PLoS ONE: Exclusive Association of p53 Mutation Super-High metylointi tuumorisuppressorigeeneille p53 Pathway in ainutlaatuinen mahasyövän Phenotype

tiivistelmä

Background

Kattava etsiä DNA metyloitua geenit tunnistettu ehdokas tuumorisuppressorigeeneille jotka ovat osoittautuneet olla mukana apoptoottisen prosessin p53
kautta. Tässä tutkimuksessa selvitettiin p53
mutaatio tällaisiin epigeneettiset muutos ensisijainen mahasyövässä.

Methods

metylaatio profiilit 3 geeneistä: PGP9
. 5
, NMDAR2B
, ja CCNA1
, jotka osallistuvat p53 tuumorisuppressorin reitin yhdistelmänä p53
mutaatio, olivat tarkasteltu 163 ensisijainen syöpien. Vaikutus epigeneettiset palautuvaa yhdessä kemoterapeuttisten lääkkeiden apoptoosin arvioitiin myös mukaan kasvain p53
mutaatiostatus.

Tulokset

p53
geeni mutaatiot löydettiin 44 ensisijaisen mahalaukun kasvaimet (27%), ja super-korkea metyloinnin tahansa 3 geenien havaittiin vain niissä tapauksissa, joissa villityypin p53
. Korkeampi p53
reitin poikkeamaa havaittiin tapauksissa miessukupuoli (p = 0,003), suoliston tyyppi (p = 0,005), ja ei-tunkeutuva tyyppi (p = 0,001). p53
reitin poikkeamaa ryhmä näytteillä vähemmän uusiutumisen imusolmukkeisiin, etäinen elimet, ja vatsakalvon kuin p53
ei poikkeamaa ryhmä. Vuonna NUGC4 mahasyövän solulinja ( p53
villityypin), epigeneettiset hoito täydennetty apoptoosin kemoterapeuttiset lääkkeet, osittain kautta p53
transkription aktiivisuutta. Toisaalta, että KATO III syöpäsolun rivi ( p53
mutantti), epigeneettiset hoito yksinään indusoi vankka apoptoosin, ilman trans-aktivoitumisen p53
.

johtopäätös

mahasyövän, p53
olennaiset ja ainoastaan ​​asiaan reittejä olemassa, ja kasvaimet joko polku tyyppi näytteillä ainutlaatuisia kliinisiä piirteitä. Epigeneettiset hoidot voivat aiheuttaa apoptoosin osittain läpi p53
aktivointia, mutta niiden apoptoottiset vaikutukset voidaan selittää paljolti mekanismilla muuten kuin p53
polkuja.

Citation: Waraya M, Yamashita K, Ema A, Katada N, Kikuchi S, Watanabe M (2015) Exclusive ry p53
Mutation Super-High metylointi tuumorisuppressorigeeneille p53
Pathway ainutlaatuisella Mahalaukun syöpä Fenotyyppikuvaus. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10,1371 /journal.pone.0139902

Editor: Qian Tao, Kiinan University of Hong Kong, HONGKONG

vastaanotettu: 31 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 18 syyskuu 2015; Julkaistu: 08 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Waraya et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat osittain Grant-in tuki Cancer Research terveysministeriön, Labour and Welfare Japanin ja jonka Japani säätiö monitieteinen syövän hoitoon. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu, tai analysointia varten; että tulosten tulkinta; valmisteluun käsikirjoitus; tai päätös jättää käsikirjoituksen julkaistavaksi.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA: n metylaatio on keskeisessä asemassa geenien kasvainten synnyssä ihmisen syövässä. Syöpä-erityinen metylaatio geeni on harvinainen kokonaisuus, ja usein poikkeamaa metylaation Primaarikasvaimen kudoksissa on vielä harvinainen [1, 2]. Havaitsimme syöpää erityisiä metyloituja geenejä kussakin elimessä käyttäen farmakologisia paljastumista mikrosirulla (PUM) [1, 2] ja muunnetun PUM [3-5]. Havaitsimme monta ehdokasta tuumorisuppressorigeeneille (APT), kuten PGP9
. 5
pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [2], ruokatorven SCC (ESCC) [6] , mahasyöpä [4], ja muut syövät [7], NMDAR2B
in ESCC [3] ja mahasyövän [8], ja CCNA1
in HNSCC [2]. Metylointi profiileja Näiden geenien on validoitu muiden ryhmien ja /tai jopa muissa syövissä [9-14]. Geenit, jotka osoittivat yli 60% metylaation kasvainkudoksissa nimettiin erittäin tärkeitä metyloitua geenejä (HRMGs) [15]. Lisäksi olemme edelleen verrattuna taajuuden tällaisten poikkeavasta metylaation ehdokkaan HRMGs muiden raporttien mahasyövän [16], ja geeni ehdokasta kaventamaan tiettyihin geeneihin.

