Ploche ONE: down-regulácia AP-4 inhibuje proliferáciu, indukuje zastavenie bunkového cyklu a podporuje apoptózu rakovina žalúdka u ľudí Cells

abstraktné

Pozadie

AP-4 patrí k základnému skrutkovice -loop-helix leucín-zipper podskupinu; riadia génovú expresiu cieľového, reguluje rast, vývoj a bunkovú apoptózu a bol zapletený do vzniku nádorov. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že AP-4 bolo často nadmerne exprimovaný u karcinómov žalúdka a môže byť spojená so zlou prognózou. Účelom tejto štúdie je zistiť, či umlčanie AP-4 môže zmeniť biologické vlastnosti buniek karcinómu žalúdka.

Methods

dva špecifické siRNA cielenie AP-4 boli navrhnuté, syntetizované a transfekovaly do žalúdka rakovinových bunkových línií a ľudské normálne sliznice buniek. AP-4 Expresia bola meraná v reálnom čase kvantitatívne PCR a Western blot. proliferácie buniek a chemo-citlivosť boli detekované pomocou CCK-8 testu. Test bunkového cyklu a apoptóza test boli vykonané prietokovým cytometrom, a relatívna expresia regulátorov bunkového cyklu boli detekované v reálnom čase kvantitatívnym PCR, a Western blot, expresia z faktorov, podieľajúcich sa na apoptózy dráhy boli posúdené v mRNA a proteínovej úrovni.

Výsledky

expresie AP-4 bol umlčaný siRNA transfekcia a účinky AP-4 knockdown trvala 24 až 96 hodín. Sírne sprostredkované umlčanie AP-4 potláča bunkovú proliferáciu, indukovanú apoptózu a senzibilizované rakovinové bunky protinádorových liečiv. Okrem toho, úroveň expresie p21, p53 a kaspázy-9, sa zvyšuje, keď AP-4 bol porazený, ale expresia cyklin D1, Bcl-2 a Bcl-x _{L bola inhibovaná. To nevyvolal zástavu bunkového cyklu, kedy AP-4 bol porazený v p53 vada rakovina žalúdka bunkové línie Kato-III.}

Závery

Tieto výsledky ukázali, že umlčanie génu AP-4 je možné účinne inhibovala proliferáciu buniek, spúšťa apoptózu a senzitizovaných rakovinové bunky k protinádorovej látky in vitro, čo naznačuje, že AP-4 sprostredkovaná siRNA tlmenie hluku má potenciálnu hodnotu v liečbe ľudskej rakoviny žalúdka

Citácia :. Liu X, Zhang B, Guo Y, Q Liang, Wu C, Wu L, et al. (2012) down-regulácia AP-4 inhibuje proliferáciu, indukuje zastavenie bunkového cyklu a podporuje apoptózu u karcinómu žalúdka ľudských bunkách. PLoS ONE 7 (5): e37096. doi: 10,1371 /journal.pone.0037096

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Spojené štáty |

prijatá: 04.06.2011; Prijaté: 18.apríla 2012; Uverejnené: 16. mája 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Hoci incidencia a úmrtnosť spojená s rakovinou žalúdka síce v posledných rokoch postupne klesala vo väčšine oblastí na svete [1], [2], rakovina žalúdka zostáva aj naďalej celosvetovo zdravotné záťaž, a zostáva najčastejšou príčinou úmrtia na rakovinu súvisiace s malým zlepšenie dlhodobej prežitie. Najúčinnejšia liečba rakoviny žalúdka bol úplne chirurgické odstránenie nádorového tkaniva s D2 lymfadenektómia. Okrem adjuvantnej chemoterapie a rádioterapie pomohli zlepšiť prognózu. Dokonca tak, prežitie po dobu 5 rokov zostala veľmi nízka [1], [3]. Viac ako jeden milión nových prípadov bolo diagnostikovaných ročne, a to najmä vo východnej Ázii, rovnako ako Japonsko, Kórea a Čína. V týchto krajinách, rakovina žalúdka zostáva najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu súvisiace, a presná patogenéza zostáva neznáma [3].

