Abstrakt
Wie Zellen integrieren mehrere Mustersignale frühen endoderm Regionalisierung zu erreichen bleibt weitgehend unbekannt. Zwischen Gastrulation und Neurulation, Retinsäure (RA) Signalisierung erforderlich ist, während Wnt /β-Catenin-Signalisierung für die Spezifikation der Bauchspeicheldrüse, der Speiseröhre, des Magens und Duodenums primordia in Xenopus Citation:. Zhang T Guo X, Chen Y (2013) Retinsäure-Activated Ndrg1a Zügelt Wnt /β-Catenin zu erlauben Signaling Xenopus Herausgeber: Michael Schubert, Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer, Frankreich Empfangen: 29. Dezember 2012; Akzeptiert: 22. April 2013 beginnen; Veröffentlicht: 31. Mai 2013 Copyright: © 2013 Zhang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem nationalen Grundlagenforschung Programm von China (2009CB941200) und der National Natural Science Foundation of China (31271554) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen Einführung Die Regionalisierung der endoderm tritt gleichzeitig mit seiner Bildung während der Gastrulation. Bis zum Ende der Gastrulation, breit anteroposterioren (AP) Domänen innerhalb der Endoderm festgelegt wurden, wie sie in der vorderen Ausdruck reflektiert von HHEX Retinsäure (RA) Signalgebung spielt eine konservierte Rolle in der AP Musterungs wirbel~~POS=TRUNC endoderm so früh wie gastrulation [9]. Studien in Frosch, Vogel- und Mäuse zeigen, dass die RA-Signalisierung speziell für die Bildung von dorsalen Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen erforderlich ist, und Duodenum primordia [10], [11], [12], [13], [14], [15]. In Zebrabärbling, RA-Signalisierung vor dem Ende der Gastrulation ist für die anfängliche Entwicklung von sowohl der Leber und der Bauchspeicheldrüse endoderm [16] erforderlich. RA aktiviert die Expression von RA-abbauenden Enzyms CYP26A1 Canonical Wnt-Signal spielt auch eine wichtige Rolle in der AP-Strukturierung wirbel endoderm. Bei Mäusen Verbindung Knockout von Tcf1 N-myc-Gen stromabwärts von 1 (NDRG1) geregelt gehört zur NDRG Protein Familie, bestehend aus vier Mitgliedern, NDRG1-4, die durch das eine NDR-Domäne und eine α /β-Hydrolase-fach-Motiv [27] gekennzeichnet sind. NDRG1 in dieser Studie verwendeten wir DNA-Microarray in Kombination mit whole mount in situ Hybridisierung RA regulierte Gene in Xenopus Ergebnisse | ndrg1a in Bezug auf endodermaler Organogenese Xenopus Um die Microarray-Daten zu überprüfen, analysierten wir ndrg1a anzusprechen, wenn RA direkt regulieren ndrg1a Zur Erzeugung ndrg1a um zu testen, ob Ndrg1a funktionell RA Signalisierung vermitteln foregut endoderm zu spezifizieren, injizierten wir MO1, MO2 oder CoMo separat in den pflanzlichen Teil aller vier Blastomeren von 4-Zellen-Stadium Embryos gesammelt die Embryonen in den Stufen 36 und 42 und mit einem Panel von endodermalen Markergene analysiert. PTF1A Die erhaltenen Daten zeigen, dass MO1 und MO2 gleichermaßen effizient abgeschafft Insulin Die Injektion von sogar 4 ng ndrg1a Mechanistisch mit Wnt-Rezeptor LRP6 und blockieren Wnt /β-Catenin-Signalweg in Krebszelllinien [37] interagieren NDRG1 können. Zu fragen, ob RA Ndrg1a aktiviert können Wnt /β-Catenin-Signalweg in Xenopus Um zu testen, ob RA, Ndrg1a und Wnt /β-Catenin-Signalweg sind funktionell in der gleichen Kaskade verbunden Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm-Spezifikation bei der Kontrolle, wir koinjizierten ndrg1a in voller Übereinstimmung mit der früheren Studie [22], die Aktivierung von kanonische Wnt-signal~~POS=TRUNC in Xenopus Es wurde gezeigt, dass ATF3, ein Ziel Wnt /β-Catenin Gen in Krebszelllinien [37], können entweder transkriptionell repress Pdx1 Diskussion ndrg1a und Videos RA in den archenteron Dach Entodermzellen von Xenopus Mehrere Studien haben beschrieben Microarray-basierten Screening von RA ansprechenden Genen in Xenopus Ndrg1a ist Unentbehrlich für Xenopus Frühe endodermaler Ausdruck CYP26A1 