PLOS ONE: baja regulación de la AP-4 inhibe la proliferación, induce la detención del ciclo celular y promueve la apoptosis en células de cáncer gástrico humano

Extracto

Antecedentes

AP-4 pertenece a la hélice-bucle-hélice cremallera de leucina subgrupo de base; que controla la expresión del gen diana, regula el crecimiento, el desarrollo y la apoptosis de las células y se ha implicado en la tumorigénesis. Nuestros estudios previos indicaron que AP-4 era frecuentemente sobreexpresado en los cánceres gástricos y puede estar asociada con el mal pronóstico. El propósito de este estudio es examinar si el silenciamiento de la AP-4 puede alterar las características biológicas de las células de cáncer gástrico.

Métodos

Dos siRNAs específicos dirigidos AP-4 fueron diseñados, sintetizados, y se transfectaron en líneas celulares de cáncer gástrico y células de la mucosa normales humanos. AP-4 expresión se midió con PCR en tiempo real cuantitativa y Western blot. La proliferación celular y quimio-sensibilidad fueron detectados por CCK-8 ensayo. ensayo de ciclo celular y ensayo de apoptosis se realizaron por citómetro de flujo, y la expresión relativa de reguladores del ciclo celular se detectaron por cuantitativa en tiempo real PCR y Western blot, la expresión de los factores que intervienen en la vía de apoptosis fueron examinados en ARNm y proteínas.

resultados

la expresión de la AP-4 fue silenciado por la transfección siRNAs y los efectos de la AP-4 caída duró de 24 a 96 hrs. El siRNA mediada por silenciamiento de la AP-4 suprime la proliferación celular, la apoptosis inducida por las células cancerosas y sensibilizados a los medicamentos contra el cáncer. Además, el nivel de expresión de p21, p53 y la caspasa-9 se incrementa cuando se desmontables AP-4, pero la expresión de la ciclina D1, Bcl-2 y Bcl-x _{L se inhibió. Esta sustancia no indujo la detención del ciclo celular cuando AP-4 fue caída en defecto de p53 gástrico línea celular de cáncer de Kato-III.}

Conclusiones

Estos resultados ilustran que el silenciamiento de genes de la AP-4 pueden de manera eficiente inhibe la proliferación celular, activan la apoptosis y las células de cáncer sensibilizados a medicamentos contra el cáncer in vitro, lo que sugiere que el silenciamiento AP-4 siRNAs mediada tiene un valor potencial en el tratamiento de cáncer gástrico humano

Visto:. Liu X, Zhang B, Guo Y, Liang Q, Wu C, Wu L, et al. (2012) baja regulación de la AP-4 inhibe la proliferación, induce la detención del ciclo celular y promueve la apoptosis en células de cáncer gástrico humano. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10.1371 /journal.pone.0037096

Editor: Vladislav V. Glinskii, Universidad de Missouri-Columbia, Estados Unidos de América

Recibido: 4 de Junio, 2011; Aceptado: 18 de abril de 2012; Publicado: 16 de mayo de 2012

Derechos de Autor © 2012 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

a pesar de que las tasas de incidencia y mortalidad asociadas con el cáncer gástrico han disminuido gradualmente en los últimos años en la mayoría de las zonas del mundo [1], [2], el cáncer gástrico sigue siendo una carga para la salud en todo el mundo, y sigue siendo la causa más frecuente de las muertes relacionadas con el cáncer con poca mejoría de la supervivencia a largo plazo. El tratamiento más eficaz del cáncer gástrico fue retirada completamente quirúrgica del tejido neoplásico con linfadenectomía D2. Además la quimioterapia adyuvante y la radioterapia han ayudado a mejorar el pronóstico. Aun así, la supervivencia a 5 años se mantuvo muy pobres [1], [3]. Más de un millón de nuevos casos se diagnostican cada año, especialmente en el Este de Asia, como Japón, Corea y China. En estos países, el cáncer gástrico sigue siendo la causa más común de muertes relacionadas con el cáncer, y la patogenia exacta sigue siendo desconocida [3].

