Last kontroll for gelatin zymografi: Coomassie Brilliant Blue R-250 beis for 10% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel uten gelatin, for å vise lik mengde av supernatanten ble fylt på hvert kjørefelt}

Revers transkripsjon-PCR
<. p> Totalt RNA ble ekstrahert fra AGS celler ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen). Ett pg av total RNA ble benyttet for første-tråd som er komplementær DNA-syntese ved anvendelse av tilfeldige primere og M-MLV-transkriptase (Promega). Den komplementære DNA ble underkastet PCR-amplifikasjon med primersett for GAPDH og MMP-9 ved hjelp av en PCR masterblanding løsning (intron, Korea). De spesifikke primere-sekvensene var som følger: GAPDH forstand, 5'-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3 'og GAPDH antisense, 5'-TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836 bp); og MMP-9 forstand, 5'- AAG TGG CAC CAC CAC AAC AT 3 'og MMP-9-antisens, 5'-TTT CCC ATC AGC ATT GCC GT-3' (497 bp); c-Jun forstand, 5'-GGA AAC GAC CTT CTA TGA CGA TGC CCTCAA-3 ', og c-Jun antisense, 5'GAA CCC CTC CTG CTC ATC TGT CAC GTT CTT-3' (287bp); c-Fos forstand, 5'-CAG TCA GAT CAA GGG AAG CCA CAG ACA TCT-3 'og c-Fos antisense, 5'-GAA TAA GAT GGC TGC AGC CAA ATG CCG CA-3' (246bp). PCR-betingelsene var som følger:. Denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 52 ° C i 20 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder

Måling av MMP-9-promoteraktivitet

transkripsjonsregulering av MMP-9 ble undersøkt ved transient transfeksjon av en MMP-9-promoter-luciferase reporter-konstruksjonen (pGL4-MMP-9). Plasmidet pGL4-MMP-9 promoter (spenner nukleotider fra -925 til 13) ble vennlig levert av Dr. Young-Han Lee (Konkuk University, Korea). AGS celler ble sådd og dyrket inntil de nådde 70% samløpet. Deretter ble de pGL4-MMP-9-promotor plasmider transfektert inn i cellene ved hjelp av Fugene 6 (Promega, USA) i henhold til produsentens protokoll. PRL-TK ble transfektert som en intern kontroll. Celler ble inkubert i transfeksjonen medium i 12 timer og deretter behandlet med PMA i 4 timer. Effektene av chrysin for MMP-9-promoter-aktivitet ble bestemt ved forbehandling av cellene med chrysin i 1 time før tilsetning av PMA. De ko-transfeksjon studier ble utført i nærvær eller fravær av en ekspresjonsvektor som koder for den dominant negativ mutant MEK-1 (PMCL-K97M), dominant negativ mutant JNK (PMCL-TAM67), eller dominant negativ mutant p38 MAPK (PMCL-MP38 ) som ber ble gitt av Dr. NG Ahn (Universitetet i Colorado-Boulder, CO), av Dr. M.J. Birrer (NCI, Rockville, MD), og av Dr. J. Han (Scripps Research Institute, CA), henholdsvis. Cellene ble høstet med en cellekultur lysereagensen (Promega, USA), og luciferase aktiviteter ble bestemt ved bruk av et luminometer (Centro XS lb960 mikro luminometer, Berthold Technologies, USA) i henhold til produsentens protokoll.

Transient transfeksjon av AP-1 reporter

AP-1 luciferase reporter plasmid ble kjøpt fra Clontech (Palo Alto, California, USA). Når AGS cellene nådde 60-70% samløpet, ble de vasket med Opti-MEM medium og transfektert med en PGL-3 vektor som inneholder AP-en reporter ved hjelp Fugene 6 (Promega) i henhold til produsentens protokoll. Reporter-transfekterte celler ble forbehandlet med chrysin i 1 time og deretter behandlet med 100 nM PMA i 4 timer og luciferase-aktivitet ble målt ved anvendelse av et luminometer.

