PLoS ONE: asetus RKIP Function helikobakteeri Mahan Cancer

tiivistelmä

Helicobacter pylori (H. pylori) B on gram-negatiivinen, spiraalimainen bakteeri, joka tarttuu yli puolet maailman väestöstä ja on merkittävä syy mahalaukun adenokarsinoomaa. Mekanismit, jotka viittaavat H. pylori
tartunnan mahasyövän ei ymmärretä hyvin. Tässä tutkimuksessa raportoimme että Raf-kinaasin estäjä proteiini (RKIP) on rooli apoptoosin induktio H. pylori
mahalaukun epiteelisolujen. Western blot ja lusiferaasin transkriptiota toimittaja määrityksissä osoittavat, että patogeenisuus saari H. pylori
nopeasti fosforyloi RKIP, joka sitten paikantuu tumaan, jossa se aktivoi omaa transkription ja indusoi apoptoosia. Pakko yliekspressio RKIP parantaa apoptoosin H. pylori
infektoiduista soluissa, kun taas RKIP RNA inhibition tukahduttaa apoptoosin induktio H. pylori
infektio. Kun indusoiva fosforylaatio RKIP, H. pylori
samanaikaisesti kohdistuu ei-fosforyloitua RKIP varten proteasomin välittämän hajoamisen. Kasvu RKIP transkription ja fosforylaatio kumotaan muta- RKIP seriini 153 valimiin, mikä osoittaa, että sääntely RKIP aktiivisuuden H. pylori
riippuu RKIP n S153 jäämiä. Lisäksi H. pylori
infektio lisää ekspressiota Snail, transkriptionaalisen repressori RKIP. Tuloksemme viittaavat siihen, että H. pylori
hyödyntää tuumorisuppressoriproteiinia, RKIP, edistää apoptoosin mahasyövässä soluissa.

Citation: Moen EL, Wen S, Anwar T, Cross-Knorr S, Brilliant K, Birnbaum F, et ai . (2012) asetus RKIP toiminnon tietoihin helikobakteeri
mahasyövän. PLoS ONE 7 (5): e37819. doi: 10,1371 /journal.pone.0037819

Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 joulukuu 2011; Hyväksytty: 24 huhtikuu 2012; Julkaistu: May 25, 2012

Copyright: © 2012 Moen ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institute of General Medical Sciences of National Institutes of Health alle Award Number P20GM103421 (DC); Edellisen lohkon tämän hankkeen tukivat National Center for Research Resources (NCRR) alle P20 RR 017695 (DC), R01 CA111533 (SFM) ja R21 CA133601 (JMS). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi useimmin diagnosoitu maligniteetti maailmassa. Vuonna 2007 noin miljoona uutta mahasyövän tapaukset johtavat noin 800000 kuolemantapausta maailmanlaajuisesti rekisteröitiin, mikä tekee siitä toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään [1]. Mahalaukun syöpä on tällä hetkellä seitsemäs johtava syy syöpäkuolemista Yhdysvalloissa, noin 21500 uutta tapausta diagnosoitiin vuonna 2011 (http://www.cancer.gov/cancertopics/types/stomach). Gram-negatiivinen, kierre muotoinen bakteeri Helicobacter pylori (H. pylori) B tarttuu yli puolet maailman väestöstä ja on todettu olevan merkittävä riskitekijä mahasyövän [2]. Maailman terveysjärjestön ja International Agency for Research Cancer nimennyt luokkana karsinogeeniksi vuonna 1994 [3]. Nykyinen käsitys H. pylori
indusoimaan syövän synnyn on, että bakteeri ja siihen liittyvä krooninen tulehdusreaktio edistää mahalaukun epiteelisolujen apoptoosikuoleman [4], jossa myöhemmät hyper-leviämisen [5], ja vapaiden radikaalien tuotantoa [6], jotka kaikki osaltaan hidas ja asteittainen sekvenssi muutoksia mahalaukun limakalvon että suosimiseen etenemistä kohti syöpä. Tämä malli on yhdenmukainen raportteja, että pro-inflammatorinen sytokiini geenin polymorfismit, että lisääntyä tulehdusvasteen liittyvät lisääntynyt mahalaukun syövän riskin [7].