Eine Reihe von Studien zeigen, dass eine Überexpression von NDRG1 in Krebszelllinien auffällige Phänotypen erzeugt [27]. Es wird auch berichtet, dass Überexpression von Ndrg1a in Xenopus Während der Embryonalentwicklung Zellen müssen ständig mehrere Signalwege integrieren ihre unterschiedlichen Schicksal zur richtigen Zeit und Ort zu erreichen. Die integrierte Rolle von FGF, RA, und Wnt-Signalwege Lungenanlage bei der Festlegung und Kontrolle Wachstum Lunge Knospe in Mäusen definiert [65] ist konserviert in Xenopus Hier bieten wir überzeugende Beweise für die erste Zeit zeigt, zu unserem Wissen, dass RA endodermaler Expression von Ndrg1a reprimiert Wnt /β aktiviert -Catenin Signalisierungs- und folglich gibt die Unterdrückungs Aktivität von Wnt /β-Catenin-Signalisierung auf Xenopus
Embryonen unterdrückt werden muss. Im Versuch für RA reguliert Gene zu screenen Xenopus
endoderm identifizierten wir eine direkte RA Zielgen, N-myc nachgeschalteten reguliertes Gen 1a ( ndrg1a
), welche die Expression zeigte früh im archenteron Dach Endoderm und spät in der Bauchspeicheldrüse, der Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm entwickeln. Sowohl Antisense-Morpholino Oligonukleotid vermittelte Knockdown von ndrg1a
in Xenopus laevis
und die Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (TALEN) vermittelte Störung der NDRG1
in Xenopus tropicalis
zeigen, dass wie RA-Signalisierung wird Ndrg1a speziell erforderlich für die Spezifikation von Xenopus
Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm primordia. Immunofluoreszenz Daten deuten darauf hin, dass RA-aktivierte Ndrg1a unterdrückt Wnt /β-Catenin-Signalweg in Xenopus
archenteron Dach Entodermzellen. Blocking Wnt /β-Catenin-Signalweg geretteten Ndrg1a Knockdown Phänotyp. Weiterhin Überexpression des putative Wnt /β-Catenin Zielgen phenocopied ATF3 Zuschlags von Ndrg1a oder Hemmung von RA-Signalisierung, während ATF3 Zuschlags Ndrg1a Knockdown Phänotyp retten kann. Schließlich war die Bauchspeicheldrüse /Magen /Duodenum Transkriptionsfaktor Pdx1 Lage ATF3 Überexpression oder Ndrg1a Knockdown Phänotyp zu retten. Zusammen schließen wir, dass RA aktiviert Ndrg1a Wnt /β-Catenin drückt die Spezifikation der Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm-Vorläuferzellen in Xenopus
Embryonen zu erlauben Signalisierung
Pancreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm-Spezifikation. PLoS ONE 8 (5): e65058. doi: 10.1371 /journal.pone.0065058
, VPP1
, Sox2
und Foxa2
und der hintere Ausdruck des Schwanz- Typ homeobox
Gene em <> Cdx1
, 2
und 4
[1], [2], [3]. Schließlich gibt der Endoderm Aufstieg an die Epithelien der Atmungs- und Verdauungstrakt und die zugehörigen Organe, wie die Schilddrüse, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Leber und Gallenblase. Die Linie für wirbel endodermaler organogenesis Tracing ist weitgehend abhängig von den vitalen Farbstoffmarkierung basierten Schicksal Mapping Studien [4], [5], [6], [7], [8]. Der frühe Expression von HHEX
und VPP1
in Xenopus
Embryonen, die Vorläufer für die Leber und Bauch Bauchspeicheldrüse zu reflektieren könnte dienen, jeweils [3]. Bisher gibt es nur wenige spezifische Markergene berichtet, die Vorstufen für dorsal Pankreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm während der Gastrulation und Neurulation abgrenzen kann.
im vorderen Kofferraum endoderm wiederum moduliert RA-Signalisierung und definiert die vordere Grenze von Pankreas Feld in Genaktivität [17]. mnx1
wird als RA Downstream-Gen identifiziert, die Beta-Zell-Bildung in der Dritten Zebrabärbling endokrinen Pankreas fördert [18], während RA Downstream-Gen exdpf
Fisch exokrinen Pankreas Entwicklung reguliert [19]. Die endodermaler RA Zielgene, die die frühen Aktivitäten der RA-Signalisierung vermitteln zu spezifizieren, die Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm Anlagen richtige identifiziert werden bleiben.