Transfeksjon av AP-1 lokke oligodeoksynukleotider

basert på AP-en bindingssetet ATGAGTCAT, vi designet AP-en lokkefugl phosphorothioated dobbeltrådet oligo deoksynukleotid (ODNs) som følger, 5'-CGsT CTT CTG AGT CAT GAA TTC ATG ACT CAG AAG ACsG-3 ', og tre '-GsCA GAA GAC TCA GTA CTT AAG TAC TGA GTC TTC TsGC-5'. Når AGS cellene vokste til 60-70% konfluens, AP-1 og ODNs pGL4-MMP-9-promotor Plasmidene ble ko-transfektert inn i celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens protokoll. Etter inkubering i 20 timer ble transfekterte celler behandlet med PMA i 4 timer og luciferase-aktivitet ble målt ved anvendelse av et luminometer.

Western blot-analyse

AGS-celler behandlet med PMA ble vasket i fosfat bufret saltløsning (PBS), frittliggende ved hjelp av Trypsin-EDTA-buffer og lagret ved -70 ° C inntil behov. Den cellulære protein ble ekstrahert med RIPA-buffer [1% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS)] og protease-inhibitorer (aprotinin, leupeptin, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamidin, trypsin inhibitor, natriumortovanadat ). Femti mikrogram proteiner ble deretter separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til Hybond-P-membraner (Amersham Pharmacia Biotech). Membranene ble blokkert i en TBST oppløsning inneholdende 5% skummet melk, inkubert med et primært antistoff i en blokkerende oppløsning over natten ved 4 ° C og vasket tre ganger med 0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvann (TBST) ved 10 minutters intervaller . Pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) ble brukt til å detektere de immunoreaktive proteiner ved kjemiluminescens. Følgende antistoffer ble brukt: anti-fosfor-P44 /42 MAPK (ERK-1/2) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), anti-fosfor-JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-MMP- 9 (Cell Signaling Technology), anti-fosfor-c-Fos (Cell Signaling Technology), og anti-fosfor-c-Jun (Cell Signaling Technology). Den totale proteinnivåer ble analysert ved vasking av blottet membran med en strippeoppløsning bestående av 100 mM 2-merkaptoetanol, 2% SDS, og 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,7) i 30 minutter ved 50 ° C, og membranen ble deretter re-analysert med enten anti-β-aktin (Cell Signaling Technology), anti-total ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), anti-total JNK /SAPK (Cell Signaling Technology), anti-c-Fos (Santa Cruz Biotechnology , Inc., CA, USA) eller anti-c-Jun (Santa Cruz).

Matrigel invasjonen assay

celle~~POS=TRUNC invasjonen analysen ble utført ved hjelp av 10-brønnen chemotasis kammer (Neuro probe, Gaithersburg, Maryland, USA) med 8 um porestørrelse membran (Neuro probe) med 10% FBS inneholdende RPMI som kjemoattraktant i det nedre kammer. AGS-celler (10 ^{5 i 280 ul) ble tilsatt til det øvre kammer med PMA i nærvær av chrysin, MMP-9-antistoffet eller ikke-spesifikk IgG, og inkubert for å invadere den Matrigel i 24 timer. For å bestemme effekten av chrysin og signalerings inhibitorer på PMA-induserte celle invasjon, AGS cellene ble pre-inkubert med chrysin, curcumin, PD98059, eller SP600125 i 1 time, og inkubert med PMA for 24-timers periode invasjon. De ikke-invaderende celler på den øvre overflate av hver membran ble fjernet fra kammeret, og de invaderende celler på den nedre overflate av hver membran ble farget med Quick-Diff flekk kit (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) . Etter to vannvaskinger ble kamrene tillatt å lufttørke. Antallet av invaderende celler ble tellet ved bruk av et fasekontrastmikroskop.}

statistikker og

Data er vist som gjennomsnitt ± SD, og ​​representerer gjennomsnittet av minst tre separate forsøk utført i tre eksemplarer. Forskjeller mellom hver to datasettene ble bestemt ved t-tester. Forskjeller beskrevet som betydelig i teksten samsvarer med P
. ≪ 0,05

