PLoS ONE: Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1) Promoter Polymorphismen sind mit unteren Bauchtumorbildung in Ost-indischen Bevölkerung Linked

Abstrakt

Die Expression von Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP-1), einer interstitiellen Kollagenase, spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Invasion während der Entwicklung von Magenkrebs, eine führende Todesursache weltweit. A single-nucleotide polymorphism (SNP) -1607 1G /2G-Stelle des MMP-1-Gen-Promotor wurde berichtet Transkriptionsebene zu verändern. Während die anderen SNPs die Bedeutung in der MMP-1-Promotor noch nicht in Magenkrebs untersucht wurde, war es unser Ziel MMP-1-Gen-Promotor-Polymorphismen und Magenkrebsanfälligkeit im östlichen indischen Bevölkerung zu untersuchen. Insgesamt 145 Patienten mit Magenkrebs und 145 gesunde Kontrollen wurden für MMP-1 -1607 1G /2G (rs1799750) durch PCR-RFLP (RFLP), während MMP-1 -519 A /G (rs1144393), MMP genotypisierter -1 -422 T /A (rs475007), MMP-1 -340 T /C (rs514921) und MMP-1 -320 T /C (rs494379) wurden durch DNA-Sequenzierung genotypisiert. Eine positive Korrelation wurde mit MMP-1 -422 T /A SNP, die eine signifikante Gefahr für die regionale Lymphknotenmetastasen ( P
= 0,021, Odd des Ratio (OR) = 3,044, Konfidenzintervall (CI) = 1,187 gefunden -7,807). Darüber hinaus fanden wir eine signifikante Assoziation mit einer geringeren Bildung Magentumor bei Magenkrebs-Patienten für drei benachbarte Polymorphismen in der Nähe der Transkriptionsstartstellen von [MMP-1 -422 T /A ( P
= 0,043, OR = 2,182 , CI = 1,03 bis 4,643), MMP-1 -340 T /C ( P
= 0,075, OR = 1,97, CI = 0,94 bis 4,158) und MMP-1 -320 T /C ( P
= 0,034, OR = 2,224, CI = 1,064-40.731)]. MMP-1-Ebene in Patientenserum wurde korreliert mit MMP-1-Promotor Haplotypen diese drei SNPs verleihen die funktionelle Bedeutung dieser Polymorphismen in den unteren Magentumorbildung und signifikante Korrelation beobachtet wurde, zu bewerten. Weiterhin angezeigt MMP-1 -519 A /G-Polymorphismus schlechte zelluläre Differenzierung ( P
= 0,024, OR = 3,8, CI = 1,69-8,56) ein höheres Risiko für Krebs Progression zuzuschreiben. Abschließend werden MMP-1 proximalen Promotor SNPs mit dem Risiko der unteren Magentumorbildung und Knoten Metastasen im östlichen indischen Bevölkerung assoziiert

Citation:. Dey S, Ghosh N, Saha D, Kesh K, Gupta A, Swarnakar S (2014) Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1) Promoter Polymorphismen sind mit unteren Bauchtumorbildung in Ost-indischen Bevölkerung verbunden sind. PLoS ONE 9 (2): e88040. doi: 10.1371 /journal.pone.0088040

Editor: Redhwan Ahmed Al Naggar, Gesundheit der Bevölkerung und Präventivmedizin, Malaysia

Received: 2. September 2013 beginnen; Akzeptiert: 3. Januar 2014; Veröffentlicht am: 5. Februar 2014

Copyright: © 2014 Dey et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Sanjib Dey Empfänger von Senior Research Fellowship war vom Indian Council of Medical Research (ICMR), Indien. NG und KK sind Empfänger von Senior Research Fellowship vom Rat für wissenschaftliche und industrielle Forschung (CSIR). Die Arbeit wurde durch Gewährung IAP001 des Rates für wissenschaftliche und industrielle Forschung (CSIR), Indien, NBA07 der Abteilung für Biotechnologie (DBT), Indien unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der führenden Ursachen von Krebs im Zusammenhang mit dem Tod in der Welt [1]. Auf globaler Ebene, Konten Magenkrebs (GC) für jährlich rund 800.000 Todesfälle. Mehr als 70% der GC Fälle treten in Entwicklungsländern und die Hälfte der Weltgesamt tritt in Ostasien [1]. Es ist ein führendes Problem im Nordosten und südlichen Staaten des indischen Subkontinents [2]. Die Inzidenz von Magenkrebs ist von Land zu Land, wahrscheinlich als Folge von genetischen, epigenetischen und Umweltfaktoren. Helicobacter pylori
Infektion wird als ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Magenkrebs besonders Krebs im unteren Teil (noncardia) des Magens [3] betrachtet. Eine kombinierte Analyse von 12 Studien von H. pylori
und Magenkrebs geschätzt, dass das Risiko des Adenokarzinoms in nicht-Cardia Regionen des Magens war fast sechsmal höher für H. pylori
-infizierten Personen als bei nicht-infizierten Personen [3].

