impacto pronóstico de la detección de células tumorales circulantes viables en pacientes con cáncer gástrico usando un agente viral-telomerasa específica: un estudio prospectivo study

impacto pronóstico de la detección de células tumorales circulantes viables en pacientes con cáncer gástrico usando un agente viral-telomerasa específica: un estudio prospectivo
Resumen Antecedentes

La identificación de células tumorales circulantes (CTC) en sangre periférica es un enfoque útil para estimar el pronóstico, seguimiento de progresión de la enfermedad, y medir los efectos del tratamiento de diversos tumores malignos. Sin embargo, la relevancia clínica de las CTC es objeto de controversia. Hemos tratado de detectar las CTC viables en la sangre periférica de pacientes con cáncer gástrico utilizando un agente viral-telomerasa específica.
Métodos
se tomó una muestra de sangre de 7,5 ml de 65 pacientes con cáncer gástrico tratamiento negativo antes de la cirugía y 10 sanos voluntarios. Detectamos CTC viables en las muestras de sangre después de la incubación de las mismas con un agente de replicación selectiva, oncolítico adenoviral que lleva la proteína fluorescente (GFP) de genes verde (OBP-401)-telomerasa específica. GFP-positivas CTC se definieron como que tiene un diámetro de al menos 7.735 micras; este umbral se determinó por análisis de la curva característica de funcionamiento del receptor. células GFP-positivas fueron contados bajo un microscopio de fluorescencia.
: Resultados de la Hubo una diferencia significativa en la supervivencia global entre los pacientes con 0-4 y aquellos con ≥ 5 CTC GFP-positivas en la fase de grupos de la enfermedad I-IV y la fase II-IV grupo de enfermedad avanzada. El número de CTC positivas para GFP no estaba relacionada con la etapa del cáncer. Entre los hallazgos patológicos, el número de CTC positivas para GFP sólo fue significativamente relacionada con la invasión venosa, aunque hubo tendencias hacia más CTC positivas para GFP con progresión de la enfermedad (la profundidad del tumor, metástasis ganglionares, metástasis a distancia, invasión linfática, y el tipo histológico ). Conclusiones

Hubo una relación significativa entre el número de CTC positivas para GFP y la supervivencia global en los pacientes con cáncer gástrico. La detección de CTC utilizando OBP-401 puede ser útil para la evaluación pronóstica.
Registro de prueba gratis Hospital Universitario de la Red de Información Médica en Japón, UMIN000002018.
Palabras clave
células tumorales circulantes cáncer gástrico Antecedentes La telomerasa
metástasis a distancia de un tumor sólido es un fuerte factor pronóstico [1-3]. La existencia de células tumorales circulantes (CTC) en la sangre periférica sugiere que un paciente está en una fase de enfermedad sistémica [4]. La identificación de las CTC en la sangre periférica es un enfoque útil para estimar el pronóstico, seguimiento de la progresión de la enfermedad, y medir los efectos del tratamiento en mama, próstata, piel, colon y cánceres gastrointestinales. Por lo tanto, se han desarrollado varios métodos para detectar las CTC, y a veces se usan en combinación. Las técnicas más comunes para el enriquecimiento y detección de CTC son la densidad de separación en gradiente [5], el enriquecimiento directo por filtración [6, 7], la separación inmunomagnética [8], la citometría de flujo [9], en tiempo real inversa-reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa (RT PCR) [10, 11], y microchip tecnología [12].
célula de enriquecimiento mediante la separación por gradiente de densidad se lleva a cabo utilizando kits comerciales tales como OncoQuick® (Greiner, Frickenhausen, Alemania) [13] y Lymphoprep® (Nycomed, Oslo , Noruega) [14]. Densidad separación por gradiente se basa en la teoría de que diferentes tipos de células se pueden separar según su densidad. Por lo tanto, es difícil extraer todos los CTC a causa de la migración celular. RT-PCR es uno de los métodos más comunes de detección de células tumorales debido a su alta sensibilidad y especificidad, en el supuesto de imprimación adecuada y diseño de la sonda. Sin embargo, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a su delicadeza técnica y alta sensibilidad [15, 16].