transkripčných faktorov sú dôležité regulačné prvky [4]. Patrili k rodine helix-loop-helix a hral dôležitú úlohu v bunkovej proliferácii a diferenciácii, stanovenie bunkové línie, expresie intracelulárnej genetickej informácie, a ďalšie základné procesy [5]. Ako člen základnej helix-loop-helix leucín-zipper (bHLH-LZ) podskupiny bHLH proteínu [6], aktivačný zosilňovač viažuci proteín 4 (AP-4) bol pôvodne identifikovaný ako bunkový proteín, ktorý viaže na opičieho vírusu 40 (SV40), enhancer a aktivoval vírusové neskoré génovej transkripcie [7]. AP-4 je všadeprítomné exprimovaný transkripčný faktor a môže riadiť transkripčný siete počas diferenciácie buniek tým, že tvoria homodimery a nadviazaním na symetrické sekvenciu DNA, CAGCTG [7], [8], [9], [10], [11], [ ,,,0],12]. AP-4 je ligand pre imunoglobulínu kappa promotorové E-box prvkov, ktoré môžu byť zapojené do imunodeficiencie ochorenia [13], [14]. Okrem toho, na rozdiel od ostatných proteínov HLH, AP-4 obsahuje dva ďalšie proteín dimerizáciu motívy, ktoré pozostávajú z leucín opakovaných prvkov LR1 a LR2. Z tohto dôvodu, AP-4 predstavuje špecifickú tripartitné dimerizační štruktúru, čo naznačuje, že AP-4 môžu interagovať s celým radom transkripčných faktorov [8], [14]. AP-4 reguluje expresiu niektorých génov [9], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Napríklad, aktivuje transkripciu génu hMTIIA a podieľa sa na regulácii expresie ľudského proenkephalin [22], a to môže hrať úlohu v expresii rodiny pankreatickej exokrinné génov [23]. V poslednej dobe sa zvýšená expresia AP-4 bol zaznamenaný v rakovine kolorektálneho karcinómu, rakoviny prsníka a prostaty [9], [18], [24].

RNA interferencia (RNAi) je proces sekvencia určité pracovné miesto -transcriptional umlčanie génu iniciované dvouřetězcovou RNA [25], čo môže viesť k umlčanie špecifických bunkového génu a poskytujú silný reverznej genetiky prístup k analýze génovej funkcie, a to ako in vitro, tak in vivo [26]. V súčasnej dobe najrozšírenejšie umlčanie génu molekuly nukleovej kyseliny na báze sekvenčne špecifické príliš malé interferujúce RNA [27], pomenované siRNA, ktoré sa skladá zo symetrických duplex z 19-21 párov báz [28]. Spôsob siRNA môže inhibovať génovú expresiu cieľového sa špecificitou, výkonnosti a odolnosti [29].

hlásené Už skôr sme, že AP-4 bol nadmerne vystavený u karcinómu žalúdka, a že môžu byť spojené s horšou prognózou [30]. V tejto štúdii sme sa ďalej skúmala funkcie AP-4 v ľudskom žalúdku nádorové bunky s RNA interferencie.

Výsledky

špecifické siRNA cieli na expresiu AP-4 v ľudských buniek karcinómu žalúdka a človek normálne sliznice bunky

pre vyhodnotenie účinku siRNA sprostredkované ticha génovej expresie AP-4, ovládacie siRNA a AP-4 špecifické siRNA boli transfekovány do buniek po dobu 24 h, 48 h, 72 h a 96 h. Účinnosť v down-regulácii expresie AP-4 génu bola detekovaná pomocou real-time kvantitatívnej PCR a westernovým prenosom. Ako je znázornené na obrázku 1, mohol AP-4 špecifické siRNA účinne inhibujú génovú transkripciu a transláciu. Hladiny mRNA a proteínové AP-4 boli znížené s AP-4 siRNA transfekcia skupinu, ale nie v kontrolnej siRNA (obrázok 1). Indukovaná potlačenie siRNA of AP-4 expresie by mohla byť detekovaná v 24 hodinách po transfekciu. Avšak pomer inhibícia sa znížila 72 hodín po transfekciu. Najúčinnejšia časový bod boli medzi 48 h až 72 h v potláča expresiu AP-4. Relatívna hladiny mRNA transkriptov značne klesol o takmer 90%, v siRNA-1 skupiny, a 95% v siRNA-2 skupiny. Bola štatistická významnosť medzi siRNA skupinou a kontrolnou skupinou.