Los factores de transcripción son componentes importantes de regulación [4]. Pertenecían a la familia de hélice-bucle-hélice y jugaron un papel importante en la proliferación y diferenciación celular, la determinación del linaje celular, la expresión de la información genética intracelular, y otros procesos esenciales [5]. Como miembro del subgrupo básica hélice-bucle-hélice cremallera de leucina (bHLH-LZ) de las proteínas bHLH [6], la activación de proteína de unión a potenciador de 4 (AP-4) se identificó inicialmente como una proteína celular que se une al virus de simio 40 (SV40) potenciador y activa la transcripción de genes viral tardía [7]. AP-4 es un factor de transcripción expresado de forma ubicua y puede controlar las redes de transcripción durante la diferenciación celular mediante la formación de homodímeros y la unión a la secuencia de ADN simétrica, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 es un ligando para promotor de inmunoglobulina-kappa elementos E-box, que puede estar implicado en enfermedades de inmunodeficiencia [13], [14]. Además, a diferencia de otras proteínas HLH, AP-4 contiene dos motivos de dimerización de proteínas adicionales que consisten en elementos de leucina de repetición LR1 y LR2. Por lo tanto, AP-4 presenta una estructura tripartita dimerización específica, lo que sugiere que AP-4 puede interactuar con una amplia variedad de factores de transcripción [8], [14]. AP-4 regula la expresión de algunos genes [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Por ejemplo, se activa la transcripción de gen hMTIIA y participa en la regulación de la expresión proencefalina humano [22], y puede desempeñar un papel en la expresión de la familia de genes pancreática exocrina [23]. Recientemente, se informó que la sobreexpresión de la AP-4 en el cáncer colorrectal, cáncer de mama y el cáncer de próstata [9], [18], [24].

ARN de interferencia (ARNi) es un proceso de secuencia puesto específico -transcriptional silenciamiento de genes iniciada por ARN de doble cadena [25], que puede conducir a la silenciación del gen celular específica y proporcionar un poderoso enfoque de genética inversa para analizar las funciones de genes tanto in vitro como in vivo [26]. Actualmente las moléculas de silenciamiento de genes específicos de secuencia basados ​​en ácidos nucleicos más utilizados eran pequeños RNAs de interferencia [27], siRNAs con nombre, que consiste en dúplex simétricas de 19-21 pares de bases [28]. El método siRNA podría inhibir la expresión del gen diana con la especificidad, la eficiencia y la resistencia [29].

Hemos informado anteriormente de que la AP-4 se sobreexpresa en el cáncer gástrico y que pueden estar asociados con el mal pronóstico [30]. En el presente estudio, hemos examinado aún más la función AP-4 en células de cáncer gástrico humano con la interferencia de ARN.

Resultados

siRNA concreta para la expresión de la FA-4 en células de cáncer gástrico humano y humana células de la mucosa normales

para evaluar el efecto del silencio siRNA mediada por la expresión de los genes AP-4, el control de siRNA y AP-4 siRNAs específicos se transfectaron en las células durante 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. La eficacia en la expresión de regulación hacia abajo de AP-4 gen se detectó por PCR en tiempo real cuantitativa y Western blot. Como se muestra en la Figura 1, AP-4 siRNAs específicos podrían inhibir eficazmente la transcripción de genes y la traducción. Los niveles de mRNA y proteína de AP-4 se redujeron con AP-4 grupo transfección siRNA pero no en el control de siRNA (Figura 1). La supresión inducida por siRNAs de AP-4 expresión puede ser detectada en 24 horas después de la transfección. Sin embargo, la relación de inhibición se redujo 72 horas después de la transfección. El punto de tiempo más eficiente tenían entre 48 h a 72 h en la expresión de supresión de la AP-4. Los niveles relativos de transcritos de ARNm se redujo significativamente en casi un 90% en siRNA-1 grupo, y 95% en siRNA-2 grupo. No hubo diferencias estadísticamente significativas entre el grupo siRNAs y el grupo control.