H. pylori
tiiviisti kiinni mahalaukun epiteelisolujen ja voi aiheuttaa apoptoosin suoraan [8]. CAG (sytotoksinen liittyvä geeni) patogeenisyyssaarekkeen (CAG PAI) on H. pylori
on 40 kB DNA-segmentti, joka sisältää geenit, jotka koodaavat osia tyypin IV bakteeri- eritystä järjestelmän [9]. Tällä alueella on CagA
-geeni, joka koodaa CagA, immuunidominantin proteiini 121-145 kDa: n [9]. H. pylori
kannat joilla ja ilmentävät CAG PAI useammin liittyy ulkustauti ja mahasyövän Länsi populaatioissa kuin kannat, jotka eivät [9]. Tultuaan injektio kautta tyypin IV eritys järjestelmän isännän mahalaukun epiteelisolujen CagA voi myöhemmin tulla fosforyloituu Src-perheen tyrosiini- kinaasien sen C-päähän [10], joka johtaa CagA sitoa ja aktivoida SHP2 ja signaali kautta ERK [11]. Tärkeää on, CagA vastaa myös aktivoimalla signaalin muuntimen ja aktivaattori transkription 3 (STST3) in vitro
ja in vivo
[12], vaikka tämä ei välttämättä ole riippuvainen CagA fosforylaatio [11].

STAT proteiinit konstitutiivisesti useissa kasvaimet, mukaan lukien maha-, rinta-, pään ja kaulan, ja eturauhasen syöpiä [13] - [16]. Kun fosforylaation tyrosiinin 705 jäännökseen ja asetylointi lysiini 685, STAT3 dimerisoituu ja siirtyy tumaan, jossa se toimii transkriptionaalisesti säätelevät suuri joukko geenejä [17], [18]. Konstitutiivisen aktivaation STAT3-proteiinin on osoitettu estävän apoptoosia ja lisätä solujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden useissa syövissä, mukaan lukien mahasyöpä [19], [20].

Yksi tunnusmerkkejä mahalaukun syövän etenemiseen on hankitaan enemmän invasiivisia ja muuttavien fenotyyppien aikana epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Aikana EMT, mahalaukun epiteelisolujen läpi fenotyyppisiä muutoksia tunnettu menetys solun adheesiomolekyylien, erityisesti epiteelin kadheriinin (E-kadheriinin) [21]. Transkriptiotekijä Snail, sinkki sormen proteiinia, on luonnehdittu aikaisemmin tärkeänä säätelijänä EMT koska sen aktivoinnin Nuclear Factor kappa Beta (NF-kB) [22] ja myöhemmin tukahduttaminen E-kadheriinin in epiteelikasvainsolut [ ,,,0],23], [24]. Lisäksi tutkitaan käyttämällä voitto-of-function ja menettämisestä toiminnon lähestymistavat ovat tunnistaneet Snail kuin repressorina RKIP transkription metastaattisessa eturauhassyövän solut [25].

RKIP on jäsenenä fosfatidyylietanoliamiini sitovan proteiinin perhe ja negatiivinen säätelijä ERK1 /2 (Solunulkoisilla Signal säätelemät Kinase) [26], NF-kB [27] ja GRK (G-proteiiniin reseptorikinaasia) [28] reittejä. RKIP mikä on tärkeä rooli säätelyssä solujen eloonjäämistä ja apoptoosin lisäksi voimistavan tehoa kemoterapeuttisten aineiden [29]. RKIP on myös todettu olevan etäpesäke soriproteiini [30] ja mahalaukun adenokarsinooman potilailla on olemassa positiivinen korrelaatio RKIP ilmaisun ja potilaan selviytymisen ja käänteinen korrelaatio ilmaus RKIP ja STAT3 [19]. RKIP ilmentymistä ja toimintaa voidaan säädellä translaation jälkeiset modifikaatiot. Esimerkiksi fosforylaation RKIP proteiinikinaasi C: seriini-153 estää RKIP: n kykyä sitoutua sen kohdemolekyyliin, jolloin inaktivoivat RKIP toiminto [31]. Edelleen, RKIP repression kautta promoottorin metylaation voidaan voittaa metylaation ja histonideasetylaasi-inhibiittorit [25].

Koska tärkeitä rooleja RKIP, STAT3 ja H. pylori
patogeneesissä mahalaukun syövän, me tutkimme, H. pylori
signaaleja RKIP. Meidän tutkimukset viittaavat siihen, että monimutkainen vuorovaikutus H. pylori: n cagPAI
, RKIP, STAT3 ja Snail toimii dysregulate mahalaukun epiteelisolujen apoptoosia moduloimalla RKIP toiminto, mekanismi, joka määrittelee keskeinen rooli RKIP in H. pylori
-associated mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Kaikki reagenssit ja kemikaalit hankittiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), jollei toisin mainita. MG-132 ostettiin Calbiochemiltä (Gibbstown, NJ) liuotettiin DMSO: hon ja käytettiin pitoisuutena 10 mM. Interleukiini-6 (IL-6) hankittiin BD Biosciences (San Diego, CA). Proteiini kvantifiointi reagenssit saatiin Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Parannettu kemiluminesenssin reagenssit ja toisen hiiren ja kanin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua Western blot -analyysiin olivat GE Healthcare (Piscataway, NJ). Aktiini-HRP, fosforyloidun-RKIP (pRKIP) ja STAT3 vasta ostettiin Santa Cruz Biothechnology (Santa Cruz, CA). Vasta-aineet STST3 pS727 ja pY705 ja PARP ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA) ja vasta-aineen RKIP Milliporesta, Billerica, MA. Vasta-aine on Snail ostettiin Abcam (Cambridge, MA).