Down-regulácia AP-4 expresiu inhibuje bunkovú proliferáciu a citlivé ľudskej žalúdočnej rakovinových buniek k protinádorovej látky

Ak chcete skúmať účinok AP-4 špecifické siRNA na proliferáciu buniek a chemo-citlivosti rakovinových buniek, 20 nm boli transfekovány AP-4 špecifické siRNA alebo kontrolné siRNA a proliferácie buniek bola stanovená pomocou CCK-8 testu 48 hodín po transfekciu. Zistili sme, že knockdown AP-4 môže inhibovať proliferáciu bunkovej línie karcinómu žalúdka SGC7901 a AGS (obrázok 2), ale nie v normálnej sliznice bunkovej línii GES-1 v porovnaní s kontrolnou siRNA transfekcia do 48 hodín (obrázok 2). Tieto výsledky ukazujú, že AP-4 siRNA tlmí bunkovú proliferáciu buniek karcinómu žalúdka in vitro. Ďalej sme skúmali úlohu AP-4 v regulácii chemo-citlivosti ľudských buniek karcinómu žalúdka. Porovnávali sme citlivosti voči liečivám AP-4 siRNA sa, že riadiace siRNA alebo falošne buniek, a zistili, že relatívna rýchlosť inhibícia AP-4 špecifické siRNA boli významne vyššie než u kontrolnej siRNA alebo falošne buniek (p 0,0001) (Obrázok 2 ). Okrem toho, AP-4 siRNA významne zvyšuje citlivosť buniek na ADR, 5-FU alebo liečbe cis-plantinum v dvoch odlišne dávkach (obrázok 2), to navrhol, že down-regulácia AP-4 môže mať priaznivý účinok v citlivosť chemoterapia.

Umlčanie expresie indukované zastavenie bunkového cyklu v AP-4 a modulovaná expresia p53, p21 a cyklín D1

účinok AP-4 na progresiu bunkového cyklu bola skúmaná , Ľudských buniek karcinómu žalúdka boli prenesené s 20 nM kontrolnej siRNA, a AP-4 špecifické siRNA po dobu 48 hodín, v danom poradí, nasledované farbením propidium jodidu a prietokovej cytometrie bunkového cyklu. Kým bunky transfekované kontrolné siRNA postupoval prostredníctvom rôznych fázach bunkového cyklu, buniek transfektovaných s AP-4 špecifické siRNA zobrazená významne vyššia početnosť buniek v G0 /G1 fáze (SGC7901 /siRNA-1: 68,81%, SGC7901 /siRNA-2: 68,97%; AGS /siRNA-1: 61,92%; AGS /siRNA-2: 63,67%) a nižšia početnosť buniek v S-fáze (SGC7901 /siRNA-1: 29,57%; SGC7901 /siRNA-2: 29,84%; AGS /siRNA-1: 24,36%; AGS /siRNA-2: 22,91%). Percento buniek v G0 /G1 fáze v bunke prenesené s AP-4 siRNA bola významne vyššia ako u falošne buniek (SGC7901: 54,65%; AGS: 48,44%) (p menšie ako 0,05), alebo kontrolné siRNA (SGC7901 /kontrola siRNA: 52,18%; AGS /kontrolné siRNA: 50,38%) (obrázok 3). Preto transfekcia s AP-4-špecifických siRNA indukovanej bunkovej cyklin zastaviť u G0 /G1 fáze.