und Tcf4
zu einer vorderen Transformation von Duodenum in den Magen geführt mit wenig oder ohne Darm entwickelt [20]. Der Magen mesenchymalen Transkriptionsfaktor Barx1-vermittelte Sekretion des Wnt-Antagonisten SFRP1 und SFRP2 erforderlich endodermalen Wnt /β-Catenin-Signalisierung zu hemmen und somit Spezifikation des Epithels Magen zu ermöglichen [21]. Konsequent in Xenopus
, Wnt /β-Catenin-Signalweg ist in anteriore Endoderm zwischen Gastrula und frühen somite Entwicklungsstadien unterdrückt werden, um die Bildung der Leber sowie die Bauchspeicheldrüse, Magen und Zwölffingerdarm primordia [zu ermöglichen ,,,0],22], [23]. Die sekretierte Wnt-Antagonist SFRP5
im ventralen foregut endoderm koordiniert die Leber und ventralen Pankreas Spezifikation ausgedrückt durch beide kanonisch und nichtkanonischer Wnt-Signal Antagonisierung [24], [25]. Darüber hinaus wurde gefunden, dass RA kann sich gezeigt reprimieren Xenopus
blastula Wnt /β-Catenin-Signalisierung [26].
ist ein RA-induzierbaren Gens in verschiedenen Zelllinien und menschlichen Patienten [28], [29], [30], [31]. NDRG1
Defizienz in Mäusen führt zu Schwann Zelldysfunktion, was darauf hindeutet, dass NDRG1 für die Wartung der Myelinscheiden in peripheren Nerven wesentlich ist [32], [33]. NDRG1
-null Mäuse auch beeinträchtigter Mastzellreifung und Degranulation zeigte und abgeschwächte allergischen Reaktionen [34]. In Xenopus
, NDRG1
wurde als ein Gen angereichert für die Expression in endoderm und pronephros [35], identifiziert [36]. Eine kürzlich veröffentlichte Studie Krebszelllinien zeigt, dass die Tumormetastasierung-Suppressor-Gen, NDRG1, Wnt /β-Catenin-Signalweg unterdrückt durch direkt mit dem Wnt-Rezeptor, LRP6 interagieren, damit die Unterdrückung der Wnt /β-Catenin-Zielgens verursacht, ATF3
Ausdruck [37]. Aktivierenden Transkriptionsfaktor 3 (ATF3) gehört zu der ATF /cyclisches AMP reagierendes Element-Bindungsfamilie basischer Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktoren. Es ist eine adaptive Antwort Gen und kann sowohl als transkriptioneller Aktivator oder Repressor wirken je nach Zelltyp und Stimulus [38], [39], [40]. ATF3
Knockout-Mäuse normal entwickelt und zeigte keine unterscheidbaren Phänotypen unter normalen Bedingungen [41]. Im Gegensatz dazu transgenen Mäusen ATF3 in Leber, Pankreas Milchgangsepithel exprimieren, oder Pankreas β-Zellen führte zu Leberfunktionsstörungen, Defekte in endokrinen Pankreas-Entwicklung, oder islet Dysfunktion bzw. [41], [42], [43].
endoderm Bildschirm. ndrg1a
wurde identifiziert und verifizierte von RA im archenteron Dach endoderm und spät in der Entwicklung der Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm direkt aktiviert. Wir liefern Beweise Verwicklung dass RA-activated Ndrg1a reprimiert Wnt /β-Catenin-Signalisierung in den Entodermzellen archenteron Dach und folglich gibt die Hemmwirkung von Wnt /β-Catenin-Signalaktivitäten auf die Bildung von Pankreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm.