Solut ja Plasmidit

Ihmisen mahan masolulinjassa AGS (CRL-1739) hankittiin American Type Culture Collection (Manasas , VA). MKN28 solut lahjoitti Dr. Richard Peek, Vanderbilt University, Nashville, TN ja alun perin ostettu riken Cell Bank, Ibaraki, Japani. Ekspressioplasmidit varten pcDNA3, c-myc STAT3, CMV-HA-RKIP (HA-RKIP) ja CMV-HA tyhjän vektorin (EV) on kuvattu [18], [26]. RKIP S153V plasmidi saatiin tohtori Marsha Rosner, University of Chicago, Chicago, IL.

H. pylori
Kannat ja viljelyolosuhteet

Villityypin H. pylori
kantoja tai isogeenisiin H. pylori
mutantit olivat viljeltiin yhdessä AGS tai MKN mahalaukun solulinjoja kuten aiemmin on kuvattu [32] on infektiokertoimella (MOI) 100:1 kaikissa kokeessa, ellei toisin mainita.

transfektio AGS solut

AGS-soluja transfektoitiin ohimenevästi käyttäen GenJet plasmiditransfektiolla reagenssia (Signagen Laboratories, Gaithersburg, MD) mukaan valmistajan protokollaa 6-kuoppalevyformaatissa. Kokonais-DNA määriä välillä 1 ja 2 ug transfektoitiin per näyte. Transfektio olosuhteissa arvioitiin ja optimoidaan analyysin transfektoitujen solujen vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) ilmentävä RKIP plasmidi. Transfektiotehot olivat johdonmukaisesti alueella 75-85%.

Protein Extraction ja Western blot -analyysi

Yhteensä solu-uutteiden ja subsellulaariset Fraktioinnit valmistettiin ja immunoblotattiin kuten aikaisemmin on kuvattu [29], [32 ]. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä BCA Protein Assay (Thermo Scientific). Densitometria Western blotit suoritettiin protokollan lueteltu seuraavassa osoitteessa: http://lukemiller.org/journal/2007/.

Realtime PCR

Kaksi ug RNA muutettiin cDNA käyttäen RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttämällä 2 x QIAgen QuantiFast SYBR Green I (Roche). Alukkeet Snail olivat eteenpäin: AGCTCTCTGAGGCCAAGGATCT, käänteinen: TGTGGCTTCGGATGTGCAT ja beeta-aktiini: eteenpäin: CTGGCACCACACCTTCTACAA, käänteinen: CAGCCTGGATAGCAACGTACA. Seuraavat tyypilliset profiili käytetyt ajat olivat 40 sykliä: ensimmäinen vaihe 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 95 ° C 15 s ja 60 ° C 1 min. Suhteellinen ilmentymistaso laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCT menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [33].

STAT3 ja RKIP Luciferase Reporter määritykset

Soluja (2 x 10 ^{5 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä) transfektoitiin ohimenevästi 0,1 ug (STAT3, RKIP) tai 0,05 ug (NF-kB) reportterigeenin sisältävän plasmidin joko STAT3 sitovan SIE-fragmentti promoottorialueen hiiren IRF1 geenin (p2xSIE-Luc) tai RKIP promoottorialueen sekä osoitettujen plasmidien kuten aikaisemmin on kuvattu [18]. Noin 24 tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin ilmoitetun lääkkeen tai tartunnan H. pylori
yön yli tai ne jätetään hoitamatta. Lusiferaasin aktiivisuus sytosolisessa supernatantti arvioitiin käyttäen Luciferase Reporter Assay (Promega) ja mitattiin käyttämällä luminometriä arvioida transkriptionaalista aktiivisuutta [18].}