El descenso de regulación de la AP-4 expresión inhibió la proliferación celular y sensibilizado células de cáncer gástrico humano para medicamentos contra el cáncer

Para examinar el efecto de AP-4 siRNAs específicos sobre la proliferación celular y quimio-sensibilidad de las células cancerosas, 20 nM de se transfectaron AP-4 siRNAs específicos o siRNA de control y la proliferación celular se determinó por CCK-8 ensayo de 48 horas después de la transfección. Encontramos que desmontables AP-4 podría inhibir la proliferación de líneas celulares de cáncer gástrico SGC7901 y AGS (Figura 2), pero no en la línea normal de las células mucosa GES-1 en comparación con la transfección ARNsi de control en 48 horas (Figura 2). Estos resultados indicaron que AP-4 siRNAs atenúan la proliferación celular de células de cáncer gástrico in vitro. Además, se investigó el papel de la AP-4 en la regulación de la quimio-sensibilidad de las células de cáncer gástrico humano. Se comparó la sensibilidad a los fármacos de AP-4 siRNAs con la de siRNA de control o células simuladas y encontramos que las tasas de inhibición relativas de AP-4 siRNAs específicos fueron significativamente mayores que la de control de siRNA o células simuladas (p < 0,0001) (Figura 2 ). Además, AP-4 siRNAs mejora de forma significativa la sensibilidad de las células a ADR, 5-FU o tratamiento cis-Plantinum en dos dosis diferente (Figura 2), estos sugerido que la baja regulación de AP-4 puede tener un efecto beneficioso en el sensibilidad de la quimioterapia.

el silenciamiento de la expresión inducida por la detención del ciclo celular AP-4 y modulada la expresión de p53, p21 y ciclina D1

el efecto de AP-4 en la progresión del ciclo celular se investigó . las células de cáncer gástrico humano fueron transfectadas con 20 nM de ARNsi de control, y los AP-4 siRNAs específicos para 48 h, respectivamente, seguidos por tinción con yoduro de propidio y citometría de flujo análisis de ciclo celular. Mientras que las células transfectadas con siRNA de control progresado a través de las diferentes fases del ciclo celular, las células transfectadas con la AP-4 siRNAs específicos que se muestra significativamente mayor frecuencia de células en las fases G0 /G1 (SGC7901 /siRNA-1: 68,81%; SGC7901 /siRNA-2: 68,97%; AGS /siRNA-1: 61,92%; AGS /siRNA-2: 63,67%) y una menor frecuencia de células en fase S (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%; SGC7901 /siRNA-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22,91%). El porcentaje de células en las fases G0 /G1 en la célula transfectada con AP-4 siRNAs fue significativamente mayor que la de las células falsos (SGC7901: 54,65%; AGS: 48.44%) (p < 0,05) o control siRNA (SGC7901 /control de siRNA: 52,18%; AGS /control de siRNA: 50.38%) (Figura 3). Por lo tanto, la transfección con siRNAs AP-4-específica inducida detención ciclina celular en las fases G0 /G1
.

El bloqueo del ciclo celular AP-4 siRNAs específicos inducidos se investigó adicionalmente mediante la observación de los efectos del tratamiento AP-4 siRNAs específicos en la expresión relativa de los reguladores del ciclo celular: la p53 supresor de tumores, la ciclina dependiente p21 inhibidor de la quinasa, y el G (1) de ciclina D1-fase específica, que eran reguladores críticos del ciclo celular y la proliferación. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron las células de cáncer gástrico humano para PCR en tiempo real y análisis de inmunotransferencia. La transfección con la AP-4 siRNAs específicos podría hasta de regular la expresión de p53 y la proteína p21. El efecto modulador de AP-4 siRNAs fue mayor que la de ARNsi de control (Figura 4) (p < 0,01). Como era de esperar, la ciclina D1 se había reducido regulado en comparación con el grupo control y el grupo de simulacro de siRNA (Figura 4) (p < 0,01). Estos datos apoyaron la hipótesis de que el silenciamiento de la expresión de AP-4 alterada la expresión de otros reguladores del ciclo celular, inducida por la detención del ciclo celular y inhibieron la proliferación de células de cáncer gástrico humano