, ein RA reguliertes Gen wird ausgedrückt in den frühen endodermal Darmes Dach
Embryonen mit einem RA-Antagonisten behandelt werden, BMS453, vor dem Ende der Gastrulation angezeigt spezifischen Verlust des dorsalen Pankreas und ventralen Teil des Pankreas, Magen, Zwölffingerdarm und [10]. Bis RA regulierter Gene in Endoderm identifizieren, haben wir ersten Microarray-Analyse verglichen Genexpressionsniveaus zwischen Wildtyp- und RA-defizienten Embryonen, die mit BMS453 zu Beginn der Gastrulation behandelt wurden, und wurden in den Stufen 12 gesammelt, 23, bzw. 34 . Die erhaltenen Daten zeigen, dass Gene herunterreguliert mehr als 2-fach in drei verschiedenen Phasen zeigte nur geringfügig überschneiden (Abb. S1 und Tabelle S1). In Embryonen im Stadium 23 gesammelt, gibt es 138 Gene, die nach unten reguliert wurden mehr als 2-fach bei BMS453 Behandlung. Nach den vorliegenden Informationen "138 Gene strukturelle und funktionelle in der NCBI-Datenbank, gaben wir Prioritäten Faktoren, Kinasen zu Transkription, RNA-bindende Proteine, Transmembranproteine, sowie Gene endodermaler Ausdruck zeigt, und wählte somit neun Gene (Tabelle S1) zu weiter analysieren ihre embryonale Expressionsmuster von whole mount in situ Hybridisierung. Einer von ihnen, ndrg1a
, zeigten eine spezifische Expression in den frühen archenteron Dach Endoderm (Fig. 1B), die nicht von früheren Studien festgestellt wurde, vermutlich aufgrund einer unzureichenden Empfindlichkeit der whole mount in situ-Hybridisierungstechnik in früheren Publikationen [35], [36]. Im Einvernehmen mit dem Bericht aus dem Labor Zorn [35], unsere Daten zeigen, dass ndrg1a
Transkripte wurden in Rücken endoderm am frühen Schwanzknospenstadium der Entwicklung (Fig. 1C, D, E, G) nachgewiesen. Am späten Schwanzknospe und Kaulquappe Stadien der Entwicklung, zusätzlich zu seinen Ausdruck in Auge, proctodaeum Vorläufer und pronephros, ndrg1a
zeigte spezifische Expression im Rachen, Speiseröhre, Bauchspeicheldrüse, Magen und Zwölffingerdarm (Abb. 1E , F, H, I, J). Wir waren nicht in der Lage zu erkennen, ndrg1a
Ausdruck in der Leber [35]. Stattdessen wird eine klare ndrg1a
Signal wurde bei der Entwicklung von Gallenblase beobachtet (Abb. 1I, J).
ndrg1a
Expression in Darmes Dach Entodermzellen wird direkt aktiviert durch RA
Ausdruck in BMS453 und RA behandelten Embryonen durch whole mount in situ Hybridisierung. Bei BMS453 Behandlung, Transkripte
keine ndrg1a wurden in archenteron Dach Entodermzellen nachgewiesen werden (Abb. 2E) und nur Spuren von ndrg1a
mRNA blieb in dorsalen endoderm der Stufe 22 Embryonen (Abb. 2H) . Später, ndrg1a
Expression in dorsalen Pankreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm vollständig unterdrückt und wurde in ventral Bauchspeicheldrüse (Fig. 2K, N) teilweise gehemmt. Im Gegensatz dazu kann ein anderer RA Antagonist BMS493 hemmen nur teilweise ndrg1a
Expression in der Bauchspeicheldrüse, der Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm [11]. Darüber hinaus ndrg1a
Ausdruck in pronephric proximalen Tubuli wurde auch durch BMS453 (Abb. 2 N) stark gehemmt. Es ist zu beachten, dass ndrg1a
Ausdruck in Auge, Gehirn und Gallenblase war weniger betroffen auf BMS453 Behandlung (Abb. 2 K, N). Es ist ein weit verbreitetes Phänomen, dass für Gene, die in der Bauchspeicheldrüse sowie in Auge und das zentrale Nervensystem zum Ausdruck, wie ndrg1a
, esr10
, NeuroD
und PTF1A /p48
, nur ihre Pankreas Ausdruck auf BMS453 Behandlung (Abb. 2 K, N und [10]) gehemmt wird. Umgekehrt Anwendung von RA auf Xenopus
Embryonen induziert signifikante Expansion von ndrg1a
Expressionsdomänen in archenteron Dach Endoderm (Fig. 2F), dorsal Endoderm (Fig. 2I), der Bauchspeicheldrüse, der Speiseröhre, des Magens und Duodenum (Abb. 2 L, O). Somit RA-Signalisierung ist notwendig und ausreichend zu aktivieren ndrg1a
Ausdruck in den archenteron Dach Entodermzellen.
Ausdruck, wir behandelt Xenopus
Embryonen mit Cycloheximid (CHX), ein Proteinsynthese-Inhibitor 15 Minuten vor der Anwendung von RA. Unsere Daten zeigen, dass RA induzierte Expansion von ndrg1a
Ausdruck in archenteron Dach endoderm wurde nicht von CHX (Abb. 2S) betroffen sind, für die These, dass RA direkt aktiviert ndrg1a
Ausdruck in archenteron Dach endoderm Zellen. Tatsächlich wurde in Xenopus tropicalis NDRG1
Promotorregion (AGTTCAacAGTTCA -1496bp zu -1509bp) ein RA-Response-Element identifiziert. Im Gegensatz zu Xenopus laevis
, die diploide Xenopus tropicalis
hat eine NDRG1
Gen.
