la transmisión de Helicobacter pylori hizo a los humanos causan un brote de la enfermedad en una colonia de la raya de cara dunnarts (Sminthopsis macroura)

¿Se transmisión de Helicobacter pylori
de los seres humanos causan un brote de la enfermedad en una colonia de la raya de cara dunnarts (Sminthopsis macroura
)?
Resumen
Desde el descubrimiento de que Helicobacter pylori ¿Qué causa una serie de patologías en los estómagos de los seres humanos infectados, se ha hecho evidente que Helicobacters
se encuentran en una amplia gama de especies animales en los que con frecuencia se asocian con la enfermedad. En 2003 y 2004, hubo dos brotes de aumento de la mortalidad asociadas con hemorragia gástrica y la pérdida de peso en una colonia cautiva del marsupial australiano, el Dunnart enfrentado-Raya (Sminthopsis macroura
). La presencia de patología gástrica condujo a una investigación del potencial Helicobacter
patogénesis en estos animales. El examen histológico reveló la presencia de gastritis, y análisis de PCR confirmó la presencia de Helicobacter
infección en los estómagos de estas marsupiales. Sorprendentemente, la secuenciación de ARNr 16S de estas bacterias se identificaron las especies como H. pylori
y PCR confirmó la cepa ser positivos para el factor de patogénesis importante, cagA
. Por lo tanto, se describe, por primera vez, una infección zoonótica inversa aparente de dunnarts raya con cara con H. pylori
. Ya propensos a los efectos patológicos de estrés (como se experimentó durante la época de cría), concomitante con la infección por H. pylori
parece ser un posible cofactor esencial, pero no suficiente en la hemorragia gástrica prototípica y la pérdida de peso en estos marsupiales. El Dunnart raya con cara podría representar un nuevo modelo para la investigación Helicobacter
patología gástrica impulsada. Infecciones de sus manipuladores humanos, específicamente de H. pylori
, pueden ser un riesgo potencial para las colonias cautivas de marsupiales.
Introducción Francia El descubrimiento del Helicobacter pylori
finalmente llevó a la comprensión de que la infección de la estómago humano con esta bacteria es un factor etiológico fundamental en el desarrollo de la enfermedad de úlcera péptica y adenocarcinoma gástrico [1-3]. Otra consecuencia importante de que el descubrimiento ha sido la identificación posterior de un siempre creciente, aparentemente ubicua de Helicobacter
especies que infectan el tracto gastrointestinal de prácticamente todos los animales examinados. De hecho, muchos de Helicobacter
infecciones se cree que son patógenos y posiblemente responsable de una amplia gama de condiciones en numerosas especies animales (revisado en [4, 5]). Por ejemplo, las infecciones por Helicobacter Natural History se han relacionado con la gastritis en pequeñas y grandes gatos, perros, cerdos y hurones [6-10], el aborto en el ganado ovino [11], la colitis y la hepatitis en los monos rhesus [12], en las úlceras delfines y ballenas [13] y la diarrea en los gatos y loros [14, 15].
en este informe se describen dos brotes de muertes en una colonia cautiva de un marsupial australiano, el Dunnart enfrentado-raya (Sminthopsis macroura
), que fueron asociados con sangrado en el estómago, posiblemente debido a la infección por el patógeno humano, H. pylori
.
Materiales y métodos
raya con cara dunnarts Empresas el dunnarts raya de cara fueron alojados en el Departamento de Zoología de la Universidad de Melbourne. La colonia se llevó a cabo dentro de jaulas mantenidas dentro de un edificio de temperatura regulada propósito construido, en un entorno físico en condiciones típicas para aquellos para los ratones de vivienda, excepto que la iluminación natural se mantuvo. alojamiento de los animales en jaulas especialmente diseñadas, la dieta formulada para marsupiales carnívoros insectívoros y monitoreo reproductiva siguió el esquema presentado anteriormente [16]. No hay otras especies animales fueron alojados en este edificio. Los dunnarts se proporcionaron ad libitum. No hay dunnarts murieron específicamente para este estudio; intestinos de animales fueron recogidos de los animales sacrificados, ya sea por enfermedad o por otra experimentación aprobado por la Universidad de Melbourne Ciencia, Optometría & Ciencias de la Visión y Land & Entorno de los animales ética de los comités. Los animales se pesaron a intervalos semanales durante la cría de animales rutina
test de la ureasa (prueba CLO)
biopsias de estómago de 1-2 mm se colocaron en el gel de una prueba rápida de ureasa (CLOtest;. Kimberly-Clark, Roswell, Georgia, EE.UU.). Las pruebas fueron monitorizados durante un periodo de 24 h para un cambio de color de amarillo a rojo que indica la presencia de un organismo productoras de ureasa en el estómago.