Resultater

Hemmende effekt av chrysin på PMA stimulert MMP-9 uttrykk

for å undersøke den hemmende virkningen av chrysin mot oppregulering av MMP-9, ble AGS-celler forbehandlet med chrysin inkubert med PMA, og gelatin zymografi og RT-PCR-analyse ble utført. Som vist i figur 1A, PMA-stimulerte MMP-9 ble inhibert med Chrysin på en dose-avhengig måte som vist til ved gelatin zymografi analysen. Før vårt eksperiment, enten direkte chrysin inhiberte aktiviteten av MMP-9 eller inhiberte ekspresjon av MMP-9 ble fortsatt ukjent. For å besvare dette spørsmålet, vi co-inkubert AGS-utskilt MMP-9 med chrysin i 3 timer, og gelatin zymografi ble utført for å kontrollere det endelige nivået av MMP-9 aktivitet. Som figur 1B viser, kan chrysin ikke påvirke utskilt MMP-9 aktiviteter. Så hypotese vi at inhiberingen av chrysin mot MMP-9 kan være via undertrykkelse av MMP-9 uttrykk. For å bekrefte denne hypotesen, revers transkripsjonen PCR og MMP-9 promoter analysene ble utført for å sjekke MMP-9 transkripsjonsnivåer. Som vist i figur 1C, etter å ha blitt behandlet med chrysin, redusert PMA-induserte MMP-9 mRNA på en doseavhengig måte. Videre ble MMP-9-promoteren luciferase-aktivitet inhiberes ved Chrysin på en doseavhengig måte (Fig 1 D). Og western blotting viste også hemmende effekt chrysin på MMP-9 uttrykk (Fig 1E). Konsentrasjonene av chrysin anvendt i denne studien ikke påvirke cellenes levedyktighet (fig 1F). Disse resultatene indikerer at chrysin inhiberer MMP-9 aktivitet i AGS-celler via en reduksjon av den transkripsjonelle effektivitet.

Rollen av AP-1 i PMA-induserte MMP-9 uttrykk

Som rapportert av tidligere litteratur, er AP-1 er den viktigste transkripsjonsfaktor i MMP-9 uttrykk [17]. I denne studien, for å bekrefte at AP-en er kritisk nødvendig i dette kurset, ansatt vi en AP-en lokkefugl phosphorothioated dobbeltrådet oligodesoksynukleotid (ODNs) og pGL3-AP-1 luciferase plasmid til co-transfeksjon inn i AGS celler. De ko-transfekterte celler ble behandlet med PMA og luciferase-aktivitet ble bestemt ved anvendelse av et luminometer. Som vist i figur 2A, ble PMA-induserte MMP-9-promotor luciferase-aktivitet inhiberes av AP-1 lokkefugl. Konsekvent, AP-1 decoy også hemmet PMA-indusert MMP-9 mRNA uttrykk (Fig 2B). Det ble vist at å banke ned AP-en komponent c-Fos og c-Jun også redusert PMA-indusert MMP-9 uttrykk (Fig 2C). Videre er curcumin, et AP-1-inhibitor, som også ble anvendt for å undersøke rollen av AP-1 i PMA-induserte MMP-9 uttrykk. Når RT-PCR-data illustrerer, curcumin hemmet PMA-induserte MMP-9-ekspresjon i en doseavhengig måte (figur 2D). De ovenfor angitte data antyder at det AP-1 er en vesentlig faktor i MMP-9 uttrykk. Etter å demonstrere den avgjørende rollen til AP-1 i de høye nivåene av MMP-9-ekspresjon, har vi antatt at mekanismen for chrysin inhibering av MMP-9-ekspresjon var gjennom undertrykkelse av AP-1-aktivitet. Deretter ble AGS celler transfektert med AP-1 luciferaserapportørplasmid plasmider forbehandles med chrysin, og deretter stimulert av PMA. Som vist i figur 2E, chrysin trykkes PMA-indusert AP-1lucifease aktivitet på en doseavhengig måte, noe som indikerte at chrysin har en evne til å redusere AP-1-aktivitet.

Chrysin inhiberer PMA-induserte MMP-9 ekspresjon ved å inhibere transkripsjonsfaktor AP-1 via undertrykkelse av c-Jun og c-Fos fosforylering

det er vel kjent at c-Jun og c-Fos er komponenter av AP-1 veien [18]. Vi ønsket å bestemme mekanismen bak chrysin sin hemmende effekt på AP-1, og undersøkt om chrysin faktisk utøvet sin virkning på c-Jun og c-Fos. Vi målte mengden av total mRNA av både c-Jun og c-Fos ved RT-PCR. Som vist i figur 2F, hadde chrysin ikke hemmer uttrykket nivåer av c-Jun og c-Fos-mRNA. Ved siden av, for å teste om chrysin hemmer aktivering av c-Jun og c-Fos, ble Western blotting utført for å overvåke fosforylert c-Jun og c-Fos. Fig 2G og 2F viser at chrysin gjorde undertrykke PMA-induserte c-Jun og c-Fos fosforylering på en doseavhengig måte.