Neuere Studien zeigen, dass, Karzinogenese ist ein mehrzelliger und mehrstufigen Verfahren, bei dem die Zerstörung des Gewebes Mikroumgebung ist eine Voraussetzung für die Umwandlung von normales Gewebe auf Tumor [4]. Daher molekulare Analyse des Gewebes Mikro und seine Deregulierung bei Neoplasie ist ein wichtiger Schritt, um die Mechanismen der malignen Erkrankungen zu kennen. Matrix (MMPs), sowohl von Tumorzellen und normalen Zellen produziert, verändern die Mikroumgebung durch extrazelluläre Matrix zu verschlechtern, und nachfolgende zelluläre Signale führen zu den frühen Stadien der Tumorbildung [5]. Mehrere der MMPs haben die einzigartige Fähigkeit, die interstitielle Kollagene (z.B. I, II und III) zu zersetzen, die am häufigsten vorkommenden Proteine ​​des Körpers. MMP-1 ist die ubiquitär exprimiert interstitielle Kollagenase [6] und ihre Überexpression mit verschiedenen pathologischen Zuständen verbunden sind, einschließlich der Tumorinvasion und Metastasierung [7]. [12] - die Überexpression von MMP-1 mRNA wurde in einer Vielzahl von Krebsarten, wie Magenkrebs, Dickdarmkrebs und Speiseröhrenkrebs [8] gezeigt. Die Überexpression von MMP-1-Protein ist mit einer schlechten Prognose von Speiseröhrenkrebs und Darmkrebs assoziiert [10], [11]. Diese MMP-1-Überexpression kann in die Nebeneinanderstellung des Transkriptionsfaktors zurückzuführen Seiten und Kooperativität unter den Faktoren, die Bindung an diese Stellen innerhalb der Promotorregion des MMP-1-Gens binden [13].

Die Promotorregion von MMP-1 enthält ein Guanin Einfügen /Löschen-Polymorphismus (1G /2G-Polymorphismus) an Position -1607, die die Sequenz 5'-GGA-3 'erzeugt, die ein 2G Allel aufweist. Die Anwesenheit eines 2G-Polymorphismus könnte Transkriptionsaktivität von endogenen MMP-1 erhöhen, weil der Guanin-Insertion eine Bindungsstelle für ein Mitglied der Familie Transkriptionsfaktor Ets schafft. Die 2G Allel kann zu einer erhöhten Invasivität von Endometrium-Karzinomen, für die Entwicklung von Eierstockkrebs, Lungenkrebs und Darmkrebs [14] beitragen - [21].

Studien in mehreren anderen Genen haben ein neues Paradigma zur Verfügung gestellt in die die Transkription eines Gens ist wahrscheinlicher durch mehrere Polymorphismen in der Promotorregion befindet beeinflusst zu werden, die gemeinsam wirken, um eine Haplotyp-Effekt [22], [23] ausübt. Mehrere andere Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (-519A /G, -422T /A, -340C /T, und -320C /T) in der MMP-1-Gen-Promotor wurden kürzlich identifiziert worden [24]. Funktionellen Wirkungen dieser Polymorphismen auf die MMP-1-Gen-Promotor-Aktivität wurden in Zelllinien von Melanom (A2058 und A375) beurteilt, Brustkrebs (MCF7 und MDA-MB-231), Lungenkarzinom (A549 und H69) und Darmkrebs ( HT-29, SW-620) durch die Promotorstärken der 10 am häufigsten Haplotypen aus dieser Polymorphismen [24] abgeleitet vergleicht. Obwohl die verstärkte Expression von MMP-1 mit lokalen Invasion und einer schlechten Prognose bei Magenkrebs [25] verbunden war, ist die Rolle der MMP-1-Promotor SNPs und deren Haplotypen in der Entwicklung von Magenkrebs ist derzeit nicht bekannt in jeder menschlichen Bevölkerung.