Evaluación histológica de la patología
mitades de estómago fueron fijadas en 10% formalina tamponada neutra , incluidas en parafina, a continuación, 4 secciones micras de espesor cortadas y teñidas con hematoxilina y eosina.
Detección de Helicobacter
infección por género específico PCR
Para la evaluación de Helicobacter
infección por PCR, las heces eran recogidos, o estómagos dunnart se abrieron a lo largo de la curvatura interior y todo el órgano homogeneizó (homogeneizador Polytron GmbH; Kinematica, Suiza). raspados de la mucosa, también se recogieron desde el intestino (grandes y pequeños). Se extrajo el ADN de las heces y raspados intestinales utilizando un kit de ADN en heces QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemania), y desde el estómago homogeneizada utilizando el kit de ADN QIAamp tejido (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Un Helicobacter
género PCR dirigidos a un fragmento de 374 pb del gen 16S rRNA se realizó según lo descrito anteriormente [17].
Enfoques para cultivar Dunnart gástrica por Helicobacter
estómagos Dunnart se recogieron y se homogeneizaron en Corazón Cerebro caldo de infusión (BHI; Oxoid, Basingstoke, Reino Unido). Homogeneizado fue introducido en agar sangre de caballo o placas GSSA (como se describe anteriormente [18]) que se incubaron en un recipiente anaeróbico con un kit generador de gas microaerofılico (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) hasta por 10 días a 37 ° C. Para la técnica de filtración, homogeneizado se colocó en 0,65 micras papel de filtro Whatman (GE Healthcare, Rydalmere, Australia), colocado en placas HBA, y se incubó a 37 ° C bajo condiciones microaerofílicas durante 2 h. Los filtros se retiraron a continuación y las placas se incubaron a 37 ° C bajo condiciones microaerophilic de hasta 10 días.
Secuenciación de genes de ARN ribosomal 16S
, cagA
y urea
Nueve muestras de ADN extraído de dunnart estómago y raspados intestinales fueron sometidos a secuenciación. Se realizaron las PCR para los genes de Helicobacter
como se ha descrito anteriormente para el ARNr 16S
[17], cagA
[19] y urea
[20]. la secuenciación del ADN de los productos PCR positivos se llevó a cabo por medio de la química de terminador BigDye (Applied Biosystems; Foster City, EE.UU.). La secuenciación de tanto el 5 'y 3' de los amplicones se produjo en un volumen de 20 l que consiste en 3,5 l de tampón de secuenciación, 1 l BigDye v3.1, 10 pmol /l del cebador necesario, 40-100 ng de ADN, y agua hasta completar el volumen final. El programa de secuenciación consistía en 96 ° C durante 1 min, 30 ciclos de 96 ° C durante 10 segundos, 50 ° C durante 5 min y 60 ° C durante 4 min. . Las secuencias se compararon con las secuencias de genes de identidades conocidas utilizando el programa de búsqueda BLASTn disponible a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) página web [21]
Resultados
muerto en una colonia Dunnart raya con cara - 2003
Una colonia de dunnarts raya de cara ha estado en existencia desde hace 26 años, inicialmente en la Universidad de la Trobe (Melbourne, Australia), y luego en el Departamento de Zoología de la Universidad de Melbourne. La colonia tiene normalmente entre 60-100 animales en los que la proporción de sexos es 1/1. La muerte por enfermedad es rara en estos animales y en un año normal, el total de muertes se producen a una velocidad de alrededor de 10% o menos del número de animales en la colonia. La mayoría de las muertes se producen como consecuencia de las heridas obtenidas durante el apareamiento (las carreras de la temporada de cría de julio a diciembre) o la vejez.