Mikä tärkeintä, nämä ehdokas tuumorisuppressorigeeneille oli raportoitu olevan p53
kasvain vaimennin polku (kuvio 1). Esimerkiksi PGP9
. 5
suoraan vuorovaikutuksessa p53
ja vakauttaa p53
estämällä sen hajoamista läpi ubikinaa- väylän hepatosellulaarinen [17] , rintojen [18], ja nenänielun syöpä [19]. NMDAR2B
indusoi apoptoosin kautta suora vuorovaikutus DAPK
[20], joka puolestaan ​​on osoitettu vastapainoksi onkogeenin aiheuttaman muutoksen aktivoimalla p19ARF Twitter / p53
riippuvan apoptoottinen tarkastuspiste [21]. CCNA1
on p53
indusoimaan geenin, joka välittää apoptoosia G2 /M pidätys, ja mitoottisten katastrofin ihmisen munuaisen, munasarja- ja keuhkosyövän soluihin [22]. Näin ollen p53
-systeemi ablatoitu kasvainkudoksissa ensisijaisen syöpien epigeneettisestä tavalla yhdessä villityypin p53
, mutta ei ole raportti koskien yhdistyksen p53
mutaatio ja epigeneettiset muutoksiin primaarikasvaimen kudoksissa.

tässä tutkimuksessa tutkimme DNA metylaatiostatuksen geenien p53
reitin joita poikkeuksellisen säännellään epigeneettisestä tavalla ensisijainen mahalaukun syöpä, ja verrattiin niiden metylaatiokuvion kanssa p53
mutaatiostatusta määrittämiseksi kliinistä merkitystä p53
poikkeamaa fenotyyppejä.

Methods

Cell linjat ja kudosnäytteiden

mahasyöpä solulinjat, KatoIII, NUGC4, AZ521, ja SH10 ostettiin RIKEN Bioresource Center (Ibaraki, Japani). Ja maksasyövän HepG2 hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Nämä solulinjat, paitsi AZ521 ja HepG2 kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (GIBCO, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia. AZ521 ja HepG2 kasvatettiin DMEM-alustassa (GIBCO), johon oli lisätty 10% FBS: ää.

Pairs (n = 163) ja formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kasvainkudoksen ja vastaavassa normaalissa limakalvon yksilöitä saatu vähintään 5 cm: n kasvain reunasta saatiin leikkauspotilaiden välillä 01 tammikuu 2000, ja 31. joulukuuta 2010. Kaikki potilaat vaiheen II /III GC oli läpikäynyt mahdollisesti parantava resektio ensisijaisen GC, ja tehtiin adjuvantti S -1 kemoterapiaa leikkauksen jälkeen (S-1 tavallinen hoito). Neo-adjuvanttihoidon ei suoritettu tässä potilasryhmässä kohortissa. Kasvaimet luokitellaan joko TNM luokituksen mukaan 7 ^{painos Unionin International Cancer ohjaus (UICC) ja 14 th painos Japani luokittelu mahakarsinooman (JCGC). Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Kaikki kudosnäytteet kerätään Kitasato yliopistollisen sairaalan, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja terveiltä luovuttajilta ennen näytteen keräämistä. Tämä tutkimus oli hyväksynyt eettinen komitea Kitasato yliopistosta.}

Analyysi mutatoitunut p53
geenejä käyttäen yksijuosteisen konformaation (SSCP) B

Mutaatiot eksonien 5, 6, 7 ja 8 p53
geeni seulottiin ei-radioaktiivinen yksijuosteisen konformaation (SSCP) analyysiä, joka tehtiin käyttämällä aikaisemmin vakiintuneita menetelmiä [23]. PCR-tuote näytteitä 10 ui laimennettiin kolminkertaisesti geeli-latauspuskuria (95% deionisoitua formamidia, 20 mmol /L EDTA, 0,01% bromifenolisinistä ja 0,01% ksyleenisyanolia) ja kuumennettiin 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen reaktio pysäytetään jäällä. Alikvootit 3 ui pantiin muutettu polyakryyliamidigeeleillä (PAFG: 18% polyakryyliamidi-bis (49: 1), 0,5 x TBE, 10% glyserolia, 10% formamidia, 0,05% ammoniumpersulfaattia ja 30 ml TEMED) ja mitat 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. Elektroforeesi suoritettiin 1,5 x TBE-ajopuskurissa 500 V ja 30 mA 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Vyöhykkeet havaittiin värjäämällä geelit käyttämällä hopeavärjäystä ja kit (Bio-Rad, Hercules, CA), jota seurasi kiinnitys, huuhtelu, kehitys, ja pysähtymistä reaktion. Mutatoitu bändejä havaittiin PCR-SSCP olivat ilmeisiä 1:64 laimennoksena mutatoituja alleeleja.