AP-4 špecifické siRNA indukované blok bunkového cyklu bol ďalej vyšetrovaný tým, že sleduje účinky liečby AP 4-špecifická siRNA na relatívnej expresie regulátorov bunkového cyklu: nádorového supresor p53, cyklin závislých inhibítorov kinázy p21, a G (1) fázový špecifické cyklin D1, ktoré boli dôležité regulátory bunkového cyklu a proliferácie. Štyridsať osem hodín po transfekciu ľudských buniek karcinómu žalúdka boli zhromažďované pre real-time PCR a analýzou imunoblotu. Transfekcia s AP-4 špecifické siRNA by up-regulovať expresiu p53 a p21 proteínu. Modulačné účinok AP-4 siRNA bola väčšia než u kontrolnej siRNA (obrázok 4), (p 0,01). Ako sa dalo očakávať, cyklin D1 bola down-regulované v porovnaní s kontrolnou siRNA skupinu a falošný skupinu (obrázok 4) (p 0,01). Tieto údaje ďalej podporili hypotézu, že umlčanie expresiu AP-4 zmenený expresiu iných regulátorov bunkového cyklu, indukované bunkového cyklu a inhibuje proliferáciu ľudských nádorových buniek žalúdka

Detekcia apoptózy a faktorov podieľajúcich sa apoptóza dráha

Za účelom kvantifikácie účinku AP-4 špecifické siRNA na apoptózu ľudských buniek karcinómu žalúdka, annexin-v a PI farbenie testy boli použité v spojení s prietokovou cytometriou. Bunky boli zafarbené annexin V-FITC /PI a bránou do pravého dolného (LR) a vpravo hore (UR) kvadranty. Bunky v LR a UR boli považované za zavčas proapoptotický (annexin ^{+ /PI -) a neskoré apoptotického (annexin + /PI +), resp. Bunky v LL (vľavo dole) a UL (vľavo hore) kvadranty boli považované za živý a nekrotické resp. Rozsah apoptózy bola vyjadrená ako súčet percentuálnych podielov v LR a UR kvadranty. Apoptotické sadzby boli zobrazené na obrázku 5. ošetrených buniek s AP-4 siRNA ukázal viac apoptotické bunky (SGC7901 /siRNA-1: 14,0%; SGC7901 /siRNA-2: 11,5%; AGS /siRNA-1: 20,1%; AGS /siRNA-2: 23,6%) ako negatívna (SGC7901 /riadiaci siRNA: 5,5%; AGS /kontrolné siRNA: 6,7%) (p < 0,05) a blank (SGC7901: 4,2%; AGS: 4,9%) (p menšie ako 0,05) , Tieto výsledky ukázali, že AP-4 špecifické siRNA boli schopné indukovať apoptózu v týchto bunkách.}

Ďalej sme skúmali expresiu faktorov zapojených do apoptózy dráhe s real-time PCR na úrovni mRNA, ako je Bcl-2 , Bcl-x _{L, kaspázy-9, kaspázy-8 a Bax. Ukázalo sa, že porazený AP-4 by up-regulovať expresiu Baspase-9 v ľudských buniek karcinómu žalúdka, a modulačné účinok AP-4 siRNA bola väčšia než u kontrolnej siRNA (obrázok 6) (p 0,01). Expresia Bcl-2 a Bcl-x L boli znížené v porovnaní s kontrolou siRNA alebo makety skupiny (obrázok 6) (p 0,01). Tieto dáta ďalej podporované, že umlčanie AP-4 expresie viedla k apoptózy u ľudských buniek karcinómu žalúdka. Avšak expresia kaspázy-8 a Bax boli rôzne v rôznych bunkových línií po transfekciu. Štyridsať osem hodín po transfekciu, kaspázy-8 a Bax bolo viac ako expresia v bunkách AGS. V SGC7901 bunkách, expresia Bax zvyšuje, ale expresia kaspázy-8 sa zvýšil iba v siRNA-1 skupiny. V siRNA-2 skupiny, kaspázy-8 výraz nebol významný postihnutá (Obrázok 6).}

AP-4 tlmenie hluku by mohli regulovať bunkový cyklus a apoptózu buniek ako v p53-závislej a nezávislé-mravmi