ndrg1a
Sturz in Xenopus
Embry Phänokopien BMS453 Behandlung
morphants kauften wir zwei ndrg1a
Antisense-Oligos Morpholin (MO) von Gene-tools. Man deckt das ATG-Start-Codon (MO1) und die andere (MO2) sucht in der 5'-untranslatierten Region des ndrg1a
cDNA. Ihre Effizienz durch einen in vivo-Assay getestet wurde, bei der GFP-codierende Sequenz an eine Bindungsstelle des MO fusioniert wurde, und die resultierende mRNA mit der MO coinjiziert wurde in Xenopus
Eier befruchteten Embryonen in lebenden GFP Übersetzung zu bewerten . Sowohl MO1 (Abb. 3B) und MO2 (Abb. 3F) waren in der Lage, effizient die Translation von GFP offene Leserahmen hemmen nach dem entsprechenden MO1 oder MO2 Bindungssequenzen, die jeweils während die Steuerung MO (COMO) nicht zu tun (Abb. 3A, E).
/ p48
ist für Pankreas-Vorläuferzellen während der frühen Embryogenese spezifisch und wird später auf der exokrinen Pankreas beschränkt [10], [44], [45]. PDX1
speziell abgrenzt Entwicklung der Bauchspeicheldrüse, Magen und Zwölffingerdarm [46]. Insulin
, ein endokriner Marker-Gen, ist in der dorsalen Pankreas Knospe von Xenopus
Schwanzknospenstadium Embryonen [47], [48] ausschließlich ausgedrückt. PDIP
ist ein exokrinen Pankreas spezifischen Marker-Gen [49]. Sox2
markiert die Speiseröhre, Magen und einen vorderen Abschnitt des Duodenums [50]. Darmin
ist ein Darm spezifischer Marker-Gen [35], [51]. HHEX
dient als Leber und Schilddrüse Marker-Gen [52]. nkx2
. 1 | Marken entwickeln Lunge und Schilddrüse [53].
PTF1A
/ p48
, PDIP
, PDX1
und Sox2
Ausdruck in der Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm, hatte aber einen geringen Einfluss auf Darmin
, HHEX
und nkx2
. 1 | Ausdruck in Darm, Leber, Schilddrüse und der Lunge, das ist sehr ähnlich wie die Wirkung von BMS453 (Fig. 4A und [10]). Der einzige Unterschied besteht darin, dass keine ventrale Pankreas Ausdruck von PTF1A
/ p48
, PDIP
oder PDX1
in beobachtet ndrg1a
morphants, aber Spuren von PTF1A
/ p48
, PDIP
und PDX1
Ausdruck in den ventralen Pankreas Knospen wurden in BMS453 gehalten behandelt Embryonen (Abb. 4A und [10]). Die morphologische Phänotyp von ndrg1a
Knockdown ähnelt auch, dass der BMS453 Behandlung. Embryos mit MO1 oder MO2 injiziert erschien normal vor der Stufe 40 und in der Folge schwere Darmfehlbildungen mit einem Verlust von gut Wickel- und Ödembildung (Fig. 4B und [10]) angezeigt. Als MO1 und MO2 identische Phänotypen verursacht, haben wir MO1, um die Ruhestudien durchzuführen. Zusammen legen diese Daten nahe, dass RA und Ndrg1a in der gleichen genetischen Hierarchie sind bei der Kontrolle der Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm-Entwicklung.
mRNA in Xenopus
Embryonen verursacht weder morphologischen Anomalie noch Ausdruck Veränderungen der Markergene analysiert (Abb. S2A, B). Co-Injektion von ndrg1a
mRNA mit MOs konnte die MO Phänotyp retten entweder (Daten nicht gezeigt). Es scheint, dass wir in der funktionellen Ndrg1a Protein zu erhalten Xenopus
Embryonen durch die Routine mRNA Injektionsprotokoll, das für die meisten funktioniert, wenn nicht alle anderen Gene analysiert nicht in der Lage waren. Ein Ndrg1a-GFP-Konstrukt gezeigt, dass das Protein produziert wurde (Abb. S3) .Wir haben vor kurzem etablierte TALEN vermittelte Gen-Targeting in Xenopus
[54]. Um die MO-Phänotyp zu überprüfen, die wir entworfen NDRG1
Talens im dritten Exon von Xenopus tropicalis NDRG1
Gen (Abb. 5A), die effizient somatische Mutationen an der Ziel Loci (Abb verursacht. 5B). In Übereinstimmung mit dem MO-Phänotyp erhalten in Xenopus laevis
Embryonen, Insulin
und PDX1
Ausdruck in stark gehemmt war NDRG1
TALEN mRNA injiziert Xenopus tropicalis
Embryos (Fig. 5C), wenn auch mit einer niedrigeren Frequenz im Vergleich zu der MO injiziert diejenigen, die auch von PTF1A /p48
TALENS in unserer früheren Studie [54] auf die Anwendung geschehen. Eine stabile NDRG1
Knockout Frosch Linie wird noch festgelegt werden. Wir seziert 25 froglets, die Bauchspeicheldrüse, Magen und Zwölffingerdarm-Hypoplasie oder sogar aplasia aber mit normaler Leber und Gallenblase entwickelt (Abb. 5D) gezeigt. Somit bestätigt diese Daten die ndrg1a
MO Phänotyp erhalten in Xenopus laevis
.