In der vorliegenden Studie führten wir eine Krankenhaus-Fall-Kontroll-Studie über die Assoziierung der MMP-1-Gen-Promotor SNPs [-1607 1G /2G (rs1799750) (MMP-1.1) zu erkunden, -519A /G (rs1144393) (MMP-1.2), -422T /A (rs475007) (MMP-1.3), -340C /T (rs514921) (MMP-1,4) und -320C /T (rs494379) (MMP-1,5)] und deren Haplotypen mit dem Risiko von Magenkrebs Entwicklung in einer östlichen indischen Bevölkerung. Wir untersuchten auch die Beziehung zwischen den Polymorphismen und der klinisch-pathologischen Faktoren bei Patienten mit Magenkrebs. Die Studie zeigte die putative Assoziation von MMP-1.3, MMP-1,4 und MMP-1,5-Polymorphismen mit dem Risiko der Bildung unteren Magentumor in Magenkrebs. Die funktionelle Bedeutung von MMP-1 Polymorphismen im unteren Magentumorbildung wurde durch Haplotyp Wirkungen dieser Polymorphismen auf die MMP-1-Expression im Serum bestätigt. Es wurde jedoch kein Zusammenhang mit dem Auftreten von Magenkrebs für eine der oben genannten fünf SNPs der MMP-1-Promotor und die daraus resultierenden Haplotypen gefunden

Materialien und Methoden

Studie Themen:. Eastern Indian Fall-Kontroll-Kohorte

der östliche indische Fall-Kontroll-Kohorte bestand aus 145 Magenkrebs-Fälle und 145 Kontrollpersonen. Die Studienprotokolle (2008-2014) wurden von den Ethical Review Boards des Saroj Gupta Cancer Center und Forschungsinstitut, Kolkata, Abteilung für Magen-Chirurgie, Medical College und Krankenhaus, Kolkata, IPGMER, Kolkata Krankenhäuser und der Menschenethikkommission der genehmigten Indian Institute of Chemical Biology, Kolkata, Indien. Alle Patienten mit einer klinischen Diagnose von Magenkrebs die Krankenhausabteilungen von Gastro-Onkologie des Saroj Gupta Cancer Center und Forschungsinstitut, Kolkata, der Abteilung für Magen-Chirurgie, Medical College und Krankenhaus, Kolkata besuchen und die IPGMER, Kolkata im Juni 2008 Mai 2013 wurden aus dem Krankenhaus Register identifiziert und während der Follow-up-Untersuchungen in Kontakt gebracht. Alle Teilnehmer gaben für die Teilnahme informierte Zustimmung geschrieben. Die Patienten Demographie, Symptome und Grading wurden aufgezeichnet und Blutproben gesammelt, nachdem eine klinische Geschichte nehmen und klinische und endoskopische Untersuchungen durchführen. Die histologische Tumor Typisierung wurde auf der Grundlage von Biopsien oder reseziert Proben bestimmt. Die Ausschlusskriterien enthalten Vorgeschichte von anderen metastasierten Krebs außer Magenkrebs. Die Möglichkeit von Magengeschwüren, ohne Krebs Läsion hatte durch Histopathologie von Magen-Läsion ausgeschlossen. Die Diagnose von Magenkrebs und TNM-Staging wurde allgemein anerkannten klinischen basierend auf, histologischen, radiologische und Immunofluoreszenz Ergebnisse und die des amerikanischen Gemischten Ausschusses für Krebs (AJCC) und der International Union Against Cancer (UICC) Kriterium [25]. Personen, die waren früher oder die zur Zeit wurden Tabak süchtig für mindestens 2 Jahre wurden definiert als Tabak süchtig. Personen, die diese Krankenhäuser zu einer Routineuntersuchung besucht und wer waren ohne eine Geschichte oder Diagnose eines Krebs oder genetische Krankheiten wurden auch für die Studie teilnehmen und freiwillig zu spenden Blut gefragt. Diese Themen wurden gesunden Kontrollen berücksichtigt. Alle von den Krebspatienten und Kontrollpersonen waren in keinem Zusammenhang und indischer Nationalität von West Bengal oder die umliegenden östlichen indischen Bundesstaaten. Diese Population wurde Vertreter einer ostindischen Bevölkerung betrachtet.