Chrysin hemmer c-Jun og c-Fos fosforylering ved å blokkere JNK og ERK signale pathway

Vi neste undersøkt hvordan chrysin trykt c-Jun og c-Fos fosforylering. På grunn av den viktige rolle MAPK spiller i aktiveringen av AP-1, undersøkte vi rollen av MAPK-reaksjonsveien i MMP-9 uttrykk. Som vist i figur 3A, blant MAPK-inhibitorer, PD98059 (ERK1 /2-inhibitor), SP600125 (JNK1 /2-inhibitor), og SB203580 (p38 MAPK-hemmer), bare PD98059 og SP600125 var i stand til å inhibere PMA-induserte MMP-9 uttrykk , noe som indikerte at ERK1 /2 og JNK1 /2 veier kan være avgjørende for PMA-induserte MMP-9 uttrykk. Videre med MEK-dominant negativ plasmid PMCL-K97M, JNK-dominant negativ plasmid PMCL-TAM67 og p38 MAPK-dominant negativ plasmid PMCL-MP38, bekreftet vi de kritiske roller ERK og JNK i MMP-9 uttrykk i magekreft AGS celler (figur 3b). Dessuten, som vist i figur 3C, ERK1 /2 og JNK1 /2 er kritisk kreves for AP-1-aktivering av PMA, demonstrert gjennom vårt eksperiment med MEK og JNK dominant negative plasmider. Vi neste sjekket roller JNK1 /2 og ERK1 /2 i c-Jun og c-Fos aktivering. Som vist i figur 3D, SP600125 og PD98059 trykkes PMA-induserte c-Jun og c-Fos fosforylering, henholdsvis, noe som indikerer at JNK1 /2 er kritisk oppstrøms av c-Jun, mens ERK1 /2 er kritisk oppstrøms av c-Fos. Siden vi oppdaget at JNK1 /2 og ERK1 /2 Dato viktige roller i MMP-9-ekspresjon via AP-1, hypotese vi at chrysin kan arbeide gjennom en inhibering av JNK1 /2 eller ERK1 /2 for å undertrykke MMP-9 uttrykk. For å bekrefte vår hypotese, ble western blotting utført for å bestemme effekten av chrysin på JNK1 /2 eller ERK1 /2 fosforylering. Som figur 3E og 3F show, PMA behandling førte til en bemerkelsesverdig økning i JNK1 /2 og ERK p42 /44 fosforylering; imidlertid, i nærvær av chrysin, PMA-induserte JNK1 /2 og ERK1 /2 fosforylering ble inhibert på en doseavhengig måte.

Effekt av chrysin på celle invasivitet

Det har vært kjent at høye nivåer av MMP-9 uttrykk er viktige for den invasive fenotype av cancerceller. For å undersøke effekten av chrysin på PMA-indusert celle invasjon, undersøkte vi celle invasjon gjennom en modifisert Boyden invasjon kammeret. AGS celler inkubert i PMA resulterte i et økt antall invaderte celler som passerte gjennom den kunstige matrigel. Imidlertid, i nærvær av chrysin eller en MMP-9-antistoffet, antallet invaderte celler ble redusert, noe som indikerer chrysin kan undertrykke PMA-induserte celle invasivitet ved å inhibere MMP-9-ekspresjon (Fig 4A og 4B). I tillegg viser figur 4C chrysin redusert PMA-induserte AGS invasjon i en doseavhengig måte. Deretter undersøkte vi effekten av signal inhibitoren på PMA-induserte AGS celle invasjon. Som vist i figur 4D, chrysin, curcumin, PD98059 og SP600125 hemmet celle invasjon indusert av PMA, noe som indikerer at chrysin sannsynligvis inhiberer PMA-induserte MMP-9 via AP-1-undertrykkelse, noe som resulterer i å blokkere JNK1 /2 og ERK1 /2 veier .