Detección de la apoptosis y los factores implicados en la apoptosis vía

Para cuantificar el efecto de la AP-4 siRNAs específicos sobre la apoptosis en células de cáncer gástrico humano, se utilizaron ensayos de anexina-V y tinción PI en relación con la citometría de flujo. Las células fueron teñidas con anexina V-FITC /PI y cerrada en cuadrantes superior derecho (UR) Inferior derecha (LR) y. Las células en LR y UR fueron considerados como principios apoptóticos (anexina ^{+ /PI -) y apoptosis tardía (Anexina + /PI +), respectivamente. Las células en LL (inferior izquierdo) y UL (superior izquierda) cuadrantes fueron considerados de estar vivo y necrótico, respectivamente. Grado de apoptosis se expresa como la suma total de los porcentajes en LR y UR cuadrantes. Las tasas de apoptosis se mostraron en la Figura 5. Las células tratadas con siRNAs AP-4 mostraron más células apoptóticas (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) que el siRNA negativo (SGC7901 /control: 5,5%; AGS /control de siRNA: 6,7%) (p < 0,05) y blanco (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p < 0,05) . Estos resultados mostraron que AP-4 siRNAs específicos fueron capaces de inducir apoptosis en estas células.}

Además, hemos examinado la expresión de factores que intervienen en la vía de apoptosis con PCR en tiempo real en el nivel de mRNA, tales como Bcl-2 , Bcl-x _{L, caspasa-9, caspasa-8 y Bax. Se demostró que desmontables AP-4-hasta podría regular la expresión de Baspase-9 en células de cáncer gástrico humano, y el efecto modulador de AP-4 siRNAs fue mayor que la de ARNsi de control (Figura 6) (p < 0,01). La expresión de Bcl-2 y Bcl-x L se redujo en comparación con el ARNsi de control o el grupo simulado (Figura 6) (p < 0,01). Estos datos apoyaron además que el silenciamiento de la expresión de AP-4 condujo a la apoptosis en células de cáncer gástrico humano. Sin embargo, la expresión de la caspasa-8 y Bax fueron diferentes en diferentes líneas celulares después de la transfección. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, caspasa-8 y Bax fueron más de expresión en células AGS. En SGC7901 células, la expresión de Bax aumentó, pero la expresión de caspasa-8 aumentó sólo en siRNA-1 grupo. En siRNA-2 grupo, caspasa-8 expresión no fue significativa afectada (Figura 6).}

AP-4 silenciamiento podría regular el ciclo celular y la apoptosis celular en tanto dependiente de p53 y modales independientes

para verificar si la sobre regulación de p53 en 4 AP-células cancerosas desmontables gástricos era crítica para la función de la detención del ciclo celular, las células Kato-III, un tipo de defecto p53 línea celular de cáncer gástrico se utilizó para evaluar la dependencia de AP efecto de caída de -4 a p53. Se encontró que desmontables de AP-4 en AGS con p53 de tipo salvaje o SGC7901 con p53 mutante podría inducir la detención del ciclo celular, pero este fenómeno no se observó en células Kato-III (Figura 7), el porcentaje de células en G0 /G1 fases fueron 57.82% (siRNA-1), 59,05% (siRNA-2), el 59,59% (control de siRNA) y 59,06% (simulacro). Los que se indican que desmontables AP-4 puede que regulan el ciclo celular por medio de la vía de p53-p21. población apoptosis también se detectó en las células Kato-III con Anexina V-FITC y PI tinción. Los resultados mostraron que la tasa de apoptosis de las células Kato-III transfectadas con AP-4 siRNAs (siRNA-1: 7,9%; siRNA-2: 9,2%) fue mayor que el control de siRNA (3,3%) (p < 0,05) y mock las células (3,5%) (p < 0,05), pero en menor medida que lo hizo en los AGS (p < 0,05) y SGC7901 células (p < 0,05), lo que indica que el silenciamiento AP-4 puede inducir la apoptosis en células de cáncer gástrico a través tanto dependiente de p53 y modales independientes.