En 2003 sin embargo, hubo un dramático aumento de la tasa de mortalidad de estos animales, con el 29% de la dunnarts (30/104; registra por igual a hombres y mujeres) que mueren en el período de 6 meses de julio a diciembre. Los animales moribundos fueron de 1-2 años de edad y las muertes no estaban relacionadas con la vejez. Dunnarts generalmente pierden peso corporal durante la época de reproducción y esta pérdida de peso también fue notablemente aumentaron durante el año 2003. Hombre dunnarts suelen perder un peso promedio de 12% del cuerpo de julio a diciembre, pero en 2003 se perdieron un promedio de 27,7%. Del mismo modo, dunnarts mujeres perdieron un promedio de 30,3% durante el mismo período de 2003, en comparación con una pérdida promedio típico de 16%. La Figura 1 muestra la pérdida de peso relativo observado por estos dunnarts en 2003, en comparación con la pérdida de peso observada en 2006, un año típico en el que no hubo aumento de la mortalidad. Figura 1 pérdida en el peso corporal en Dunnart enfrentado-Raya aumentado durante los brotes de enfermedades. Los valores mostrados presente el cambio medio en el peso corporal ± S.E.M. dunnarts de la raya con cara durante julio-diciembre (calculado como el peso de cada animal en septiembre y diciembre como un porcentaje de su peso en julio). Los datos mostrados son de un año del brote de la enfermedad (2003; n =
25) y un año normal cuando no se observó aumento de la mortalidad (2006; n = 35
). Tanto hombres como mujeres están incluidos y los datos combinados, ya que ambos sexos perdieron pesos corporales similares. No hubo diferencia significativa en el peso corporal en septiembre de 2003 y 2006. Sin embargo, los animales perdieron significativamente más peso en el período hasta diciembre de 2003, en comparación con el mismo periodo de 2006 (p * Hotel < 0,001; ANOVA). Francia El única patología evidente observado en el post mortem fue que casi la mitad de los animales que murieron o fueron sacrificados debido a ser muy enfermo tenía una hemorragia gástrica severa. Aparte de una mayor pérdida de peso, la mayoría de los animales parecían sanos hasta 1-2 días antes de la muerte, aunque algunos tenían heces negras (en consonancia con sangrado gastrointestinal) y signos de anemia (hocicos pálidos y las encías).
Muerto en una franja de rostro dunnart colonia - 2004 Francia el sangrado gástrico presente en estos animales planteó la posibilidad de ulceración gástrica como resultado de Helicobacter
infección. Por tanto, en mayo de 2004, los estómagos de dos dunnarts mujeres asintomáticas fueron probados por Helicobacter
la infección mediante la prueba de CLO. Estos resultaron ser positivo y de apoyo de un Helicobacter
infección gástrica. El análisis histológico de estos estómagos reveló la presencia de un proceso inflamatorio relativamente suave, marcado por agregados linfoides en la lámina propia (Figura 2), aunque no hay bacterias colonizadoras, ya sea en forma de espiral o cocoides se pudieron observar en estas secciones. Sin patología grave fue evidente en estas secciones particulares, aunque se recogieron estos estómagos fuera de la temporada de reproducción cuando el aumento de la mortalidad y hemorragia gástrica no se estaba produciendo. Figura 2 La inflamación en la lámina propia gástrico de un Helicobacter infectados con Dunnart. Una imagen se muestra desde un amplificador H &; E sección del cuerpo gástrico manchada, a partir de un Helicobacter
infectados con Dunnart (aumento x 100). El estómago se recogió en mayo de 2004.