Enriquecimiento celular inmunomagnética, como la realizada por la CellSearch System® (Veridex, LLC, Raritan, NJ, EE.UU.) [ ,,,0],17], es actualmente la técnica más utilizada para enriquecer y detectar las CTC [18-21]. La ventaja de la separación celular inmunomagnética es que las CTC se pueden visualizar con un microscopio de fluorescencia. Las células detectados con anticuerpos contra marcadores epiteliales (moléculas de adhesión celular epitelial; EpCAMs) están decididos a ser los CTC. Por lo tanto, esta técnica puede proporcionar resultados falsos positivos en base a la expresión de marcadores epiteliales normales por las células no tumorales, y los resultados falsos negativos pueden surgir en base a la falta de expresión de marcador selectivo sobre las células tumorales. Como resultado de las limitaciones asociadas con los enfoques anteriores, se necesita una nueva técnica para detectar CTC viables con precisión.
Telomerasa juega un papel importante en la carcinogénesis, la invasión del cáncer y la metástasis [22-24]. Hemos desarrollado una técnica para explotar alta actividad de la telomerasa en las células. Esta técnica utiliza un agente de la telomerasa específico, la replicación selectiva modificada viral (OBP-401; TelomeScan®, Oncolys BioPharma, Tokio, Japón) en el que la transcriptasa (terc
) la telomerasa humana inversa promotor del gen se inserta en la región E1 , y el gen de proteína verde fluorescente (GFP) se coloca bajo el control del promotor de citomegalovirus en la región E3 como un marcador de la replicación viral [25]. Se ha informado de que OBP-401 se puede utilizar para detectar las CTC viables entre las células sanguíneas normales [26, 27].
Aquí, se aplicó el ensayo para detectar CTC viables con el potencial para la metástasis en pacientes con cáncer gástrico. Detectamos CTC positivas para GFP. Por el contrario, es posible que las células no cancerosas emiten fluorescencia de GFP después de la infección OBP-401 [28]. Por lo tanto, se seleccionaron células más grandes que un umbral determinado por la comparación entre los voluntarios sanos y pacientes, porque CTC son más grandes que las células de sangre normales [7, 29, 30]. . Se estudió la asociación del número de CTC-GFP positiva con la supervivencia y patológicos índices de progresión de la enfermedad
Métodos
pacientes y voluntarios sanos
Los pacientes incluidos en este estudio preliminar fueron los sometidos a tratamiento quirúrgico planeado; los pacientes que eran adecuados para la resección endoscópica de la mucosa o disección endoscópica de la submucosa fueron excluidos. Los criterios de inclusión fueron: (i) histológicamente probada adenocarcinoma del estómago mediante biopsia endoscópica; (Ii) tumor solitario clínica; (Iii) no antes de la resección endoscópica, la quimioterapia o la radioterapia; (Iv) la edad de 20-80 años; (V) el estado funcional del Eastern Cooperative Oncology Group [31] 0 ó 1; (Vi) suficiente la función del órgano; y (vii) el consentimiento informado por escrito. Los criterios de exclusión fueron los siguientes: (i) síncrono o malignidad metacrónico; (Ii) las mujeres embarazadas o lactantes; (Iii) la hepatitis viral activa o crónica; (Iv) bacteriana activa o infección por hongos; (V) la diabetes mellitus; (Vi) la administración sistémica de corticosteroides; y (vii) la hipertensión inestable. El estadio de la enfermedad en los pacientes que se caracteriza patológicamente usando la séptima edición de la clasificación TNM de la Unión Internacional contra el Cáncer [32]. La profundidad del tumor en tres pacientes sin gastrectomía y el estado de los ganglios linfáticos regionales de cinco pacientes sin suficiente linfadenectomía fueron diagnosticados quirúrgicamente. MyBestPlay Todos los pacientes atendidos en nuestro hospital con regularidad después de la cirugía, y se comprobaron cada 3 meses. Los pacientes también fueron sometidos a endoscopia y tomografía computarizada por lo menos una vez al año, en función de su estadio de la enfermedad y el curso.
También reclutaron voluntarios sanos para actuar como controles. Todos los voluntarios sanos eran empleados de Sysmex Corporation e incluyeron siete hombres (edad media de 31,4 años, rango 24-39 años) y tres mujeres (edad media de 33,7 años, rango 26-48 años). Todos los voluntarios fueron sometidos a exámenes médicos sobre el empleo y anualmente; chequeos médicos incluyen entrevistas, la auscultación, radiografías de tórax, y la sangre y análisis de orina. Por otra parte, hemos realizado entrevistas individuales antes de la recogida de muestras; cualquier voluntario que actualmente estaba recibiendo tratamiento médico, embarazada o amamantando, o que habían donado sangre en el último mes fue excluido.