Discusión

la expresión génica es un proceso fundamental y altamente conservada. La transcripción, el primer paso en la expresión génica, se lleva a cabo por el ADN estructuralmente conservadas ARN polimerasas dependientes, lo que resulta en la síntesis de una molécula de ARN a partir de una plantilla de ADN [31]. Los factores de transcripción, complejo de iniciación de la transcripción con ARN forma polymeras II, participan en el proceso de iniciación de la transcripción para regular la expresión génica. Ellos pueden desempeñar un papel importante en la transformación, la tumorigénesis, la progresión tumoral y la metástasis mediante la regulación de la transcripción y por lo tanto la expresión de genes [32], [33], [34]. Factor de transcripción AP-4, perteneciente al grupo de rápido crecimiento de las proteínas HLH [8] está implicado en la diferenciación y la proliferación celular [35], [36], [37], [38], [39], afecta a los eventos del ciclo celular y apoptosis, regula y controla algunas expresión de genes [9], [10], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Recientemente, se ha informado de que AP-4 fue hasta reguladas en el carcinoma de colon, cáncer de mama y cáncer de próstata [9], [18], [24]. Además, AP-4 expresión positiva indica un mal pronóstico con significación sobre el grado, los ganglios o el tamaño en el cáncer de mama ER +, y una posible asociación con quimio-sensibilidad [40]. En nuestro estudio con anterioridad, hemos encontrado que la expresión de la AP-4 se sobreexpresa y co-relacionado con un mal pronóstico [30]. Puede ser un marcador molecular para el diagnóstico y pronóstico del cáncer gástrico. En el presente estudio,. Hemos diseñado dos AP-4 siRNAs específicos para inhibir la expresión del gen de la AP-4 en células de cáncer gástrico humano. Ellos estaban bien establecidos y se transfectaron en las células para dar lugar a knock-down de AP-4 la expresión génica. Se encontró que el punto de tiempo más potente en la supresión de la expresión AP-4 en células de cáncer gástrico fueron de 48 h y 72 h después de la transfección. Por lo tanto, elegimos la primera para llevar a cabo el examen adicional relacionada.

Anteriormente, se ha demostrado que el factor de transcripción AP-4, a diferencia de otras proteínas HLH, contenía dos elementos leucina de repetición distintas que también dimerización directa y permitir que el la formación de complejos selectiva de la proteína ubicua AP-4 [8] [41].

AP-4 podría desempeñar un papel importante en la modulación de las funciones celulares a través de la regulación de genes implicados en la producción viral [7], [16, ], [22], [42], [43], el crecimiento celular y la supervivencia [9], [17], [23], [44], la respuesta inmune [14], [41], [45], y la angiogénesis [21]. Peter Jung, et al encontraron que el AP-4 podría codificar un c-MYC-inducible represor para inhibir la expresión de p21 [9], y presumiblemente jugado un papel importante en la mediación de la actividad proliferativa de c-MYC [10]. Además, AP-4 influyó en la sensibilidad a la apoptosis mediante la regulación de la expresión de la caspasa-9 [17]. En este estudio, hemos encontrado que la baja regulación de la AP-4 inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico humano in vitro. La relación de inhibición de la proliferación de AP-4 siRNAs específicos fue significativamente menor que la de las células transfectadas con ARNsi de control o el grupo simulado.

La quimioterapia es una importante estrategia en el tratamiento del cáncer gástrico, pero a menudo falla debido la resistencia a los fármacos contra el cáncer. Se informó de que AP-4 expresión positiva fue posiblemente conectado con quimio-sensibilidad [40]. A continuación se investigó el papel de la AP-4 en la regulación de la quimio-sensibilidad de las células de cáncer gástrico humano y encontramos que la inhibición de AP-4 podría mejorar significativamente la sensibilidad de estas células a ADR, 5-FU o tratamiento cis-Plantinum, lo que sugiere que la inhibición de AP-4 puede tener un efecto beneficioso en la quimio-sensibilidad
.

Además, el silenciamiento de AP-4, inducida por la detención del ciclo celular en las fases G0 /G1, el análisis de un potencial de mecanismos subyacentes a los efectos de el silenciamiento AP-4 en la inhibición de la proliferación de células de cáncer gástrico humano se caracteriza por la expresión de los reguladores del ciclo celular relacionadas. Se encontró que la baja regulación de la expresión AP-4 inhibe la expresión de ciclina D1, pero hasta reguladas la expresión de p53 y p21. p53 y p21 se ha planteado la hipótesis de que es un regulador negativo del ciclo celular y la proliferación [46], [47], por otro lado, la ciclina D1 promueve la progresión a través de la G _{fase 1-S del ciclo celular [48 ]. la expresión regulada hacia abajo de la AP-4, p21 y p53, mientras tanto, podría hacer que la detención del ciclo celular causada desmontables de AP-4 desaparición. Estos resultados están de acuerdo con un modelo en el que la AP-4 induce la detención del ciclo celular mediante la regulación de la expresión de los reguladores del ciclo celular, tales como p53, p21 y ciclina D1.}

La apoptosis, o muerte celular programada, es conocida para participar en diversos procesos biológicos por los dos principales vías de apoptosis, la (intrínseca) vía mitocondrial y la muerte del receptor (extrínseca) vía [49]. Se encontró que silenciar la expresión AP-4 trigged apoptosis de las células en nuestro experimento, lo que demuestra que el AP-4 apoptosis en células de cáncer gástrico humano suprimida.