Entre julio y diciembre de 2004 un segundo incidente de aumento de la mortalidad se produjo, con 24 de los 81 (30%) de la colonia Dunnart morir, 6 de los cuales tenía una hemorragia gástrica.
varios casos en 2003 y 2004, las mujeres que se consideraban estar embarazada de monitoreo reproductiva habían abortado la camada cuando fueron examinados para obtener embriones.
Helicobacter
infección en la colonia Dunnart 2005-2008
en 2005, y en los años siguientes, la tasa de mortalidad volvió a niveles normales (~ 10% por año) se observaron y no hay más casos de hemorragia gástrica. Sin embargo se hicieron intentos esporádicos para examinar más a fondo la aparente gástrica por Helicobacter
infección en estos animales. Estos intentos se vieron limitadas por la disponibilidad de animales para este tipo de estudios.
En 2006, la presencia de Helicobacter Hoteles en muestras fecales recogidas de sexo masculino (n
= 20) y mujeres (n = 20
) dunnarts fueron evaluados por PCR género específico. Con este enfoque, las heces de los números equivalentes de sexo masculino (7/20) y hembra dunnarts (7/20) de la raya de cara, se mostró a ser colonizados con Helicobacter
especies, proporcionando evidencia de la presencia de Helicobacter Hoteles en el tracto gastrointestinal de al menos algunos animales en esta colonia. Los intentos de cultivar Helicobacter
partir de estas muestras fueron infructuosos.
En julio de 2007, el estómago y los raspados intestinales recogidos de dunnarts se analizaron mediante PCR específica de género. Estos mostraron que 10/12 de los animales examinados tenían Helicobacter gástrica
infección. Una vez más, los intentos de cultivar Helicobacter En venta las muestras gástricas fueron infructuosos.
Identificación de las especies de Helicobacter
infección en el estómago Dunnart
Para identificar si un conocido o novedoso Helicobacter
especie estaba infectando la raya -faced Dunnart colonia, el 16S ribosomal RNA
(rRNA) Helicobacter
gen de estas muestras gástricas se secuenció parcialmente. Esto indicaba que el 16S rRNA
secuencia de genes de Helicobacter
infectar a los estómagos de dunnarts raya con cara correspondió a H. pylori
cepas originalmente aislado de diferentes regiones del tracto gastrointestinal humano, incluyendo el estómago y el intestino. Los porcentajes de identidad obtenidos con las secuencias eran 100% (Tabla 1) .Tabla recuperación 1 BLASTn de secuencias de genes de Helicobacter pylori
BLASTn Recuperar
número de acceso de GenBank
Puntuación (bits)
identidad
E-valores
Helicobacter pylori
clon P13 16S ARN ribosomal
gen
EF684928.1
699
100%
0.0
Helicobacter pylori
cepa CD2 16S ARN ribosomal
gen
HM243132.1
699
100%
0.0
Helicobacter pylori
cepa HP504 ARN ribosomal 16S
gen
GU449115.1
695
100%
0.0
Helicobacter pylori
v225d 16S ARN ribosomal
gen
CP001582.1
695
100%
0.0
Helicobacter pylori cepa
407D5 16S ARN ribosomal
gen
HM099656.1
695
100%
0.0
Helicobacter pylori
colar gen de la proteína asociada 15818 citotoxina III (cagA
)
AF083352.1
1288
96%
0.0
Helicobacter pylori NCTC 11639
cagA (cagA
) gen
GQ161099 0,1
1282
96%
0.0
Helicobacter pylori cepa
114C urea ( urea) gen
GQ403154.1
630
96-98%
3e-164 1e-177
Helicobacter
productos de PCR específicos de género derivado de extractos de ADN dunnart gástrica se compararon con el H. pylori
secuencias de GenBank que figuran en la Tabla. Las muestras exhibieron Dunnart 100% de identidad de secuencia con ARNr 16s de cinco aislamientos clínicos humanos de H. pylori
, y 96-98% de identidad de secuencia con cagA y urea En venta dos aislados clínicos humanos de la H. pylori
. Francia El importante H. pylori
factor de virulencia, cag PAI
(cag
isla de patogenicidad) codifica un sistema de secreción tipo IV que implica cagA. No todos H. pylori
cepas poseen este factor de virulencia, y los individuos infectados con cag PAI
cepas positivas típicamente desarrollan gastritis más grave, y tienen un incremento en la posibilidad de desarrollar la enfermedad. La ureasa, una enzima compuesta de dos subunidades urea
y ureB
, es esencial para la patogénesis de H. pylori
en el estómago humano debido a su capacidad para neutralizar el ácido gástrico a través de la producción de bicarbonato. Análisis de PCR utilizando cebadores específicos reveló que la Helicobacter infectante
eran cagA
y urea
positiva, y la secuenciación de genes reveló 96% de identidad con cagA Opiniones y 96-98% de identidad con urea
de H . pylori gratis (Tabla 1).