Virus
OBP-401, un agente de adenovírico de replicación selectiva telomerasa-específica en la que el terc
elemento promotor impulsa la expresión de la EIA
y BEI
genes, y en el que el gen GFP está integrado, se utilizó en este estudio. La sensibilidad y la especificidad del ensayo utilizando OBP-401 se han estudiado previamente por Kim et al. [27]. La prueba se repitió cinco veces ponen a prueba en la muestra que incluye 1 células MDA-MB-468 (carcinoma de mama) y 7,5 ml de sangre, y el número de células GFP-positivas fueron: 1, 1, 1, 2 y 3; en la muestra que incluye 20 células MDA-MB-468 (carcinoma de mama), el número de células positivas para GFP fueron 15, 17, 19, 22 y 24. Las muestras virales se almacenaron a -80 ° C. Las líneas celulares y
cultura
la A549 (carcinoma de pulmón), HepG2 (carcinoma hepatocelular), líneas de células de HEC-1 (adenocarcinoma de endometrio), KATO-III (carcinoma gástrico), y SBC-3 (carcinoma de pulmón de células pequeñas) se obtuvieron de la Salud ciencia Banco de Recursos de Investigación (Osaka, Japón). El LNCaP (adenocarcinoma de próstata) y OVCAR-3 (carcinoma de ovario) líneas celulares se obtuvieron de la Banco de Células Riken (Tokio, Japón). Las células se cultivaron de acuerdo a las especificaciones del proveedor. MDA-MB-468 células se cultivaron como se describe anteriormente [27].
Preparación de la muestra y de la célula contando
una muestra de sangre vena periférica 7,5-ml se obtuvo de cada paciente antes de la cirugía y de cada voluntario. Las muestras fueron extraídas en tubos que contenían ácido cítrico, ácido fosfórico, y dextrosa, y se almacenaron a 4 ° C. El ensayo se inicia dentro de 48 h.
Las muestras se centrifugaron durante 5 min a 540 g y se eliminó la fase de plasma. Después, las células se lavaron cuatro veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y dos veces con medio Roswell Park Memorial Institute. Las muestras fueron infectados con 4 x 10 8 unidades formadoras de placas (UFP) de OBP 401-virus por incubación en el medio durante 24 horas a 37 ° C.
Después de la tinción de células muertas por el rojo fluorescente reactiva colorante L23102 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.), OBP-401 virus fueron inactivados y las células se fijaron con 2% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a temperatura ambiente.
Las muestras se trataron con una superficie activa agente (Emalgen 2025 G; Kao Chemicals, Tokio, Japón) durante 10 min a 40 ° C para degradar las células rojas de la sangre. Por último, se utilizó 7,5 ml de sangre para crear dos muestras portaobjetos de vidrio para el análisis microscópico. Se contaron todas las células positivas para GFP en las dos diapositivas, utilizando un microscopio de fluorescencia controlado por ordenador (IX71, Olympus, Tokio, Japón) y un examinador desconocía los detalles de la muestra. El tiempo total de ensayo fue de 27,5 h (Figura 1). Figura 1 Protocolo y el procedimiento de la "GFP-CTC Ensayo". Cada muestra de sangre vena periférica 7,5-ml se obtuvo de los pacientes antes de la cirugía y de los voluntarios. Las muestras fueron extraídas en tubos que contenían ácido cítrico, ácido fosfórico y dextrosa. Las muestras se centrifugaron y se eliminó la fase de plasma. Después del lavado de células usando PBS y medio Roswell Park Memorial Institute, las muestras fueron infectados con 4 x 108 PFU de virus OBP-401. virus OBP-401 fue inactivada y las células se fijaron con 2% de paraformaldehído (PFA). Las muestras se trataron con un agente de superficie activa para degradar las células rojas y blancas de la sangre. Dos muestras de diapositivas de vidrio de 7,5 ml de sangre se prepararon para el análisis microscópico. Todas las células positivas para GFP en las dos correderas se contaron usando un microscopio de fluorescencia controlado por ordenador.