Ak chcete overiť, či up-regulácia p53 v AP 4-porazený buniek karcinómu žalúdka bol kritický k úlohe zástavy bunkového cyklu, bunky Kato-III, druh p53 defektné žalúdočné rakovina bunkové línie sa na ohodnotenie závislosť AP -4 knockdown účinok na p53. Zistili sme, že vyraďujúce AP-4 v AGS s divokým typom p53 alebo SGC7901 s mutantnými p53 by mohlo vyvolať zástavu bunkového cyklu, ale tento jav nebol pozorovaný u buniek Kato-III (obrázok 7), percento buniek v G0 /G1 fáza bola 57,82% (siRNA-1) 59.05% (siRNA-2) 59,59% (kontrolné siRNA) a 59,06% (falošný). Tie, ktoré ukázali, že knockdown AP-4 možná regulácia bunkového cyklu pomocou p53-p21 dráhy. Apoptóza populácia bola tiež zistená v bunkách Kato-III s annexin V-FITC a PI farbenie. Výsledky ukázali, že miera apoptózy buniek Kato-III transfekciou s AP-4 siRNA (siRNA-1: 7,9%, siRNA-2: 9,2%) bol vyšší ako kontrolná siRNA (3,3%) (p menšie ako 0,05) a mock bunky (3,5%) (p menšie ako 0,05), ale v menšej miere, než tomu bolo na AGS (p menšie ako 0,05) a SGC7901 buniek (p menšie ako 0,05), čo ukazuje, že umlčanie AP-4 by mohlo vyvolať apoptózu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom obaja p53-závislé a nezávislé-spôsobmi.

Diskusia

Génová expresia je základným a vysoko konzervatívny proces. Transkripcie je prvým krokom v génovej expresii, sa vykonáva pomocou štruktúrne konzervované DNA dependentnej RNA polymerázy, čo má za následok syntézu molekuly RNA z DNA templátu [31]. Transkripčné faktory, forma transkripčný iniciačný komplex s RNA Polymerase II, podieľať sa na procese iniciácie transkripcie regulovať génovú expresiu. Môžu zohrávať dôležitú úlohu pri vzniku nádorov, transformácia, nádorové progresie a metastáz reguláciou transkripcie a teda aj génovú expresiu [32], [33], [34]. Transkripčný faktor AP-4, ktorá patrí do rýchlo rastúcu skupinu Proteíny HLH [8], sa podieľa na diferenciáciu a bunkovú proliferáciu [35], [36], [37], [38], [39], sa týka udalosti bunkového cyklu a apoptózu, reguluje a kontroluje určitú génovú expresiu [9], [10] [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. V poslednej dobe bolo publikované, že AP-4 bola up-regulovaná v karcinómu hrubého čreva, rakoviny prsníka a rakoviny prostaty [9], [18], [24]. Okrem toho, AP-4 pozitívne výraz naznačoval zlú prognózu s významom cez stupňa, stavu uzlín alebo veľkosti v ER + karcinómu prsníka, a možný vzťah s chemo-citlivosťou [40]. V našom skôr štúdii sme zistili, že expresia AP-4 bol nadmerne exprimovaný, a to čo-súvisiace so zlou prognózou [30]. To môže byť molekulárnej marker pre diagnózu a prognózu rakoviny žalúdka. V tejto štúdii,. Navrhli sme dve AP-4 špecifické siRNA inhibovať expresiu AP-4 génu v ľudských buniek karcinómu žalúdka. Boli dobre zavedené a transfekovány do buniek za následok knock-down AP-4 génovej expresie. Zistili sme, že najúčinnejšie časový bod v supresii expresie AP-4 v rakovinových bunkách žalúdku bolo 48 h a 72 h po transfekciu. Preto sme vybrali bývalý ďalej vykonávať súvisiace vyšetrenia.

Predtým bolo ukázané, že transkripčný faktor AP-4, na rozdiel od iných proteínov HLH, obsahoval dve rozdielne opakujúce sa leucín prvky, ktoré tiež priama dimerizáciu a umožňujú selektívne tvorba komplexu z všadeprítomné AP-4 proteínu, [8], [41].