Apoptosis määritykset

Apoptoosi kvantifioitiin erillisissä määrityksissä virtaussytometrillä ja DNA: n fragmentoituminen ELISA. Virtaussytometriaa, prosenttiosuus apoptoottisten solujen (ala-G _{O) määritettiin virtaussytometria-analyysi propidiumjodidilla värjättyjen solujen [29]. Sytoplasmisen histoni liittyvä DNA pirstoutuminen mitattiin Cell Death Detection ELISA Plus Kit (Roche, Indianapolis, IN) mukaan valmistajan ohjeiden.}

sytoplasmisen histoni liittyvä DNA pirstoutuminen mitattiin Cell Death Detection ELISA Plus kit (Roche, Indianapolis, IN) mukaan valmistajan ohjeiden. Kokeet toistettiin 3 kertaa ja suoritettiin kaksinkertaisina.

lentivirustartunnat välittämää knockdovvn RKIP

lentivirustartunnat rakentaa.

pLKO.1 puro-vastus lentiviraalinen rakentaa RHS3979-97070798 ja RHS3979-98492779 ostettiin Open Biosystems (Huntsville, AL). Konstruktit sisälsi puromysiiniä selektiomarkkerin ja kasvatettiin Luria-liemessä, joka sisälsi ampisilliinia 37 ° C: ssa. Liemi sentrifugoitiin 10000 x g
10 min. ja supernatantti heitettiin pois. DNA pellettien puhdistettiin käyttämällä QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit.

Lentivirus tuotantoa.

293T pakkaus solut ympättiin matalan antibioottia kasvualustaa (DMEM, 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 0,1 × penisilliini /Strepomycin /glutamiinia). Soluja inkuboitiin 24 tuntia (37 ° C, 5% CO _{2), tai kunnes ne olivat noin -70% konfluentteja. Tiedotusvälineille 293T pakkaus solut korvattiin korkea kasvualustaa sisältävän DMEM. Seosta, jossa transfektion plasmideja valmistettiin seuraavasti: pakkaus plasmidi (ΔVpr.89), kirjekuori plasmidi (VSV-G), hiusneula-pLKO.1 ja tyhjän vektorin.}

Fugene-transfektioreagenssia valmistettiin DMEM mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaan. Lyhyesti, 3 plasmidit lisättiin tipoittain Fugene ja DMEM ja sekoitetaan. Seoksen annettiin sitten inkuboitua 20-30 minuuttia. huoneen lämpötilassa. Transfektion Sitten seos lisättiin varovasti pakkaukseen soluihin. Soluja inkuboitiin noin 18 tuntia. Transfektioaine jälkeen hävittää seuraavana aamuna ja korvataan korkea-kasvualustaa. Soluja inkuboitiin 24 tuntia. Lentivirukselle sisältävä media kerättiin containingand ylimääräisiä korkean kasvualustojen lisätty. Soluja inkuboitiin 24 tuntia ja median talteen. Tyypillinen oli 2-3 ajankohtina. Kaikki virus satoa yhdistettiin.

Lentivirus infektio AGS soluja.

AGS-soluja kasvatettiin noin 50% konfluenssiin. Viruksen Supernatantit lisättiin polybreenillä. Kaksitoista tuntia infektion jälkeen, viruksen kasvatusliuos poistetaan ja korvataan viruksen median ja inkuboitiin vielä 12 tuntia. Media heitettiin pois ja korvattiin Hamin F12 -alustassa. Soluja inkuboitiin 24 tuntia. Solut jaettiin valinta väliaineessa, joka sisältää puromysiiniä ja annettiin inkuboitua 24 tunnin ajan.

tilastolliset menetelmät

Kaikki soluviljelmässä kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa, ellei toisin ole mainittu, ja pariksi t- testejä käytettiin määrittämään tilastollista merkittävyyttä.

tulokset

H. pylori
Infektio Lisäykset fosforylaatio RKIP

RKIP estää useiden solujen eloonjäämisreittejä, myös välittyvät NF-kB ja Jak /STAT [22]. Valaista vaikutuksen H. pylori
tartunnan RKIP mahalaukun soluissa, AGS solut infektoitiin H. pylori
ja korjattu 2 ja 6 tunnin kuluttua. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, tasot fosforyloitua RKIP (pRKIP) olivat koholla kuluttua 2 h (3,126-kertainen) ja 6 h (2,9-kertainen) jälkeen H. pylori
infektio taas yhteensä RKIP proteiinin ilmentyminen kasvoi 1,4-kertaiseksi kuluttua 2 h ja 1,75-kertainen kuluttua 6 h H. pylori
infektio. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös MKN mahalaukun syövän soluja (katso kuvio S1).