DNA-Extraktion und Serumgewinnung

Von jedem Probanden wurden 5 ml venöses Blut wurden aseptisch in Vacutainerröhrchen gezogen (Qiagen, USA), die EDTA und bei 4 ° C vor der genomischen DNA-Extraktion gelagert. Genomische DNA wurde aus 3,5 ml Vollblut innerhalb von zwei Wochen nach der Probennahme unter Verwendung eines QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, USA) nach dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Unmittelbar Blutentnahme folgenden, additional1.5 ml Vollblut wurde bei 1800 g zentrifugiert 5 min die Serumfraktion zu erhalten. Die Serumproben wurden bei -80 ° C bis zur Analyse gelagert

Grundierungen und PCR-Amplifikation der Promotorregion von MMP-1-Gene

Grundierungen mit FastPCR Software (http gestaltet: //www.. biocenter.helsinki.fi), um Promotorregionen der MMP-1-Gen, um zu verstärken, um Polymorphismen zu analysieren durch Sequenzierung (Tabelle 1). PCR wurde in einem PCR Thermal Cycler SPRINT (Thermo Electron Corporation, Japan) durchgeführt. Die Zielsequenz wurde in einem 25 ul Reaktionsvolumen, das 10 bis 20 ng genomische DNA, 0,2 mM dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl 2, amplifiziert 0,3 uM jedes Primers und 1,0 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Fermentas Taq DNA-Polymerase, Fermentas, USA). Die PCR-Amplifikation wurde für 30 s mit 35 Zyklen von Denaturierung bei 94 ° C, Annealing bei 58 ° C-59 ° C für 1 min (Tabelle 1) und 30 s nach der anfänglichen Aktivierung bei 72 ° C durch Erweiterung gefolgt Schritt von 94 ° C für 5 min. PCR-Fragmente wurden verglichen mit 100 bp DNA-Leiter analysiert (Fermentas, USA) auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 1,5% Agarose-Gel (Cat No. 014011, Sisco Research Laboratories, Indien) für 60 min laufen bei 100 V

Für die Genotypisierung durch Sequenzierung Genotypisierung alle unincorporated dNTPs wurden dephosphoryliert und unincorporated Primer wurden aus dem PCR-Produkt von Garnelen alkalische Phosphatase (Fermentas, USA) entfernt und Exonuklease-I-Enzym (Fermentas, USA). PCR-Produkte wurden für die Sequenzierung mit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) verwendet und sequenziert ein ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer mit (Perkin-Elmer ABI, Foster City, CA.) Nach dem Protokoll des Herstellers. Das PCR-Amplikon wurde in beide Richtungen mit vorwärts sequenziert und PCR-Primer umkehren die Möglichkeit, Kompressionsartefakte zu eliminieren. Die Sequenzierung Chromatogramme wurden unter Verwendung von Sequenz Scanner Software v1.0 (Applied Biosystems, USA) analysiert Veränderungen der Nukleotide zu analysieren und somit Genotypen

Die MMP-1.1 1G /2G Polymorphismus von PCR-Genotypisierung wurde -.
RFLP (RFLP) -Methode mit AluI
Enzym (New England Biolabs, Inc. (NEB), Ipswich, MA)., wie zuvor beschrieben [26]