Diskusjoner

naturlig forekommende forbindelser med anti-kreft aktiviteter forstyrre tumor utvikling og progresjon av kreft ved å hemme ulike mekanismer inkludert celle migrasjon, invasjon og metastasering. Chrysin, en naturlig flavonoid vidt finnes i mange planteekstrakter, honning og propolis, har chemopreventive egenskaper som anti-proliferative og pro-apoptose aktiviteter mot ulike kreftformer [19,20]. Men anti-invasjons egenskaper chrysin har ikke vært godt studert i mage kreftceller. Det er velkjent at MMP'er er kraften bak ødeleggelse av den ekstracellulære matriks, så vel som de viktigste induserer celle invasivitet. Vi undersøkte hemmende effekter av chrysin på MMP uttrykk i mage kreftceller. Chrysin hemmet MMP-9-ekspresjon (Fig 1) og andre MMP'er slik som MMP-2 og MMP-7 (data ikke vist). Den reguleringsmekanisme ved chrysin kan være avhengig av hver enkelt MMP, og i denne studien vi fokusere på MMP-9 regualtion.

PMA, forbol-12-myristat-13-acetat, en protein-kinase-aktivator, er ofte brukt som et biomedisinsk forskning verktøy i modeller for kreftutvikling. I denne studien, oppdaget vi PMA øket MMP-9 aktivitet ved oppregulering av dets ekspresjon nivå. I nærvær av chrysin, PMA-induserte MMP-9 ble redusert i en chrysin-doseavhengig måte (figur 1A). Det synes imidlertid at chrysin hemmer MMP-9 ikke på grunn av hemming av MMP-9 enzymaktivitet, men på grunn av sin undertrykkelse av MMP-9 uttrykk. For å undersøke mekanismen som chrysin hemmer PMA-indusert MMP-9 uttrykk, vi prøvde å finne den essensielle Transkripsjonsfaktor (e) i PMA- indusert MMP-9 uttrykk veien. Det har blitt rapportert at AP-1 er den positive regulator av MMP'er: AP-1-elementet som ligger mellom -72 og -66 spiller en viktig rolle i den transkripsjonelle regulering av MMP-1-genekspresjon, og mutasjoner av dette element dramatisk redusere basal aktivitet og respons av MMP-en promoter på ytre stimuli [21]. I MMP-9 promoter oppstrøms reguleringssekvens, er det to AP-1-bindingsseter (-533 og -79), som spiller viktige roller i MMP-9-ekspresjon i humane Caski celler [22]. I vår studie, AP-1 lokkefugl oligodeoksynukleotider, AP-1 hemmer curcumin, c-Jun og c-Fos siRNA forstyrret PMA-indusert MMP-9 uttrykk (Fig 2A-2D), som ga direkte bevis på at AP-en er kritisk nødvendig for å øke MMP-9 transkripsjon i magekreftceller. Basert på resultatene ovenfor, sluttes vi at chrysin hemmer MMP-9-ekspresjon ved undertrykkelse av AP-1-aktivitet. Figur 2E viser verifikasjon av vår spekulasjon: chrysin kan betydelig redusere AP-1-aktivitet på en doseavhengig måte. I tråd med foreliggende oppdagelse at chrysin hemmer AP-en målrettet gen MMP-9 via undertrykke AP-1-aktivitet, er det også blitt rapportert at chrysin hemmet andre AP-1 målgener for eksempel VEGF, COX-2 og ICAM-1 [ ,,,0],23-25]. I samsvar med andre funn, er det blitt oppdaget at luteolin, en plante flavonoid med en lignende struktur til chrysin, hemmer den LPS-induserte DNA-bindingsaktiviteten av AP-1 [26] betraktelig. Men den hemmende evne og mekanisme chrysin på AP-1 hadde ikke fullt ut undersøkt før denne studien. Derfor vi neste studert mekanismen som chrysin hemmer AP-1.