bisulfiittikäsittelyn uutettua DNA

Genominen DNA FFPE kudoksia ja solulinjoja eristettiin käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) ja QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) mukaan valmistajan protokollia. DNA denaturointia, 2 ug genomista DNA: ta inkuboitiin 5 ug lohen sperman DNA: ta 0,3 mol /l NaOH: ta 20 minuutin ajan 50 ° C: ssa. DNA-näyte laimennettiin sitten 500 pl liuosta, joka sisälsi 2,5 mol /l natriummetabisulfiitilla (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hydrokinonia (Sigma) /0,4 mol /l vesiliuosta, ja inkuboitiin 70 ° C: ssa 1,5 tunnin ajan. Sitten näyte pylvääseen, (Wizard DNA Clean-UP System, Promega Inc., Madison, WI), inkuboitiin 0,3 mol /l NaOH: ta 10 minuutin ajan, ja sen jälkeen käsiteltiin 3 mol /l ammoniumasetaattia 5 minuuttia. Näyte saostettiin 100% etanolia, ja DNA suspendoitiin uudelleen 50 ul: LOTE, joka sisälsi 10 uM Tris-HCI, pH 8, ja 2,5 uM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), pH 8, ja sen jälkeen monistettiin polymeraasiketjureaktion (PCR). Bisulfiitti käsittely johtaa kemialliseen modifiointiin metyloitumattoman, mutta ei metyloidut, sytosiinit urasiilit, jolloin ero metyloituneiden ja metyloitumattomien genomista DNA: ta.

Quantitative-metylaatiospesifinen PCR (Q-MSP) B

Kvantitatiivista metylointianalyysi, TaqMan metylaatiospesifisen PCR (Q-MSP) suoritettiin käyttäen iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) kolmena kappaleena annetun iCycler iQ ™ Real-Time PCR Detection järjestelmän (Bio-Rad). PCR-olosuhteet ja sekvenssit annetaan S1 taulukossa. Sarjalaimennoksia bisulfiitin muutettu CpGenome universal metyloitua DNA: ta (Chemicon International, Temecula, CA) käytettiin kalibrointikäyrän kullekin levylle, kuten metylointi positiiviset kontrollit ja CpGenome Universal metyloimattoman DNA: n (Chemicon International) käytettiin negatiivisena kontrollina. Metylointi arvo (TaqMeth arvo) määritettiin suhteena metyloitu PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, tai DAPK
normalisoitu metyloitunut β-aktiini
, joka kerrottiin sitten luvulla 100.

immunohistokemiallinen värjäys PGP9.5, NMDAR2B, ja CCNA1

immuunivärjäystä antigeeni peittymisen suoritettiin autoklaavissa liotuksen, endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin inkuboimalla 3% H _{2O 2 /metanoli 5 minuuttia, ja epäspesifistä vasta-aineen sitoutuminen estettiin inkuboimalla 1% laimennettua normaalia hevosen seerumia 30 minuutit. Leikkeitä inkuboitiin sitten 4 ° C: ssa yön seuraavilla vasta-aineilla: kanin PGP9.5 polyklonaalinen vasta-aine (laimennus 1: 200, Nonus Biogenesis.), Kanin NMDAR2B polyklonaalinen vasta-aine (laimennus 1: 100, Millipore), tai hiiren sykliini monoklonaalinen vasta-aine (6E6, laimennus 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Immuuni- komplekseja ei havaittu Vectastain Elite ABC -kittiä (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Nämä immuunijärjestelmän kompleksit detektoitiin käyttäen 3,3'-diaminobentsidiiniä substraattina (Vector) kromogeenina (PGP9.5 1,5 minuuttia, NMDAR2B 6 minuuttia, CCNA1 10 minuuttia). Osiot vastavärjättiin hematoksyliinillä.}

Epigeneettiset hoito 5-atsa-dC ja TSA, ja kemoterapian kanssa CDDP

Solut jaettiin ja ympättiin pienellä tiheydellä (1x10 ^{6 /T-75 pulloon) 24 tuntia ennen käsittelyä. Sitten soluja käsiteltiin 24 tunnin välein 4 päivän ajan joko 1 tai 5 uM 5-atsa-2'-deoksisytidiini (5-atsa-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) liuotetaan 50% etikkahappoa tai jotka mock käsiteltiin PBS: llä, mukaan lukien sama määrä etikkahappoa. Kuten on osoitettu, 100 nM trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich) ja /tai 12,5 uM cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japani) lisättiin lopullisen 24 tuntia.}