Enzym- Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Serum MMP-1 Protein-Ebene (pro und aktiv) bei Patienten mit oberen Magenkrebs mit nicht Risiko-Haplotypen, und in den unteren Magenkrebs mit Risiko-Haplotypen (enthält ein oder mehrere Risikoallele) mit einem handelsüblichen MMP-1 ELISA-Kit (ab10063, Abcam, USA) verglichen wurden, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Serumproben wurden verdünnt (01.05 v /v) in Assay-Verdünnungsmittel in dem Kit bereitgestellt. Kurz gesagt, bei 37 ° C im Kit und inkubiert 2,5 Stunden bereitgestellt 100 ul der Standards, Leer- und verdünnten Serumprobe wurden in die anti-human MMP-1 vorbeschichteten 96-Well-Platte pipettiert. Nach mehrmaligem Waschen wurde biotinyliertes anti-human MMP-1-Antikörper (verdünnt 1:1000) in die Vertiefungen gegeben und die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Abwaschen ungebundenen biotinylierten Antikörper, HRP-konjugiertem Streptavidin entfernt wird in die Vertiefungen pipettiert. Die Platte wurde erneut für 45 min inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen wurden 100 &mgr; l des Substrats tetramethylbenizidine in jede Pipette gut, und die Platte wurde für 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur (25 ° C) inkubiert. Eine Stop-Lösung wurde nach Abschluss hinzugefügt. Jede Probe wurde in Doppelbestimmung getestet. Die Absorptionswerte der Zuschnitte, Proben und Standards wurden bei einer Wellenlänge von 450 nm auf einem Mikroplatten-Lesegerät abgelesen. Die Höhe der MMP-1-Protein in den Proben wurde durch Vergleich mit der Standardkurve erhalten, aus Standard, der von der Herstellung zugeführt wird erzeugt. Die minimale nachweisbare Menge von MMP 1 betrug 8 pg /ml.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde durchgeführt, mit der SPSS-Software (Version 16.0J. SPSS, Inc., Chicago, IL, USA ). Signifikante Unterschiede zwischen den Alters bei Interview für Kontrollen und Alter bei der Diagnose für Krebsfälle wurden mit dem t-Test nach Student für den Vergleich von Mitteln mit GraphPad InStat3 Software (GraphPad Software, Inc., San Diego Kalifornien USA) bewertet. Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) Analysen wurden durchgeführt, beobachteten, zu vergleichen und zu erwarten Allelfrequenzen ein Chi-Quadrat-Test für die Kontrollen, dass jede Markierung im Gleichgewicht war, um sicherzustellen, ( p
> 0,05). Die Moll-Allelfrequenz (MAF) ( -Modell
Option) und HWE ( -hardy
Option) für jeden SNP wurde von der Kontrollpopulation mit Plink v0.99 [27] geschätzt. Case-Steuerdaten wurden analysiert unter Verwendung von zweiseitigen 2-by-2 oder 2-by-3 Kontingenztafeln nach dem Genotyp durch die Pearson Chi-Quadrat-Test. Die Odds Ratio (OR) und 95% Konfidenzintervall (CI) der Genotypen wurden aus einer multivariaten logistischen Regressionsmodell für das Alter (kontinuierliche Variable), Geschlecht und Tabakabhängigkeit angepasst berechnet. In dieser Studie definiert wir, dass das 1G Allel des 1G-1607 2G SNP, das A-Allel des A-519G SNP, das A-Allel des T-422A SNP, das T-Allel des T-340C SNP und T Allel des T-320C SNP-Allele waren Referenz. Die Ergebnisse wurden mit über Allele als Referenz ausgewertet, um die multinomial logistischen Regressionsmodells. Bei der Analyse der Beziehung zwischen dem SNP-Genotypen und Krankheitsstatus von GC, dem Stadium von Krebs, wurden histologische Klassifizierung und die Tiefe der Tumorinvasion in Binärdaten (Phase I + II + III vs. Stufe IV umgewandelt, gut differenzierte + moderat differenzierten vs. schlecht differenzierten und T1 + T2 vs. T3 + T4). Die Beziehung zwischen Genotyp Verteilungen und Tumortiefe oder Stufe wurde auch eine multinomiale logistische Regressionsmodell für das Alter (kontinuierliche Variable) angepasst suchten unter Verwendung, des Geschlechts und der Tabakabhängigkeit als potentieller Störfaktor. Haplotyp-Frequenzen wurden mit dem Programm Haploview analysiert (ver. 4.1, Broad Institute, Chembridge, USA) [28]. Alle Ergebnisse wurden als statistisch signifikant betrachtet, wenn die p
Wert war < 0,05. Eine Post-hoc-Leistungsberechnung wurde die statistische Aussagekraft der vorliegenden Studie nach der Methode von Schlesselman, JJ [29] zu testen, durchgeführt.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Licht- und Elektronenmikroskopie der Europäischen Biber (Castor fiber) Magen Reveal Einzigartige Morphologische Merkmale mit möglichen allgemeinen biologischen Significance
• PLoS ONE: Self-Reported Magenverstimmung in Reisende auf Cruise-Based und Land-basierte Paket Holidays