Determinación del umbral de intensidad de la fluorescencia GFP
Se determinó el umbral para la intensidad de la fluorescencia de GFP de la siguiente manera. Aproximadamente 30.000 células cultivadas fueron añadidos en muestras de 7,5 ml de sangre de voluntarios sanos, que fueron sobrecargadas con diferentes líneas celulares de cáncer: A549, HepG2, HEC-1, Kato-III, SBC-3, LNCaP, MDA-MB-MB468 y OVCAR -3. Las muestras de sangre se sometieron a ensayo de detección de CTC, y a continuación, las células se contaron detectables por microscopía de fluorescencia. Más de 100 células se analizaron en cada muestra. Se determinó 2,85 × 10 7 significar fluorocromo equivalente a ser el umbral para la intensidad de la señal GFP desde el nivel mínimo de intensidad de GFP observado en la sangre las muestras cargadas con las líneas celulares (Figura 2). Los datos se presentan como el número de CTC positivas para GFP por 7,5 ml de muestra de sangre periférica. Figura 2 intensidades de señal GFP de varias líneas celulares de cáncer. La parte inferior y superior de la caja son los cuartiles inferiores y superiores, y la banda de la caja es la mediana. Las líneas en el extremo de los bigotes son mínimo y máximo. El eje y representa la intensidad de la señal de GFP en una escala logarítmica
Inmunoticción
marcado con ficoeritrina anticuerpo CD45 anti-humano (BioLegend, San Diego, CA, EE.UU.) se diluyó 1: 5. Y Pacific Blue-anti-humana marcada CD326 (EpCAM) anticuerpo (BioLegend) se diluyó 1:10 en PBS que contenía suero bovino fetal al 2%. Las células se incubaron con anticuerpos diluidos durante 30 minutos a 25 ° C. Después de lavar con PBS que contenía suero bovino fetal al 2%, las células se montaron en portaobjetos de vidrio y se analizaron usando un microscopio de fluorescencia. (IX71; Olympus) Análisis estadístico
análisis estadístico se realizó usando JMP Statistical Descubrimiento 9.0.2 (SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.). Para determinar el umbral de diámetro celular, los CTC GFP-positivas detectadas se analizaron mediante un receptor de funcionamiento característico (ROC) curva entre las muestras de pacientes con cáncer gástrico y los de los voluntarios. Para múltiples comparaciones de grupos, la homogeneidad de la varianza se evaluó mediante la prueba de Levene. Para las comparaciones paramétricas se utilizó el análisis de varianza y para las comparaciones no paramétricas se utilizó el test de Wilcoxon y las pruebas de Kruskal-Wallis. Utilizamos exacta de Fisher y la χ
2 pruebas con un 2 × 2 y 4 × una mesa 2, respectivamente, para comparar los caracteres clínico-patológicos en el grupo de pacientes. Se generaron curvas de Kaplan-Meier de supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global estimado, y se realizaron comparaciones entre los grupos mediante una prueba de log-rank de dos caras. P
valora ≤0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Francia El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Showa, Hospital Yokohama Norte. Nos explicó el protocolo de estudio a los pacientes y voluntarios antes de que se firmó el consentimiento informado. Este estudio se ha registrado en la Red de Información Médica del Hospital Universitario de Japón, el número 000002018.
: Resultados de la características de los participantes
Sesenta y cinco pacientes con adenocarcinoma gástrico (46 hombres y 19 mujeres, con una media de edad de 58,8 años, rango 33 -76 años) que se sometieron a cirugía en el Centro de Enfermedades Digestivas del hospital de la Universidad de Showa Norte Yokohama entre septiembre de 2009 y mayo de 2011 se incluyeron en este estudio. Veintinueve tenido gastrectomía distal, 32 tenían una gastrectomía total, y cuatro tenían una laparotomía exploratoria. características de los pacientes se resumen en la Tabla 1. Veintiocho de los 65 pacientes recibieron quimioterapia después de la cirugía. El grupo de control compuesto por 10 volunteers.Table 1 Características de los pacientes sanos y hallazgos patológicos
Parámetros
número de pacientes
Sexo Masculino

46
Mujer
19
Edad (media, gama)
58.8, 33-76
gastrectomía distal

29
total
32
Ninguno
4 de quirúrgica enfoque
Laparoscopia
54
laparotomía abierta página 11
Curabilidad
R0
57
R1 R2
0
página 8
TNM etapa I

40
II página 6
III
10
IV página 9
tumor profundidad de la invasión
T1
36
T2 T3
página 8 página 9
T4 página 12