En nuestro experimento, el aumento de los niveles de caspasa-9 y la baja regulación de Bcl-2 y Bcl-x _{L se detectó en células de cáncer gástrico humano, lo que indica que desmontables de AP-4 vías tanto intrínsecos y extrínsecos activados a la apoptosis en células de cáncer. [49], [50]}

En resumen, los datos demuestran que el ARNi mediada baja regulación del factor de transcripción AP-4 inhibe eficazmente la proliferación celular, indicó la detención del ciclo celular, desencadena la apoptosis y aumentará la quimio-sensibilidad de células de cáncer gástrico humano con la disminución de expresión de ciclina D1, Bcl-2 y Bcl-x _{L y p21 activada, p53 y la expresión de la caspasa-9, lo que sugiere AP-4 puede ser un oncogén que juega un papel importante en la tumorigénesis . Aunque el mecanismo exacto de esta función necesita de mayor investigación, la AP-4specific-siRNAs puede ser de valores de potencial como agentes terapéuticos para el cáncer gástrico humano.}

Materiales y Métodos

Línea celular y el cultivo celular

líneas celulares de cáncer gástrico humano AGS con p53 de tipo salvaje, SGC7901 con p53 mutante (obtenido de la Universidad de Wuhan) y Kato-III con genoma p53 deleción (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) se cultivaron en medio o RPMI1640 medio DMEM (Invitrogen) que contiene con 10% de suero bovino fetal (Invitrogen), penicilina (100 u /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2.

siRNA específico y transfección

La secuencia de ADNc del gen de la AP-4 se obtuvo de GenBank ( NM_003223) y las secuencias de direccionamiento de dos 21-nucleótidos diferentes siRNAs fueron diseñados y sintetizados químicamente (Qiagen Alemania). Las secuencias de nucleótidos fueron los siguientes: siRNA-1, 5'-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(sentido), y 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (antisentido). siRNA-2, 5'-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(sentido), y 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (antisentido). Allstars control de siRNA negativo (Qiagen Alemania) fueron utilizados como control siRNA revueltos. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos y los siRNAs se transfectaron en células de cultivo con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.

se realizó PCR cuantitativa

extracción de RNA total en tiempo real usando RNAiso Plus (Takara, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los ADNc a partir de ARN total fueron sintetizados utilizando PrimeScript® RT kit de reactivos (Takara, Japón). La expresión del ARNm se evaluó mediante PCR en tiempo real en un ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapur) con SYBR Green PCR rápida reactivos. GAPDH se aplicó como el control interno. Las concentraciones de los reactivos se ajustaron para alcanzar un volumen final de 20 l, que contiene 2 l de producto a transcripción inversa, 10 l de Fast SYBR® verde Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), y 0,5 l de 10 mM adelante y atrás primers. La reacción se llevó a cabo por 45 ciclos de amplificación de 95 ° C durante 3 s y 60 ° C durante 30 s. Los siguientes cebadores fueron diseñados (Tabla No.1). PCR primers fueron diseñados por el Primer 5.0 y explosiva de búsqueda para comprobar la especificidad. Las secuencias de cebadores utilizados se enumeran en las Tablas 1. Los resultados se calcularon mediante el uso de 2 método ^-ΔΔCt.