AP-4 by mohla zohrávať dôležitú úlohu pri modulácii bunkovej funkcie prostredníctvom regulácie génov podieľajúcich sa na produkcii vírusu [7], [16, ], [22], [42], [43], rast buniek a prežitie [9], [17], [23], [44], imunitnú odpoveď [14], [41], [45], a angiogenézy [21]. Peter Jung, et al zistili, že AP-4 by mohli kódovať c-myc-indukovatelný represor pre inhibíciu expresie p21 [9], a pravdepodobne hrá dôležitú úlohu pri sprostredkovaní proliferačnej aktivity c-myc [10]. Okrem toho, AP-4 ovplyvnená citlivosť k apoptóze regulovaním expresie kaspázy-9 [17]. V tejto štúdii sme zistili, že down-regulácia AP-4 inhibuje proliferáciu ľudských buniek karcinómu žalúdka in vitro. Pomer inhibícia proliferácie AP-4 špecifické siRNA bola významne nižšia ako u buniek transfekciou kontrolnej siRNA alebo návrhy skupiny.

Chemoterapia je jedným z dôležitých stratégií pre liečbu rakoviny žalúdka, ale často zlyháva, pretože odolnosť proti protinádorových liečiv. Bolo oznámené, že AP-4 pozitívne expresie bola pravdepodobne spojená s chemo-citlivosťou [40]. Ďalej sme skúmali úlohu AP-4 v regulácii chemo-citlivosti ľudského karcinómu žalúdka buniek a bolo zistené, že inhibícia AP-4 by mohlo významne zvýšiť citlivosť týchto buniek na ADR, 5-FU alebo liečbe cis-plantinum, čo naznačuje, že inhibícia AP-4 môžu mať priaznivý vplyv na chemo-citlivosti.

Okrem toho, umlčanie AP-4, indukovanej bunkového cyklu v G0 /G1 fáze, analýzu možných mechanizmov, ktoré sú základom účinkov AP-4 tlmenie hluku na inhibíciu proliferácie nádorových buniek ľudského žalúdka boli charakterizované expresiou regulátorov bunkového cyklu v súvislosti s. Zistili sme, že down-reguláciu expresie AP-4 inhibuje expresiu cyklin D1, ale up-regulovaný expresiu p53 a p21. p53 a p21 bola vyslovená hypotéza, že je negatívny regulátor bunkového cyklu a proliferácie [46], [47], na druhej strane, cyklin D1 podporovaný progresiu cez G _{1-S-fáze bunkového cyklu [48 ]. Down-regulované expresie AP-4, p21 a p53 v medzičase by mohla byť účinná zástavu bunkového cyklu spôsobili vyraďujúce AP-4 zmiznutia. Tieto výsledky sú v súlade s modelom, v ktorom AP-4 indukuje zástavu bunkového cyklu regulovaním expresie regulátorov bunkového cyklu, ako je p53, p21 a cyklín D1.}

Apoptóza alebo programovanej bunkovej smrti, je známa aby sa zapojili do rôznych biologických procesoch dvoma hlavnými apoptotických dráh, mitochondriálnej (vnútorné) dráhy a receptora smrti (vonkajšieho) dráhy [49]. Zistili sme, že umlčanie expresiu AP-4 trigged apoptózu v našom experimente, ktorý preukázal, že AP-4 potlačená apoptózu ľudských buniek karcinómu žalúdka.

V našom experimente, zvýšenie hladiny kaspázy-9 a down-regulácia Bcl-2 a Bcl-x _{L boli zistené u ľudských buniek karcinómu žalúdka, čo naznačuje, že vyraďujúce AP-4 aktivovaných ako vnútorné a vonkajšie dráhy na apoptózu v rakovinových bunkách. [49], [50]}

V súhrne, tieto údaje ukazujú, že RNAi sprostredkovanej down-regulácia transkripčného faktora AP-4 účinne inhibuje bunkovú proliferáciu, je uvedené zástavu bunkového cyklu, spúšťa apoptózu a zvýšenú citlivosť chemo ľudských buniek karcinómu žalúdka so zníženou expresiou cyklin D1, Bcl-2 a Bcl-x _{L a aktivovaný p21, p53 a kaspasy 9 expresie, ktoré naznačujú, AP-4 môže byť onkogén hrá dôležitú úlohu pri vzniku nádorov , Hoci presný mechanizmus tejto role musí byť ďalej skúmaná, môže AP-4specific-siRNA mať potenciálny hodnoty ako nových terapeutických látok určených na ľudskú rakoviny žalúdka.}