pérdida natural de la infección por H. pylori en el
Sminthopsis macroura colonia
Cuando las muestras se obtuvieron de 18 dunnarts femeninos en julio de 2008, sorprendentemente, todos estos animales eran Helicobacter
negativo que indica la colonia había perdido la infección. No hay una explicación obvia para la pérdida de H. pylori
infección en estos animales, ya que no hubo ningún cambio en la cría, ni fueron los dunnarts tratados con antibióticos durante este período.
Para mayor claridad, una cronología de la por encima de los acontecimientos se resumen en la Tabla 2. la colonia Dunnart en el Departamento de Zoología de la Universidad de Melbourne se cerró en 2009, lo que impide aún más study.Table 2 Cronología de eventos
Fecha
evento

julio-diciembre de 2003
aumento de la mortalidad observada en la colonia dunnart con sangrado gástrico.
Mayo de 2004
estómagos Dos dunnart se pusieron a prueba y se demostró que el Helicobacter
positivos mediante la prueba de CLO. La histología reveló gastritis leve.
Julio-diciembre de 2004
Aumento de la mortalidad observada en Dunnart colonia con sangrado gástrico.
2006
heces Dunnart mostraron ser Helicobacter
positivos por PCR.
2007
estómagos dunnart mostrado ser Helicobacter
positivos por PCR. La infección se demostró que el H. pylori fotos: por secuenciación parcial del 16S rRNA
, cagA
y urea
.
2008
Dunnart colonia demostró ser negativo por Helicobacter
PCR de los tejidos gástricos.
Discusión sobre Two brotes de aumento de la mortalidad en una colonia del marsupial australiano, el Sminthopsis macroura en 2003 y 2004 se asocia con hemorragia gástrica y se produjo una coincidencia con una infección transitoria de los estómagos de animales en esta colonia con el patógeno humano, H. pylori
. En particular, esta cepa infectante poseía el factor de virulencia cagA
, lo que sugiere la presencia de la cag
sistema de secreción de tipo IV PAI, asociado con un mayor riesgo de desarrollar cáncer gástrico o de las úlceras pépticas en humanos. Mientras que sólo cinco de las nueve muestras analizadas fueron cagA Dunnart
y urea
positivo, esto puede explicarse por la baja cantidad de ADN de Helicobacter
en estas muestras, aunque la posibilidad de heterogeneidad en las cepas que infectan no puede ser excluido.
Es lamentable que no pudimos cultivar Helicobacter
de los estómagos dunnart, ya que esto nos haya permitido estudiar el nivel de heterogeneidad, en su caso, de estas bacterias en la colonia. Los primeros intentos de cultivar Helicobacter
se lleva a cabo en Perth, Australia Occidental, en las muestras enviadas desde Melbourne. El retraso causado por la recolección y transferencia de estas muestras puede haber limitado nuestra capacidad para aislar las bacterias que infectan. Sin embargo, en estudios posteriores que se intentó cultivarlas a partir de tejido gástrico fresco. Los intentos de tejido fresco usando placas HBA fallaron, no es demasiado sorprendente, debido al crecimiento de los hongos. Cuando se utilizaron placas GSSA selectivos, logramos la cultura inicialmente una bacteria móvil, pero esto fue posteriormente cubierto por un organismo cocoides. A continuación se intentó un enfoque de filtración, que limita con éxito la contaminación por el organismo cocoides, pero por desgracia también no nos permitió aislar Helicobacter
. Esto puede sugerir la Helicobacter
presente en los dunnarts o bien tenían motilidad escasa (una característica importante que se requiere para la migración de las bacterias a través del papel de filtro) o sólo estaban presentes en niveles bajos.