metástasis ganglionar N0

39
N1 página 5
N2
6
N3
15
metástasis a distancia M0

56
M1 página 9 sobre Main tipo histológico †
diferenciada
25
indiferenciado
40
linfático invasión
LX
4 de L0
35
L1
26
invasión venosa
VX
4 de V0
35
V1-2
26
† bien o moderadamente diferenciado adenocarcinoma papilar y adenocarcinoma se clasificaron como de tipo diferenciado. El carcinoma de células en anillo de sello, el adenocarcinoma pobremente diferenciado y el adenocarcinoma mucinoso se clasificaron como de tipo indiferenciado. CTC
GFP-positivas en la sangre periférica
Utilizando un microscopio de fluorescencia, las células con las emisiones fluorescentes ≥2.85 × 10 7 medios equivalentes fluorocromo se contaron como células positivas para GFP
Varios tamaños de células GFP-positivas fueron observadas en cada muestra.; por lo tanto, era difícil de identificar una célula representativa entre las células positivas para GFP para la comparación entre los pacientes y voluntarios sanos. Por lo tanto, para evitar el uso de un valor arbitrario, decidimos utilizar el umbral óptimo derivada del análisis ROC basado en el tamaño de celda, es decir, 7,735 m, como el umbral para definir CTC positivas para GFP (Figura 3). Figura 3 Comparación de la célula de diámetro entre los pacientes y voluntarios. Para determinar el umbral, se compararon los diámetros de las células de pacientes con cáncer gástrico y controles mediante análisis de ROC. Hubo una diferencia significativa entre los pacientes con cáncer gástrico y los controles (p <
0.001; área bajo la curva = 0,57; 95% intervalo de confianza = 0,54-0,60)
por tinción inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo anti-EpCAM y. anticuerpos anti-CD45, que confirmaron que las CTC positivas para GFP fueron EpCAM-positivas y CD45-negativas (Figura 4). Figura 4 Ejemplos de imágenes microscópicas. Imágenes representativas de dos muestras de cáncer gástrico de CTC positivas para GFP y inmuno análisis de anticuerpos anti-células EpCAM- y anti-CD45-positivas. Las células se contaron usando un microscopio de fluorescencia controlado por ordenador por un examinador ciego al estado de la muestra. Barra de escala, 10 micras. Empresas El número de CTC positivas para GFP en las muestras de sangre periférica se muestran en la Figura 5. No hubo una diferencia significativa entre las tasas de detección de CTC positivas para GFP en las muestras que representan cada etapa del cáncer. Figura 5 Número de células positivas para GFP. Los puntos son el número de CTC positivas para GFP en las muestras de los pacientes. La parte inferior y superior del cuadro representan los cuartiles inferiores y superiores, y la banda a través de la caja muestra la mediana. Las barras superior e inferior en los extremos de los bigotes muestran el punto más bajo de datos dentro de los rangos de 1.5 intercuartil el cuartil más bajo, y el punto de datos más alto dentro de los rangos intercuartiles 1.5 del cuartil superior, respectivamente. Las barras verdes indican valor medio.
Asociación de CTC positivas para GFP con la supervivencia Francia El número medio de CTC positivas para GFP en las muestras procedentes de 10 voluntarios sanos fue de 4,8. Dividimos a los pacientes en dos grupos en función de la cantidad de CTC positivas para GFP: 0-4 y ≥5. Las características clínico-patológicas de los dos grupos se resumen en la Tabla 2. No hubo diferencias significativas entre los dos grupos, excepto que sólo había una categoría de 2 caracteres linfáticos metastasis.Table Clinicopathological de dos grupos de pacientes según el número de CTC
Número de CTC
a 0 - 4
5 ≤ P

valor
Número de sujetos
41

24
TNM: Etapa
0,1586
Etapa I
29 página 11
Etapa II página 4
2 Etapa III
4 página 6
Etapa IV
4 de 5
TNM: T categoría
0,2753
26
10
T2 T1
5 página 3
T3 página 5
4 de T4 página 5 página 7
TNM: N categoría
0,0257 *
N0
27
12
N1 página 5
0
N2 página 4
2 N3 página 5
10
TNM: la categoría M
0.2121
M0
37 página 19
M1
4 de 5
tipo histológico principal
0,6844 tipo diferenciado

15
10
el tipo indiferenciado
26 página 14
linfático invasión
0,3177
Lx página 2
2 L0
25
10
L1
14 página 12
invasión venosa
0,1293
Vx página 2
2 V0
26 página 9
V1-2 página 13
13
Cirugía
0,2124
resección curativa
38 página 19
no curativos de resección
1 página 3
Sin resección
2 2
la quimioterapia postoperatoria
0,1672
Presencia
15 página 13
Ausencia
26 página 11
* * diferencia significativa.