RA Activated Ndrg1a Zügelt Wnt /β-Catenin-Signalweg in Darmes Dach Entodermzellen Pancreas zulassen , Speiseröhre, Magen und Duodenum Spezifikation
Embryonen unterdrücken, verglichen wir die Kern β-Catenin Ebenen in ndrg1a
positive archenteron Dach Entodermzellen der Stufe 20 Embryonen, die waren unterworfen RA, BMS453 Behandlung oder MO1 Injektion. Immunlokalisierung von Kern β-Catenin ist eine zuverlässige Methode Wnt /β-Catenin-Signalaktivität in Xenopus-Embryonen
[55] zu charakterisieren. In dem ausgewählten Bereich des Dach archenteron Endoderm zeigte wenige Zellen Kern β-Catenin-Färbung unter normalen Bedingungen, die ferner weniger auf RA-Behandlung wurde. Im Gegensatz dazu stieg die Zahl der nuklearen β-Catenin-positiven Zellen im archenteron Dach endoderm deutlich auf BMS453 Behandlung oder MO1 Injektion (Abb. 6A, B). Zusammen legen diese Daten nahe, dass RA und Ndrg1a unter Wnt /β-Catenin-Signalweg in Xenopus
archenteron Dach Entodermzellen.
MO1 mit GR-ΔNTcf3, eine dominant negative Form von TCF3 fusioniert mit dem Hormon-Bindungsdomäne des Glucocorticoid-Rezeptor dient Wnt /β-Catenin-Signalweg auf Dexamethason Induktion [56] zu unterdrücken. Unsere Daten zeigen, dass reprimierenden Wnt /β-Catenin-Signalisierung gerettet ndrg1a
Knockdown Phänotyp (Fig. 7A, B). Ectopic Aktivierung von nkx2
. 1 | (Abb. 7B44, 45), Sox2
(Abb. 7A19, 20 und B24, 25), und foxa1
(Fig. 7B14, 15), ein Faktor forkhead Transkriptionsmarkierung Magen, Duodenum und proctodaeum [44], ist mit dem Verlust von korrelierten Darmin
Ausdruck (Fig. 7A24, 25, 7B29, 30 upon) Injektion von 0,25 ng GR-ΔNTcf3 mRNA. Im Einklang mit der früheren Studie [22], eine höhere Dosis (0,8 ng) von GR-ΔNTcf3 mRNA erforderlich ektopische Expression von PDX1
und induzieren for1
, eine leberspezifische Marker-Gen [ ,,,0],22], [57], in Xenopus
Embryonen (Daten nicht gezeigt).
endoderm durch pflanzliche Injektion von 0,5 ng GR-LEFΔN-βCTA mRNA LEF1 DNA-Bindungsdomäne und die β-Catenin-Transaktivierungsdomäne [58] enthält, in vier Blastomeren der 4-Zellen-Stadium Embryonen führte zu identischen Phänotyp verursacht durch Ndrg1a Knockdown im Rahmen der Bauchspeicheldrüse, der Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm-Entwicklung (Fig. 7A, B). Der Unterdrückungseffekt von Wnt /β-Catenin-Signalisierung auf die Bildung von Leber (Fig. 7A27, 32, B32, 37) und der Lunge (Fig. 7A37, B42), war nicht in Ndrg1a morphants gesehen, was darauf hindeutet, dass die frühe Unterdrückung der Wnt /β-Catenin-Signalweg im Gebiet der Leber und Lunge bilden endoderm wird durch andere Faktoren aktiviert Ndrg1a als RA ausgeführt. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass Wnt /β-Catenin-Signalisierung Ndrg1a stromabwärts und wird unterdrückt, indem Ndrg1a die Spezifikation des Pankreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm zu ermöglichen.