H. pylori
aiheuttama fosforylaatio RKIP on PKC-riippuvainen

fosforylaatio RKIP seriinin 153 proteiinikinaasi C (PKC) kumoaa sen kykyä sitoutua Raf ja estää loppupään MAP-kinaasin signalointi [31]. Tutkimme, onko fosforylaatiota RKIP mukaan H. pylori
oli PKC-riippuvainen. AGS solut infektoitiin H. pylori
6 tuntia, kun läsnä on tai ei ole 40 uM Bisindolylmaleimide (Bis, PKC-inhibiittori). Tuloksemme osoittavat, että tasot fosforyloitua RKIP estyi 3,9-kertaiseksi ja RKIP 1,36-kertaiseksi, kun H. pylori
infektion läsnä ollessa PKC-inhibiittorin, viittaa siihen, että RKIP fosforylaation H. pylori
kuuluu, mutta ei voi olla täysin riippuvainen, PKC säädelty reitin (Fig. 1 B).

IL-6 indusoi fosforylaatio RKIP ja H. pylori
aktivoi STST3

Koska on olemassa käänteinen suhde RKIP ja STST3 ilmaisun mahasyövässä yksilöt [19], arvioimme onko STST3 ja sen avainsäätelijä IL-6 [17] vaikuttaa pRKIP ilme. IL-6 hoito annoksella 25 tai 50 ng /ml kohonneeseen pRKIP proteiinia 1,8 ja 1,35 kertaiseksi ja yhteensä RKIP proteiinin ilmentyminen väheni 0,8 ja lisääntynyt 1,05 kertaiseksi (Fig. 2A). Fosforylaatio RKIP vastauksena IL-6 oli PKC-riippuvainen (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tiedot osoittavat, että IL-6 voi myös aiheuttaa fosforylaatio RKIP mahalaukun soluissa, joita voi esiintyä, osittain PKC-riippuvaisen reitin kautta.

Makrofagit julkaisu sytokiinien, mukaan lukien IL-6 aikana H. pylori
infektion [34], joka johtaa STAT3 aktivointi [17]. Tutkia vaikutukset H. pylori
tartunnan aktivointi STAT3, AGS solut transfektoitiin ohimenevästi IRF-1 reportterikonstruktista [18] ja viljeltiin yhdessä H. pylori
osoitetussa alueella infektiokertoimella (MOI) 24 tuntia. Tuloksemme osoittivat, että MOI välillä 10-200:1, H. pylori
kykeni indusoimaan STAT3 transkription (Fig. 2C) ja STAT3 pY705 fosforylaatiota (Fig. 2B) alle 6 h infektion. Me seuraavaksi ratkaistava, onko IL-6 voi myös stimuloida STST3 transkription AGS soluissa. AGS-soluja transfektoitiin ohimenevästi IRF-1 ja EV ja tai c-myc-merkitty STAT3 ja sitten 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin joko IL-6 (50 ng /ml) tai viljeltiin yhdessä H. pylori
at MOI 100:1. Tulokset, esitetty kuviossa. 2D, osoittavat, että IL-6 (p < 0,0003) ja H. pylori
(p < 0,0005) olivat kaikki pystyvät merkittävästi stimuloida STAT3 transkriptio, vaikutus, joka on parantunut, kun AGS transfektoitiin STST3 ja tartunnan H. pylori
(p < 0,0000023). Tehostaminen STAT3 aktivointi kasvoi merkittävästi, kun AGS-soluja yhdessä käsiteltiin IL-6 ja H. pylori
verrattuna hoitoon IL-6 (p < 0,000028) tai H. pylori
(p < 0,0003) yksin.