Figura 6a muestra el método de Kaplan -Meier curvas de supervivencia global en los dos grupos: los pacientes con 0-4 CTC y aquellos con ≥5. Hubo una diferencia significativa entre los dos grupos (p = 0,0021
). Además, en los pacientes con cáncer gástrico avanzado con enfermedad en estadio II-IV, hubo una diferencia significativa entre los dos grupos (p = 0,0126
) (Figura 6b). Figura 6 La supervivencia global. (A) La supervivencia global de los pacientes. (B) La supervivencia global de los pacientes con enfermedad en estadio II-IV. La supervivencia se comparó de acuerdo con el número de CTC mediante el análisis de Kaplan-Meier y las estadísticas de log-rank. ** P <
; 0,01, p * Hotel < 0.05.
Asociación de CTC positivas para GFP con índices patológicos
No hubo una relación significativa entre el número de CTC positivas para GFP y el estadio del cáncer (p = 0,2313
) (Figura 5). Aunque no se observó significación estadística, el número de CTC GFP-positivas tendía a aumentar con la progresión del tumor primario (p = 0,1521
) (Figura 7a). El número de CTC en las muestras de los pacientes con ganglios positivos fue mayor que en los pacientes con ganglios negativos (p = 0,1752
) (Figura 7b). En comparación con los pacientes sin metástasis distantes, aquellos con metástasis a distancia tenían un número similar de CTC positivas para GFP (p = 0,5655
) (Figura 7c). No había una diferencia significativa entre el tipo selectiva y no selectiva (p = 0,8387
) (Figura 7d). El número de CTC fueron similares en las muestras de pacientes con y sin invasión linfática (p = 0,2054
) (Figura 7e). Para invasión venosa, el número de CTC en las muestras de los pacientes con invasión fue significativamente mayor que en pacientes sin invasión (p = 0,0351
) (Figura 7f). Figura 7 Relación entre el número de CTC GFP-positivas en una muestra de sangre de 7,5 ml a partir de pacientes con cáncer gástrico y los hallazgos patológicos en los pacientes. Los puntos son el número de CTC positivas para GFP en las muestras de los pacientes. La parte inferior y superior del cuadro representan los cuartiles inferiores y superiores, y la banda a través de la caja muestra la mediana. Las barras superior e inferior en los extremos de los bigotes muestran el punto más bajo de datos dentro de los rangos de 1.5 intercuartil el cuartil más bajo, y el punto de datos más alto dentro de los rangos intercuartiles 1.5 del cuartil superior, respectivamente. a, tumor profundidad de invasión (T1-T4 indican aumento de la profundidad). b, linfático metástasis (N0 = negativo, N1-3 = positivo). c, la metástasis a distancia (M0 = negativo, M1 = positivo). d, el tipo histológico (tipo diferenciado y tipo indiferenciado). e, invasión linfática (L0 = negativo, L1 = positivo). f, invasión venosa (V0 = negativo, V1 = positivo), p * Hotel < 0.05. Aunque sólo la invasión venosa muestra una diferencia estadísticamente significativa, hubo algunas tendencias hacia un aumento en el número de CTC al aumentar la progresión de la enfermedad.
Discusión
Este documento informa de la correlación entre la CTC y el cáncer gástrico, que es la segunda causa principal de relacionadas con el cáncer muerte en el mundo. La utilidad de la detección de las CTC en el diagnóstico, la estimación de pronóstico, y la evaluación de los efectos del tratamiento ya se ha informado de mama [27, 33], de próstata [34], de pulmón [35] y el tracto digestivo [11, 36, 37 ] cánceres. Este estudio indica que también es útil para el cáncer gástrico.