ATF3, a Putative Wnt /β- Catenin-Zielgens in Xenopus
Embry, hemmt Insbesondere Xenopus
Pancreas, Speiseröhre, Magen, und
Aduodenum Spezifikation
Ausdruck [59] oder physikalisch mit PDX1 interagieren PDX1 vermittelte Trans in einem murinen β-Zelllinie [60] zu blockieren. Während Xenopus
Embryonalentwicklung, ATF3
kaum durch whole mount in situ Hybridisierung nachgewiesen wird (Abb. S4). RT-PCR-Analyse zeigte, dass ATF3
Expression hochreguliert wurde auf ndrg1a
Knockdown oder β-Catenin-Überexpression in Xenopus
Embryos (Fig. 8A). Wir fanden drei Kern Tcf /Lef-Bindungsstellen (5'-A /TA /T CAAAG-3 ') in Xenopus tropicalis ATF3
Promotorregion, die bei -1467 bp (TACAAAG) lokalisieren, -5591 bp ( AACAAAG) und -8889 bp (AACAAAG), respectively. Zusammen legen diese Daten nahe, dass ATF3
ist auch ein Wnt /β-Catenin Zielgen in Xenopus
Embryonen. Es fällt auf, eine Überexpression von ATF3 in Xenopus
endoderm führte Verlust abgeschlossen von Insulin
, PTF1A
/ p48
, PDIP
PDX1
, foxa1
und Sox2
Ausdruck in der Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm, hatte aber keine offensichtliche Wirkung auf Darmin
HHEX
und nkx2
. 1 | Ausdruck (Fig. 8B, C), die gerade identisch ist ndrg1a
Knockdown Phänotyp (Abb 4A.). Noch wichtiger ist, ATF3
MO, die allein geringe Effekte auf die Expression von Markergenen analysiert verursacht, konnte Insulin
, PTF1A
/ p48 zu retten
, PDIP
, foxa1
und Sox2
Ausdruck gehemmt durch ndrg1a
MO (Abb. 9A, B). Darüber hinaus war Pdx1 Lage ATF3 Überexpression oder Ndrg1a Knockdown Phänotyp in Bezug auf PTF1A
/ p48
, PDIP
, foxa1
und zu retten Sox2
Ausdruck mit Ausnahme von Insulin
(Abb. 9A, B). Es ist bekannt, daß Pdx1 weder notwendig noch ausreichend für die Aktivierung der frühen Insulin
Expression in Xenopus-Embryonen
[44]. Insgesamt deuten unsere Daten eine epistasis dass RA aktiviert Ndrg1a Wnt /β-Catenin-Signalisierung reprimiert und somit gibt die Unterdrückungs Aktivität von Wnt /β-Catenin-Aktivitäten signalisieren, die teilweise durch ATF3 am Pankreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm vermittelt werden kann Bildung.
Neurulae direkt aktiviert wird. Nuclear β-Catenin ist in den archenteron Dach Entodermzellen sehr gering, und es scheint, dass RA aktiviert Ndrg1a reprimiert Wnt /β-Catenin-Signalweg in diesen Zellen. Knockdown von ndrg1a
nachahmt Hemmung der RA-Signalisierung oder Aktivierung von Wnt /β-Catenin-Signalisierung in Xenopus
Embryonen in Bezug auf die Pankreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm-Entwicklung, was zu einem führt fast vollständigen Verlust der Beschreibung dieser Organanlagen. Blocking Wnt /β-Catenin-Signalweg kann retten ndrg1a
Knockdown Phänotyp. So koordiniert Ndrg1a RA und Wnt /β-Catenin-Signalweg in der Spezifikation von Xenopus
Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm.
ndrg1a
könnte ein spezifischer Marker sein Gene für die dorsale Pancreas, Speiseröhre, Magen und Duodenum Precursors in Xenopus
Neurulae
[61] oder Zebrabärbling [17], [18], [62] Embryonen. Mit Microarray in Kombination mit whole mount in situ Hybridisierung konnten wir Dach endoderm spezifisches Gen zu identifizieren archenteron ndrg1a.
Hat ein vitales Farbfleckung basiert Schicksal Mapping-Studie, dass archenteron Dach Entodermzellen gezeigt später Anlass geben Bauchspeicheldrüse nach dorsal , Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm [5]. shirin
erscheint in Xenopus
archenteron Dach endoderm ausgedrückt werden, aber mittlerweile ist es auch in Mesoderm und Ektoderm exprimiert [63]. fetuinish
speziell markiert das archenteron Dach endoderm in Xenopus
frühen Neurulae, aber später zeigt sie die Expression in Leber und Darm ohne Ausdruck in der Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm [35]. Nur ndrg1a
zeigt konsequente Ausdruck in den frühen archenteron Dach endoderm und später in der Bauchspeicheldrüse, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm. Wir spekulieren, dass ndrg1a
kann als eine spezifische dorsalen Bauchspeicheldrüse dienen, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm-Vorläufer-Markergen in Xenopus
, die durch genetische Abstammung Tracing Studien überprüft werden muss.