Como la infección por H. pylori
hace no parece ser parte de la flora normal de estos animales (ya que de forma espontánea se aclaró entre 2007 y 2008) que la teoría de que H. pylori
pueden haber entrado en esta colonia como una infección de sus manipuladores humanos. La presencia concomitante de infección estomacal por H. pylori
en el momento de los incidentes de hemorragia gástrica sugiere fuertemente que esta bacteria puede haber contribuido al brote de la enfermedad. Claramente, H. pylori
infección sola fue insuficiente para causar los brotes como la infección estaba presente durante 2005-2007 sin ningún aumento de la mortalidad. Sin embargo, bien puede haber sido un cofactor importante en este proceso.
La pérdida de H. pylori
infección entre 2007 y 2008 es intrigante, con el motivo de esta ocurrencia restante desconocido. Helicobacter dada
estuvieron presentes durante al menos tres años, que no era un fenómeno a corto plazo, pero estuvo presente durante muchos ciclos de reproducción. Por tanto, parece poco probable que la pérdida de esta infección se debió a la Helicobacter sobre ser fuera de competencia por la flora nativa, aunque esta posibilidad no puede descartarse. También es posible que los animales no estaban transmitiendo la infección entre sí, pero quizás estaban siendo constantemente infectados por un controlador humano. Si este fuera el caso, la pérdida de la infección puede haberse debido a un cambio en el manejador de entre 2007 y 2008 romper la transmisión de la infección.
El estrés parece haber sido un importante cofactor en la etiología de la enfermedad, ya que se produjeron los brotes durante la temporada de reproducción en estos animales. La temporada de reproducción es extremadamente estresante para ambos dunnarts masculinos y femeninos, y en un año promedio, se acompaña de una pérdida considerable de peso corporal. Marsupiales pueden ser extraordinariamente sensibles al estrés, y se ha demostrado que los eventos de estrés pueden tener un efecto importante en su sistema inmunológico [22].
A pesar de esto, tiene que haber otra co- o factor causal implicado en el 2003-2004 brotes, como los criados dunnarts mientras infectada con H. pylori
en 2005-2007 sin ningún aumento en la tasa de muerte. Este cofactor permanece sin identificar, pero no parece ser algo relacionado con la cría ya que no hubo cambios en las condiciones de vivienda de la colonia que se asociaron con cualquiera de los brotes o pérdida de H. pylori
la infección de la enfermedad.
en conclusión, proponemos que la infección con el patógeno H. pylori
humana pudo haber sido un elemento esencial, aunque no suficiente cofactor en un brote de hemorragia gástrica con resultado de muerte en una colonia de dunnarts raya de cara. La aparente de infección accidental de estos marsupiales por sus manipuladores humanos, y la asociación con patología gástrica coincidencia, sugiere que estos animales pueden proporcionar un nuevo modelo animal interesante para el estudio de la patogénesis de H. pylori
. Además, esta observación sugiere un posible factor de riesgo para marsupiales cautivas a las infecciones transmitidas por sus controladores humanos.
Declaraciones
Agradecimientos
Los autores no tienen intereses en conflicto. Reconocemos el apoyo de Kamani Nanayakkara, Phil Au, Angela Nación y Ellen Menkhorst para la ganadería y asistencia para la recopilación de muestras. La colonia fue apoyado por fondos de la Fundación Nueva Zelanda para la Ciencia y la Tecnología.
Los autores originales presentados archivos de imágenes
A continuación se presentan los enlaces a los archivos de los autores presentados original para imágenes. 'archivo original para la figura 1 13567_2010_22_MOESM2_ESM.pdf autores 13567_2010_22_MOESM1_ESM.pdf Autores archivo original para la figura 2 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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