Fosfory- RKIP indusoivan omaa transkriptio

Käytimme RKIP lusiferaasireportterista määritys tutkia vaikutukset H. pylori
tartunnan RKIP transkriptioaktiivisuuden. H. pylori
huomattavasti RKIP transkriptio (p < 0,002), jolla on suurempi kuin 10-kertainen lisäys ilmennyt RKIP yli-ilmentymisen ja yli 16-kertainen lisäys yhdistelmällä H. pylori
ja RKIP (p < 0,0003) (Fig. 3A), kun verrattiin käsittelemättömiin AGS soluihin transfektoitu tyhjällä vektorilla. Siellä kasvoi merkittävästi (p < 0,0001) in RKIP transkriptio kanssa H. pylori
infektio ja RKIP yli-ilmentyminen verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu RKIP ilman infektiota (Fig. 3A). Olemme toistettiin nämä kokeet, kun läsnä on bis inhiboida PKC-aktiivisuuden määrittämiseksi kasvuun RKIP transkription johtui fosforylaation. Kun läsnä on PKC-inhibiittorin, H. pylori
lisääntynyt RKIP transkriptio ja RKIP yli-ilmentyminen johti myös parantamiseksi RKIP promoottorin aktiivisuutta. Bis vähentynyt RKIP transkriptio aiheuttama RKIP yli-ilmentymisen ja H. pylori
infektio suurempi kuin 4-kertainen, verrattuna soluihin, joilla RKIP yliekspressioon ja viittaa siihen, että nämä vaikutukset olivat riippuvaisia ​​RKIP fosforylaatiota (Fig. 3A). Tutkimme lokalisointi RKIP jälkeen H. pylori
infektio. Immunoblottauksella subsellulaariset AGS solujen fraktiot osoittivat, että pRKIP on tumassa, kun taas RKIP pysyy pääasiassa sytosoliin infektion jälkeen, (Fig. 3B). Yhdessä nämä tiedot merkitsevät sitä, että H. pylori
voi edistää translokaatiota pRKIP tumaan, jossa se voi aktivoida RKIP transkription.

H. pylori
indusoimaan RKIP fosforylaatiomääritys Riippuu H. pylori: n CAG
patogeenisuussaareke ja RKIP Serine 153

arvioimiseksi erityistoimien roolia H. pylori
tekijöitä fosforylaatioon RKIP, villityypin H. pylori
ja isogeenisistä mutantit puuttuu koko CAG PAI tai
oipA
geeni oli viljeltiin yhdessä AGS solujen 6 tuntia. H. pylori
mutantti, josta puuttuu CAG PAI
kyennyt indusoimaan RKIP fosforylaation, kun taas villin tyypin tahra ja oipA
mutantti voimakkaasti indusoi RKIP fosforylaatiota (kuvio. 4A). Sama suuntaus havaittiin STST3 pY705. Nämä tulokset viittaavat siihen, että geenien H. pylori n
cagPAI tarvitaan induktioon RKIP ja STAT3 fosforylaatiota.

tutkimiseksi jos mutaatio seriinin 153 vaikuttaa H. pylori
-välitteisen RKIP fosforylaation ja transkriptionaalista aktivaatiota, AGS-soluja transfektoitiin ohimenevästi kanssa RKIP rakentaa, jossa seriini on substituoitu valiinilla asemassa 153 (S153V), ja sitten viljeltiin yhdessä H. pylori
. Jälleen kerran havaitsimme suuremman sitten 16-kertaiseen kasvuun RKIP promoottorin aktiivisuutta solujen RKIP yli-ilmentymisen ja H. pylori
infektio (p < 0,0005). Kuitenkin, soluissa, jotka on transfektoitu RKIP S153V ennen H. pylori
infektio, oli 2,5-kertainen väheneminen transkriptionaalista aktiivisuutta (p < 0,0003) verrattuna H. pylori
infektion villityypin RKIP yliekspressoivat soluja (Fig. 4C). Lisäksi, yliekspressio S153V RKIP inhiboi H. pylori
-välitteisen RKIP fosforylaatiota (Fig. 4B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että fosforylaation ja transkription aktivaatio RKIP on riippuvainen H. pylori: n
cagPAI vaan myös muista fosforylaation RKIP klo S153.

H. pylori
Infektio Tulokset RKIP Hajoaminen ja induktio Snail

Koska lisääntynyt RKIP transkriptio indusoitiin H. pylori
infektio ei liittynyt lisääntynyt vakaassa tilassa yhteensä RKIP proteiinin ilmentyminen, me tutki H. pylori
voisi samanaikaisesti lisätä hajoaminen RKIP proteiinin kautta proteasomin välittämän hajoamisen, kuten aiemmin ehdottanut [35]. MG132 lisääntynyt RKIP proteiinin tasojen läsnä ollessa tai poissa ollessa H. pylori
infektio, sopusoinnussa H. pylori
kasvava proteasomaalisten RKIP hajoamista (Fig. 5A).