Pancreas, Speiseröhre, Magen und Duodenum Spezifikation
und CDX4
in Zebrabärbling Embryonen erscheint RA Signalisierung von Mesoderm entgegenzuwirken vorderen und hinteren Grenzen von Pankreas Gebiet zu setzen bzw. [17], [64]. ndrg1a
ist das erste Gen identifiziert, die direkt von RA früh in Xenopus
archenteron Dach Endoderm Zellen aktiviert wird, und es vermittelt Signalisierungs RA positiv Zellen Muster Endoderm in Pankreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm . Beide MO basierte Knockdown von ndrg1a
und TALEN gerufene Entkoppelung von ndrg1a
zeigen, dass die Ndrg1a Aktivität in Xenopus
endoderm Musterung ist unverzichtbar, die nicht in beobachtet NDRG1
Knockout-Mäusen [32], [33], [34]. Eine Erklärung für diese Diskrepanz ist, dass die wesentliche Rolle der Ndrg1a in Xenopus
endodermaler Musterung nicht in Säugern konserviert ist. Alternativ kann in der Maus berichtet keine endodermaler Organdefekte NDRG1
Gen Studien Targeting möglicherweise durch undichte Ausdruck NDRG1 in NDRG1
defizienten Mäusen [32], [33] oder aufgrund funktioneller Redundanz bei NDRG Familienmitglieder 1-4 in Mäusen.
Embryonen führt zu einer verringerten pronephros und desorganisiert Somiten [36]. Aus unbekannten Gründen konnten wir nicht ectopic Ndrg1a in Funktion erhalten in Xenopus
Embryonen. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass eine verkürzte Version von Ndrg1a mit den ersten 48 Aminosäuren in der N-terminalen fehlenden sowohl mRNA Injektion und MO-Design in der früheren Studie verwendet wurde [36]. Wir haben versucht, auch mRNA-Injektion mit dieser kurzen Version und die injizierten Embryonen waren gesund auch bei hoher Dosis (4 ng mRNA). Wir konnten nicht retten unsere ndrg1a
MO Phänotyp mit dieser verkürzten Version von Ndrg1a entweder. Schließlich ist die starke endodermaler Ausdruck ndrg1a
in unserer Studie dargestellt und von Costa et al. [35] wurde in dieser Studie nicht nachgewiesen [36].
Ndrg1a Mediated Übersprechen zwischen RA und Wnt /β-Catenin-Signalweg ist beschränkt auf Xenopus
Pancreas, Speiseröhre, Magen und Duodenum Forming die Zellen
[66]. Bei Mäusen, so scheint es, dass RA reprimiert Wnt-Antagonist Dkk1
Ausdruck in der prospektiven Lunge endoderm von E8.5-E9.5-Embryonen, so kanonische Wnt-vermittelte Lungen-Spezifikation ermöglicht [65]. RA und Wnt Wege von RA Zielgenen verknüpft sind OSR1
und OSR2
Brustflosse Entwicklung in Zebrabärbling zu halten [67]. Zusammen zeigen diese Fälle ein Umstand, RA Wnt /β-Catenin-Signalweg fördert.
Pankreas, Speiseröhre, Magen und Zwölffingerdarm Bildung, die nicht auf die Leber und Lunge Spezifikation gilt. Zur Unterstützung unserer Erkenntnis, die Überexpression eines sekretierten Wnt-Antagonist SFRP5 kann für RA bezüglich der Induktion der exokrinen Pankreas Differenzierung VEGT ersetzen injizierte Tier Kappen in Xenopus
[24]. Die schädlichen Auswirkungen der frühen ektopische Wnt /β-Catenin-Signalweg-Aktivierung auf die Leber und die Bildung Lunge Knospe in dieser Studie als auch in einer früheren Studie gesehen [22] ist nicht im Widerspruch zu der positiven Rolle der Wnt-Signalisierung bei der Förderung der Leber und Lunge Entwicklung, die beobachtet wurde, wenn Wnt /β-Catenin-Signalweg in aktiviert Xenopus
Embryonen aus den Stufen 30 bis 42 für die Leber und aus den Stufen 28 bis 35 für die Lunge bzw. [22], [66]. Die Repression Wirkung von RA auf Xenopus
blastula Wnt /β-Catenin-Signalweg [26] ist unwahrscheinlich, dass durch Ndrg1a, vermittelt seit ndrg1a