Uno de los principales resultados de nuestro estudio fue una relación significativa entre el número de CTC y el pronóstico. A pesar de que se utilizó un período de seguimiento corto, el pronóstico de los pacientes que tenían ≥ 5 CTC en sus 7,5 ml muestras de sangre periférica era pobre. Los pacientes con enfermedad en estadio temprano generalmente tienen una menor tasa de recurrencia [38], y aquellos con enfermedad en estadio I en realidad no tenía recurrencia en nuestro estudio. También se calculó la tasa de supervivencia en pacientes con cáncer gástrico avanzado con enfermedad en estadio II-IV, y demostró que estos pacientes tenían un patrón de supervivencia similares a aquellos con enfermedad en estadio I-IV. Estos resultados sugieren que la quimioterapia preoperatoria o tratamiento integral es apropiado para los pacientes con enfermedad avanzada que tienen muchos CTC en muestras de pre-tratamiento debido a su mal pronóstico. Estar entre nuestros hallazgos patológicos sólo la invasión venosa tenía una relación significativa con el número de CTC. Esto sugiere acuerdo entre la patología y la tecnología tradicional molecular moderna. Creemos que la falta de una diferencia significativa entre el número de CTC detectadas por nuestro ensayo y los otros índices patológicos puede explicarse por cuestiones metodológicas tales como el tamaño pequeño de la muestra. Nuestra técnica funcionó bien como una herramienta de evaluación pronóstica - para proporcionar información acerca de la necesidad de terapia adyuvante postoperatoria - y puede proporcionar una herramienta auxiliar útil para la clasificación basada en la patología
No está claro si todas las CTC detectadas tienen un potencial metastásico.. Se detectaron CTC viables en las muestras de pacientes con cáncer en etapa temprana en el presente estudio, pero casi todos los pacientes del grupo de fase I sobrevivieron sin recurrencia [38]. Tenemos la intención de confirmar si las células cancerosas resistentes, como las células madre del cáncer, estaban presentes en las células GFP-positivas detectadas. Además, vamos a analizar las funciones de los CTC viables individualmente después de la clasificación de células, e identificar las CTC con potencial metastásico utilizando herramientas adicionales, tales como el análisis de la ploidía del ADN [39, 40]. Por otra parte, entre los perfiles de expresión génica CTC viables, células muertas, tumores primarios y metastásicos revelará información importante relacionada con los mecanismos de la metástasis del cáncer.
Nuestros resultados deben interpretarse con cierta cautela, teniendo en cuenta las limitaciones de este estudio. En primer lugar, el número de CTC varió ampliamente entre los individuos, incluidos los pacientes y voluntarios sanos. Además, no fue influenciado por la etapa del tumor o la presencia de metástasis clínicamente detectables. Del mismo modo, no hubo asociación entre la presencia de metástasis (ganglio linfático o distante) o la invasión y el número de CTC, que pone en cuestión el uso de CTC para predecir el potencial metastásico. Sin embargo, es posible que el tamaño de la muestra relativamente pequeña limita el potencial de detectar diferencias reales entre estos grupos de pacientes. Por último, hay que reconocer que nuestros resultados sólo son aplicables a preoperatoria, el cáncer gástrico no tratados previamente y no deben ser generalizados a otros tipos de cáncer.
Es evidente que más estudios en una población mayor de pacientes, y con diferentes tipos de cáncer , son necesarios para aclarar la aplicabilidad clínica de detección de CTC. Ahora estamos preparando un estudio para investigar los efectos del tratamiento del cáncer gástrico en el número de CTC, que debería contribuir a establecer su relación con la futura evolución de la enfermedad y si el recuento de CTC puede ayudar a elegir guidetherapy.
Conclusiones de
Hubo una diferencia significativa en la supervivencia entre los pacientes con 0-4 CTC y aquellos con ≥5. Sin embargo, no está claro si todas las CTC tienen verdadero potencial metastásico, y se necesitan más estudios.
Declaraciones
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada en parte por una subvención-en-Ayudas a la Investigación exploratoria Desafiante (23659308) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP). El organismo de financiación no desempeñó ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o la interpretación de los datos; en la redacción del manuscrito; o en la decisión de enviar el manuscrito para su publicación. Estamos muy agradecidos a todos los pacientes y voluntarios que donaron sangre para este estudio. Nos gustaría agradecer al profesor Toshiyoshi Fujiwara (Okayama University Graduate School of Medicine, Okayama, Japón) para proporcionar comentarios y sugerencias útiles; Sr. Yasuo Urata (Oncolys BioPharma, Tokio, Japón) para suministrar la OBP-401; Dr. Yukio Tsujino, Dr. Toshiyuki Ozawa y el Dr. Akinori Masago (Sysmex Corporation, Kobe, Japón) por su valioso apoyo; y el Dr. Rebecca Devon (Unidad de Genética y de la Universidad de Edimburgo, Edimburgo, Reino Unido) para su revisión crítica y edición del manuscrito. También estamos muy agradecidos al personal clínico.
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