Toinen mekanismi, joka voisi selittää puute muutoksen RKIP proteiinin tai mRNA: n ilmentymisen olisi transkription tukahduttamisesta RKIP jälkeen H. pylori
infektio. Snail on transkriptiotekijä, jolla on tärkeä rooli EMT [23] ja se on myös tunnettu transkription repressori RKIP eturauhassyöpäsoluissa [25]. Tutkia vaikutukset H. pylori
tartunnan ilmaus Snail ja RKIP, AGS soluja viljeltiin yhdessä H. pylori
MOI 100. Snail-mRNA indusoituu voimakkaasti jälkeen 2-4 h infektion (Fig. 5D) Western blot-analyysi osoitti, että H. pylori
infektio johti ajasta ja annoksesta riippuva nousu Snail-proteiinin tasot (kuvio. 5B /C). Tämä tulos ei vastaa meidän tiedot RKIP transkriptio jälkeen H. pylori
infektio (Fig. 3) ja viittaa siihen, että H. pylori
infektio voi induktioon proteiini (t), joka kumoaa vaikutuksen Snail on RKIP transkriptio. Tutkimme parhaillaan tätä mahdollisuutta massaspektrometrilla analyysin avulla vanhempien ja RKIP pudotus soluja (Fig. 6).

RKIP Parantaa H. pylori
-välitteisen Apoptosis

H. pylori
indusoi mahalaukun epiteelisolujen apoptoosia [8]. Koska RKIP voivat edistää apoptoosia [29], tutkimme mikäli induktion pRKIP jälkeen H. pylori
infektio, voi olla vastuussa H. pylori
-indusoitua apoptoosia. AGS-soluja transfektoitiin ohimenevästi RKIP tai tyhjällä vektorilla, infektoidaan H. pylori
16 tuntia ja apoptoosi arvioitiin kautta PARP pilkkominen virtaussytometrialla ja DNA: n fragmentoituminen. Joissakin kokeissa RKIP estyi lentivirus-välitteisen RKIP pudotus. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, H
. pylori
indusoi pilkkomisen PARP, vaikutus, joka lisäsi ektooppinen ilmentyminen RKIP. Virtaussytometria analyysi osoitti, että H. pylori
infektio johti noin 4-kertainen nousu apoptoosin (p < 0,0008), RKIP yliekspressio, 3-kertainen nousu (p < 0,003) ja yhdistelmä 6-kertaiseen kasvuun (p < 0,0005) verrattuna käsittelemättömät AGS-solut (Fig. 6B). ELISA-pohjainen DNA-fragmentaation määrityksellä, apoptoottinen aktiivisuus lisääntyi: 2,5-kertaisesti (p < 0,000063) infektoiduissa soluissa H. pylori
; 1,8-kertainen (p < 0,006) soluissa ohimenevästi transfektoitu RKIP; ja 3,5-kertainen (p < 0,0007) yhdistelmään (Fig. 6C). Sen määrittämiseksi, ovatko RKIP oli vastuussa H. pylori
-välitteisen apoptoosin, me tukahdutetaan RKIP ilmaisu käyttäen lentivirusta-välitteistä RNA: n inhibition, ja havaittiin väheneminen RKIP proteiinin tasoja Western blot-analyysi osoittaa vähentäminen RKIP käsittelemättömissä ja H. pylori-tartunnan AGS solut (Fig. 6D). Meidän DNA pirstoutuminen analyysissä vanhempien AGS soluissa H. pylori
infektio johti 2-kertainen (p < 0,0007) apoptoosin (Fig. 6E). Vuonna RKIP pudotus AGS soluja, H. pylori
infektio johti 1,5-kertaiseen kasvuun apoptoosin (p < 0,003) (Kuva. 6E). Väheneminen apoptoosin emo ja RKIP pudotus AGS soluja oli tilastollisesti merkitsevä (p < 0,0006). Nämä tulokset osoittavat, että RKIP on tarpeen H. pylori
-välitteisen apoptoosin.

Keskustelu

Krooninen gastriitti ja muuttunut solujen liikevaihdon aiheuttama H. pylori
infektio edistää distaalisen mahalaukun adenokarsinooman [36]. H. pylori
voi säädellä mahalaukun epiteelin apoptoosia useita mekanismeja. Esimerkiksi infektion jälkeen ja sitoutuminen mahalaukun epiteelisolujen CAG eritystä palvelee muuttaa solunsisäisen signaalitransduktion johtaa NF-kB. NF-kB voi siirtyy tumaan aktivoimaan transkription pro-apoptoottisten geenien [37]. H. pylori
voi myös indusoida apoptoosia lisäämällä ilmentymistä FAS ja sen ligandi (FasL) johtaa aktivoinnin ulkoista apoptoosireittiä [38]. Paradoksaalisesti H. pylori
voivat myös aktivoida polkuja, jotka downregulate apoptoosin [39], varsinkin myöhäisessä vaiheessa kroonisen infektion [40]. Tämä sopeutumisreaktio epiteelisolujen vastustaa apoptoosin kroonisessa H. pylori
infektio voi myötävaikuttaa H. pylori
indusoimaan mahasyövän [41]. Apoptoottisen vasteen mahalaukun epiteelisolujen H. pylori
riippuu myös kannan suhteen spesifisiä virulenssitekijöitä. Esimerkiksi infektio CAG PAI-positiiviset kannat voivat aiheuttaa apoptoosin nopeammin kuin CAG PAI-negatiivisia kantoja [42]. H. pylori vaca
geenituote stimuloi luontainen apoptoottista johtava väylä mitokondrioiden vapautumisen sytokromi c: n ja kaspaasi-3-aktivaation [43]. VacA indusoiman apoptoosin liittyy väheneminen STAT3 johtaa downregulation Bcl-2 ja Bcl-X _{L [43]. Toisessa tutkimuksessa osoitettiin, että H. pylori
indusoi apoptoosin polku johon peräkkäinen induktion apikaalisella kaspaasin 8 toimintaa, pro-apoptoottisten proteiinien Bad ja Bid, kaspaasi-9 toimintaa, ja efektori kaspaasi-3: n aktiivisuuden [44].}