materiáloch a metódach

Bunková línia a bunková kultúra

rakovina žalúdka u bunkové línie AGS s wild-type p53, SGC7901 s mutantný p53 (získaného z Wuhan University) a Kato-III s deléciou p53 genómu (Zhiyan Bio Technology Co, Shanghai) boli kultivované v DMEM médium alebo médium RPMI1640 (Invitrogen), obsahujúcim 10% fetálneho hovädzieho séra (Invitrogen), penicilínu (100 u /ml) a streptomycínom (100 ug /ml). Bunky boli udržiavané pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére 5% CO _2.

špecifické siRNA a transfekcia

cDNA sekvencie génu AP-4, bol získaný z Genbank ( NM_003223) a cielenie sekvencie dvoch 21 nukleotidov rôznych siRNA boli navrhnuté a syntetizované chemicky (Qiagen Nemecko). Nukleotidové sekvencie boli nasledujúce: siRNA-1, 5-CGGGAUUCCAGUCCCUCAATT-3 '(sense) a 5'-UUGAGGGACUGGAAUCCCGCG-3' (antisencie). siRNA-2, 5-UGGGAUUGUCAGCCUUCAATT-3 '(sense) a 5'-UUGAAGGCUGACAAUCCCAGG-3' (antisencie). Allstars negatívne kontrolné siRNA (Qiagen, Nemecko) boli použité ako kontrola miešaná siRNA. Bunky boli nanesené na 6-jamkové doštičky a siRNA boli transfekovány do kultúry buniek s Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu.

Real-time kvantitatívne PCR

Celková RNA bola vykonaná extrakcia s použitím RNAiso Plus (Takara, Japonsko) podľa protokolu výrobcu. CDNA z celkovej RNA boli syntetizované za použitia PrimeScript® RT činidla Kit (Takara, Japonsko). Expresia mRNA bola hodnotená pomocou real-time PCR na prístroji ABI StepOne Plus (Applied Biosystems, Singapore) s Fast SYBR Green PCR činidlá. GAPDH bola použitá ako vnútorná kontrola. Koncentrácia reakčných zložiek boli upravené pre dosiahnutie konečného objemu 20 ul, obsahujúcom 2 ul reverznej transkripcii produktu, 10 ul Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 0,5 ul 10 uM dopredu a reverzné primery. Reakcia bola vykonávaná 45 amplifikačných cyklov 95 ° C počas 3 sekúnd a 60 ° C počas 30 s. Tieto boli skonštruované nasledujúce priméry (Table.1). PCR priméry boli navrhnuté Primer 5.0 a Blast vyhľadávanie skontrolovať špecifickosť. Sekvencia primérov použiť, sú uvedené v tabuľkách 1. Výsledky boli vypočítané za použitia 2 ^{-ΔΔCt metódu.}

Western blot

Proteín sa extrahuje extrakciu proteínu súpravou (Beyotime, Čína) podľa smeru. Proteín bol zriedený až 3 ug /ul a sa oddelí 10% SDS-PAGE, prenesené na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membrány (Millipore, USA), a potom bola blokovaná v 5% odtučnenom sušenom mlieku v TBST po dobu 1 hodiny pri izbovej teplote. Imunoblotování bola vykonaná s použitím anti-AP-4 protilátky (Sigma-Aldrich, Shanghai, riedenie 1: 1000), anti-p21 protilátky (Sigma-Aldrich, Shanghai, riedenie 1: 1000), anti-p53 protilátky (abca, UK, riedenie 1: 500) a anti-cyklin D1 protilátka (abca, UK, riedenie 1: 500) cez noc pri 4 ° C. Po trikrát opláchnuté TBST, bola membrána inkubovaná s chrenovou peroxidázou konjugované sekundárnej protilátky (riedenie 1: 2000, Boster, Čína) po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti. Výsledok bol vizualizovaný pomocou systému blotting detekcie ECL Western Plus v súlade s pokynmi výrobcu. Anti-β-aktínu (riedenie 1: 1000, Boster, Čína) protilátka sa správal ako vnútornej kontroly.