I tillegg til formidling av MMP-9 uttrykk, AP-1 også både induserer uttrykk for invasjon aktivatorer og undertrykker invasjon dempere. Som sådan, er AP-1 transkripsjonen en viktig faktor for regulering av invasive-relaterte gener [27]. AP-en består av enten homodimerer av Jun familiemedlemmer eller heterodimerer mellom medlemmer av c-Fos og c-Jun familier. Både c-Jun og c-Fos fosforyleres og aktiveres av ERK, p38 og JNK-kinase-systemer [28-30]. For å undersøke mekanismen for chrysin inhibering av AP-1, undersøkte vi c-Jun og c-Fos, de to hovedkomponenter av AP-1. Vi oppdaget at chrysin hemmet c-Jun og c-Fos aktivering ved å blokkere deres respektive fosforylering. I samsvar med våre funn, noen tidligere litteratur også rapportert at andre flavones f.eks quercetin, redusert AP-1 aktivitet gjennom å undertrykke c-Jun er trans inn i kjernen [31].

Vi var videre interessert i chrysin er hemmende mekanisme på c-Jun og c-Fos. JNK (c-Jun N-terminal kinase), et medlem av MAPK (mitogen-aktivert protein kinase) familie som regulerer et utvalg av biologiske prosesser involvert i tumorgenese, anses å være den avgjørende kinase av c-Jun-aktivering [32] . ERK, ekstracellulære signalregulerte kinase, spiller en rolle i regulering av en rekke cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og utvikling [33], og er rapportert å være det viktige kinase regulere c-Fos-aktivering [34]. I den foreliggende undersøkelse, finner vi direkte bevis på magekreft AGS celler som JNK er kritisk kreves for c-Jun-aktivering, mens ERK er essensiell kinase for c-Fos-aktivering (vist i figur 3D).

Basert på den ovenfor konklusjon, for videre å undersøke chrysin mekanisme for å undertrykke MMP-9, oppdaget vi at chrysin hadde en evne til å blokkere JNK1 /2 og ERK1 /2 fosforylering (figur 3E og 3F). I henhold til dette funnet, den hemmende effekten av andre flavoner på ERK1 /2 også har blitt rapportert.

Liu et al. rapportert at apigenin, en polyfenolisk flavon (4,5,7-Trihydroxyflavone), som finnes i en rekke urter og grønne bladgrønnsaker, inhiberer cellemigrering via undertrykkelse av ERK1 /2 fosforylering i humane blæreglattmuskel-celler [35]. Det har også blitt oppdaget av Ishikawa et al. at H _{2o 2 øker apoptose, som fører til hurtig fosforylering av JNK, ERK, og p38 MAPK, mens quercetin kan oppheve aktivering av disse tre MAPK i respons til H 2o 2 [ ,,,0],36].}

i den foreliggende studien undersøkte vi den hemmende effekten av chrysin på MMP-9-ekspresjon og avslørte den underliggende mekanisme i magekreftceller AGS for første gang. Basert på våre funn, beskriver vi en hypotetisk skjematisk modell som illustrerer mekanismen for chrysin inhibering av MMP-9 uttrykk, slik som vist i figur 5. Videre undersøkelser skal gjennomføres for å undersøke om det er et viktig enzym oppstrøms for både JNK1 /2 og ERK1 /2, kritisk styring JNK1 /2 og ERK1 /2 fosforylering. I så fall kan chrysin direkte samhandle med essensielle enzymet, som bør være grundig undersøkt som en potensiell anti-kreft terapeutisk.

Ulike adjuvant terapeutiske strategier for å undertrykke metastase og hindre tumorresidiv har blitt utforsket og gir mange muligheter for pasienters restitusjon. Nylig, har bruken av naturlige fytokjemikalier fått omfattende studie for å forebygge kreft [37]. Videre har inntaket av fytokjemikalier nylig fått oppmerksomhet i magekreft forebygging [38]. I denne studien fant vi at chrysin-behandlede celler kan redusere kreft invasivitet via hemme MMP-9 uttrykk gjennom undertrykkelse av JNK /c-Jun og ERK /c-Fos signalveier. Disse funnene kan gi nyttig bevis for å utvikle fremtidige anti-kreftbehandling for magekreft.

• PLoS ONE: Tap av Expression of Reprimo, en p53-indusert cellesyklus arrest Gene, korrelerer med Invasive Stage for tumorprogresjon og p73 uttrykk i Gastric Cancer
• PLoS ONE: Deregulering mellom MIR-29b /c og DNMT3A er assosiert med epigenetisk stanse av den CDH1 Gene, påvirker celle migrasjon og invasjon i Gastric Cancer