Tutkimuksemme kuvailee toinen mekanismi, jolla H. pylori
infektio voi edistää apoptoosin mahasyövässä soluissa, erityisesti edistämällä RKIP fosforylaatio. Kyky RKIP estää Raf /MAPK signaloinnin [26], [27] ja edistää apoptoosia on hyvin dokumentoitu [29]. Vuorovaikutus opinnäytetöiden reittejä ja RKIP ekspressiotasot on liitetty monia vaiheita kasvaimen muodostumisen ja /tai etenemistä [30]. Lisäksi yliekspressio RKIP tuloksia etäispesäkkeiden inhiboimiseksi ja invasiivisuus eri tuumorimalleissa [45] - [48]. Taustalla mekanismi ero ilmentymisen pRKIP ja RKIP ei ole tiedossa. Odotimme, että suhteellisesti korkeampi pRKIP infektion jälkeen saattaa korreloivat pienempi RKIP tasoilla. Olemme kuitenkin havainneet, että H. pylori
infektio johti hajoamiseen RKIP proteiinin, mahdollisesti mahdollistaa MAPK signalointi ja apoptoosin induktio mahasyövän jälkeen H. pylori
infektio. PKC-välitteisen RKIP fosforylaation voivat häiritä kykyä RKIP sitoutua Raf ja estää MAPK signalointi [31] on kuitenkin ei ole aiemmin mitään raportteja roolista pRKIP säätelyssä apoptoosin. Aikaisemmat tutkimukset meidän laboratorio on osoittanut, että RKIP yli-ilmentyminen johtaa suoraan aktivointi pro-kaspaasi 8: [29]. Vaikka phosphoryation tulokset ydin- relocalization, minkä jälkeen RKIP aktivointi omaa transkription tasot RKIP proteiinin eivät lisää. Tämä viittaa siihen, jolla on eri RKIP asetuksen kuin mitä on aiemmin raportoitu. Tutkimme tällä hetkellä mekanismia, jolla pRKIP laukaisee apoptoosin mahasyövässä soluissa jälkeen H. pylori
infektio.

Cag-positiivisia H. pylori
merkittävästi upregulate EMT liittyvien geenien Snail, Slug ja vimentiinistä yhdessä induktioon MMP-7, mikä viittaa rooli näiden proteiinien mahasyövässä kehittämiseen [49]. Tutkimuksessamme havaitsimme nopean induktion pRKIP proteiinia jälkeen H. pylori
infektio, ja kasvu RKIP transkription, ja säätelyä Snail mRNA ja proteiinin ilmentymisen. Vaikka Snail tunnistettiin transkription repressori on RKIP [25], meidän tutkimus osoittaa, että se todennäköisesti ei ole vaikutusta fosforyloidun muodon RKIP, koska tartunnan jälkeen emme tarkkailla tukahduttamisesta RKIP transkription.

tartunnat jossa cagPAI-jolla kantojen H. pylori
liittyy vahvemman tulehdusreaktion mahassa ja aiheuttaa suuremman riskin sairastua mahahaava tai mahasyöpä kuin kannat, joilta puuttuu CAG saaren [36]. H. pylori
indusoi voimakkaan tulehdusvasteen ja paikallisesti korkeita useiden sytokiinien, kuten interleukiini-6 (IL-6) [34].

• PLoS ONE: ohjelmoitu Kemoterapia metastasoituneen leikkaushoitoon mahasyövän
• PLoS ONE: kvantitatiivinen mittaus orgaanisten happojen kudoksille mahasyöpäpotilaista Osoittaa Lisääntynyt glukoosiaineenvaihdunnan mahasyövän