Meranie bunkovej proliferácie

Vplyv umlčanie AP-4 na proliferáciu žalúdočné nádorových buniek po 48 hodinách transfekcia bola meraná Cell počítanie Kit-8 (CCK-8) (Beyotime, Čína), podľa inštrukcií výrobcu. V stručnosti, bunky rakoviny žalúdka boli kultivované v 96-jamkových doštičiek a transfekovány 20 nM kontrolnej siRNA, AP-4 špecifické siRNA. Po 48 hodinách, 10 ul CCK-8 činidla bolo pridané do každej jamky, po 1 hodine inkubácie pri teplote 37 ° C, absorbancie meranej pri 450 nm. Relatívna hladiny bunkovej proliferácie v každej skupine buniek, bola vypočítaná podľa nasledujúceho vzorca: R = (A2-A1) /A2 × 100% a P = A1 /A2 x 100%, kde R bol relatívne inhibičné rýchlosť a P bola relatívne pomer proliferácie rastu buniek; A1was priemerné hodnoty absorbancie transfekciou buniek; a A2 bola priemerná hodnota absorbancie netransfekovaných kontrolných buniek bez akéhokoľvek liečbu drogovej závislosti. Všetky experimenty boli vykonané s 5 vrtov na experiment a opakované najmenej trikrát.

bunkového cyklu testu

Bunky boli zozbierané 48 hodín po transfekciu a fixované v 70% ľadovo studeného etanolu cez noc, premyje s 1 x PBS, a zafarbené propidium jodidom (PI) (50 ug /ml) v 1 x PBS, doplnenom RNázy (50 ug /ml) počas 30 minút. Testy boli vykonávané v trojitom opakovaní pre každú vzorku, a analýzy boli vykonané pomocou prietokového cytometra (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) v súlade s pokynmi výrobcu.

Test Chemo-citlivosti in vitro

ako bolo popísané vyššie, CCK-8 test bol použitý pre hodnotenie účinku chemo-citlivosti nádorových buniek k žalúdočnej protinádorových liečiv. Stručne povedané, šesť hodín po transfekciu bolo médium odstránené a nahradené čerstvým médiom obsahujúcim rôzne koncentrácie liek proti rakovine (ADR, 5-FU alebo cis-platina) a inkubované po dobu 48 hodín. Relatívne inhibičná rýchlosť bunkového rastu bola vypočítaná podľa vzorca uvedeného vyššie.

Apoptóza skúška podľa annexinu V-FITC a propidium jodidu (PI) farbením

Aby bolo možné posúdiť mieru bunkovej apoptózy, apoptóza bola kvantifikovaná pomocou annexin-V-FITC a propidium jodidom dvojitým farbením pomocou annexin-V /FITC kit (Antgene, Čína). Bunky boli zbierané v súlade s pokynmi výrobcu 48 hodín po transfekciu, premyje so studeným PBS a suspendovať vo väzobnom pufri, a potom boli bunky inkubované 30 minút v tme pri teplote 4 ° C s annexin V-FITC a PI vo fosfátovom pufri a analyzované na prietokovom cytometri (FACS CantoII, BD Bioscience, USA) počas 1 hodiny po farbení.

Štatistická analýza

Všetky údaje boli uvedené ako priemer ± SD. Rozdiel medzi skupinami bol analyzovaný pomocou jednocestnej ANOVA a Student-Newman-Keuls (SNK) -q testu s použitím SPSS 12.0 pre Windows softvér. Štatistická významnosť bola definovaná ako * p menšie ako 0,05 a ** p. ≪ 0,01

Poďakovanie

Ďakujeme Wu KE, Shi Liang Teng Meizhou, Li Hang a Li Wei za ich odbornú technickú pomoc .

• Ploche ONE: Long-Term Výsledky a Prognostické faktory karcinómu žalúdka u pacientov s mikroskopickú peritoneálnej karcinosou
• Ploche ONE: Hodnotenie rizík rakoviny žalúdka spôsobené Helicobacter pylori pomocou ČAGA sekvenčné značiek