Western blot

Proteína se extrajo con kit de extracción de proteínas (Beyotime, China) según a la dirección. La proteína se diluyó a 3 g /l y se separó por 10% SDS-PAGE, se transfirió a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, USA), y luego se bloqueó en leche en polvo 5% sin grasa en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente. La inmunotransferencia se realizó usando anticuerpos anti-AP-4 de anticuerpos (Sigma-Aldrich, Shanghai, dilución 1:1000), anticuerpo anti-p21 (Sigma-Aldrich, Shanghai, dilución 1:1000), anticuerpo anti-p53 (Abcam, UK, la dilución 1:500) y anti-ciclina D1 anticuerpos (Abcam, UK, la dilución 1:500) durante la noche a 4 ° C. Después de tres veces enjuagaron con TBST, la membrana se incubó con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpos secundarios (dilución 1:2000, Boster, China) durante 1 hora a temperatura ambiente. El resultado se visualizó por el sistema de detección de transferencia Western ECL Plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Anti-β-actina (dilución 1:1000, Boster, China) anticuerpo actuó como control interno.

Medición de la proliferación celular

El impacto de silenciar AP-4 en la proliferación de células de cáncer gástrico después de 48 horas de la transfección se midió contando Cell Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, china), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células de cáncer gástrico se cultivaron en placas de 96 pocillos y se transfectaron con 20 nM de ARNsi de control, AP-4 siRNAs específicos. Después de 48 horas, se añadieron 10 l de CCK-8 de reactivo a cada pocillo, después de 1 hora de incubación a 37 ° C, se midió la absorbancia a 450 nm. Los niveles relativos de la proliferación celular en cada grupo de células se calculó según la siguiente fórmula: R = (A2-A1) /A2 × 100% y P = A1 /A2 × 100% en la que R fue la tasa relativamente inhibitorio y P era relativamente relación de proliferación del crecimiento celular; A1was valor medio de absorbancia de las células transfectadas; y A2 era el valor medio de absorbancia de las células de control no transfectadas y sin ningún tipo de tratamiento de drogas. Todos los experimentos se realizaron con 5 pocillos por experimento y se repitieron al menos tres veces.

ciclo celular Ensayo

Las células se recogieron 48 horas después de la transfección y se fijaron en etanol al 70% enfriado en hielo durante la noche, se lavaron con 1 x PBS, y se tiñeron con yoduro de propidio (PI) (50 mg /ml) en 1 x PBS suplementado con RNasa (50 mg /ml) durante 30 minutos. Los ensayos se realizaron por triplicado para cada muestra y los análisis se realizaron por el citómetro de flujo (FACS CantoII, BD Bioscience, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Chemo prueba de sensibilidad in vitro

como se ha descrito anteriormente, se utilizó CCK-8 de ensayo para evaluar el efecto de la quimio-sensibilidad de las células de cáncer gástrico a medicamentos contra el cáncer. En breve, seis horas después de la transfección, se retiró el medio y se reemplazó con medio fresco que contiene concentraciones variables de fármaco anti-tumor (ADR, 5-FU o cis-platino) y se incubaron durante 48 horas. tasa relativamente inhibidora del crecimiento celular se calculó de acuerdo a la fórmula indicada arriba.

ensayo de apoptosis por anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) tinción

Para evaluar la tasa de apoptosis celular, la apoptosis se cuantificó por yoduro de doble tinción de anexina-V-FITC y de propidio usando un kit de FITC anexina-V /(Antgene, china). Las células se recogieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante 48 horas después de la transfección, se lavaron con PBS frío, y se suspendieron en tampón de unión, y luego las células se incubaron 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C con Anexina V-FITC y PI en tampón de fosfato y se analizaron en el citómetro de flujo (FACS CantoII, BD Bioscience, EE.UU.) en 1 h después de la tinción.

Análisis estadístico

Todos los datos se muestran como media ± desviación estándar. Diferencia entre los grupos fue analizada por ANOVA de una vía y Student-Newman-Keuls (SNK) -q prueba usando un programa SPSS 12.0 para Windows. La significación estadística se definió como * p < 0,05 y ** p <. 0,01

Reconocimientos

Agradecemos Wu Ke, Shi Liang, Deng Meizhou, Li Cuelgue y Li Wei por su asistencia técnica de expertos .

• PLOS ONE: resultados a largo plazo y los factores pronósticos de pacientes con cáncer gástrico con microscópica peritoneal Carcinomatosis
• PLOS ONE: evaluación del riesgo de cáncer gástrica causada por Helicobacter pylori CagA Usando Secuencia Markers