Western blotting -analyysi

Yhteensä proteiini uutettiin solulinjoista, joita epigeneettiseltä käsiteltiin kanssa /ilman kemoterapeuttisen hoidon, ja tehtiin Western-blottaus-analyysi käyttäen seuraavia vasta-aineita: hiiren anti-p53-monoklonaalista vasta-ainetta (1C12, laimennus 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) tai hiiren anti-β-aktiini-IgG: _{2a monoklonaalista vasta-ainetta (laimennos 1: 10000, Sigma-Aldrich).}

p53 reportterimääritys

solut (2 x 10 ^{4 solua /96 kuoppaisella levyllä), jotka epigeneettiseltä hoidettiin /ilman kemoterapian transfektoitiin p53
toimittaja vektori (Qiagen) käyttäen Signal ™ Pathway Reporter Kit ( QIAGEN) ja Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen). 24 tunnin inkubaation, toimittaja aktiivisuus mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasi Reporter Assay System (Promega). Transfektiot suoritettiin kolmena kappaleena ja analysoitiin käyttämällä Softmax Pro -ohjelmaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).}

apoptoosimäärityksessä

Käsitellyt solut (1 x 10 ^{5 solua /näyte) värjättiin anneksiini V: ja 7-AAD (Guava neksiini reagenssi, Guava Technologies, Hayward, CA) syrjinnän varhaisen ja myöhäisen apoptoottisia soluja, tässä järjestyksessä. Koe suoritettiin käyttäen Guava PCA System, suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja analysoitiin CytoSoft 2.1.5 ohjelmistoa (Guava Technologies).}

Tilastollinen

Fisherin testiä tai Mann-Whitney U testiä käytettiin kategorinen muuttujia, ja Opiskelijan t
-testi käytettiin jatkuvien muuttujien. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± standardipoikkeama (SD). Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa kumulatiivinen eloonjäämisaste, ja erot selviytymisasteet arvioitiin käyttäen log-rank-testi. Relapse elinaika (RFS) ja kokonaiseloonjääminen (OS) mitattiin alkaen operaation päivämäärän toistumisen ja kuolema, tai Viimeisessä seurannassa. Mitä tulee RFS tai OS, potilaat, jotka selvisivät yli 60 kk (5-vuotiaat) analysoitiin eloonjääneitä. P < 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SAS ohjelmistopaketteja (SAS Institute, Cary, NC).

Tulokset

p53
geenin asema ja metylaatio profiilit PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, ja DAPK
in pStage II-III mahasyövän

p53
mutaatioita tunnistettiin 44 163 ensisijainen mahasyöpäpotilaista (27%), jonka SSPC-analyysi. p53
geenimutaation ei ollut prognostista merkitystä (kuvio 2A). Sitten analysoimme metylaatio profiilit PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, ja DAPK
näihin kudoksiin käyttäen Q-MSP. TaqMeth arvo kaikkien geenien oli korkeampi ensisijainen kasvaimia mahasyövän villin tyypin p53
kuin niillä, joilla on mutantti p53
(geenin metylaatio järjestyksessä: PGP9
. 5
> NMDAR2B
> CCNA1
> DAPK
) (kuvio 3A ja S1 ja S2 kuviot). Metylointi promoottori DNA oli merkittävästi suurempi CCNA1
(p < 0,0001) ja PGP9
. 5
(p = 0,03), ja marginaalisesti huomattavasti suurempi NMDAR2B
(p = 0,10) ja DAPK
(p = 0,05) ensisijainen mahasyövän verrattuna vastaaviin normaalin limakalvon. Tärkeää on, super-high metylaatio taso PGP9
. 5
, NMDAR2B
, ja CCNA1
oli yksinomaan todettu primaarikasvainten ilman p53
mutaatio, cut-off TaqMeth arvot olivat 50, 163 ja 133, tässä järjestyksessä (kuvio 3A). Tällainen erittäin korkea metyloinnin PGP9
. 5
, NMDAR2B
ja CCNA1
löytyi 14, 19, ja 8 näytettä vastaavasti, ja joitakin näistä näytteistä päällekkäin (kuvio 3B). DAPK
ei näytä tätä suuntausta, koska DAPK
metylaatio taso oli melko korkea vastaavassa normaalissa limakalvon kudoksissa huomattava osa tapauksista (S2 Kuva).

immunohistokemiallinen analyysi PGP9.5, NMDAR2N, ja CCNA1 proteiinin ilmentymisen ensisijaisen mahasyövän

immunohistokemiallinen värjäys PGP9.5, NAMDR2B ja CCNA1-proteiinin ilmentyminen suoritettiin sitten molemmissa tapauksissa, joissa super-korkea metylaatio, ja niitä alhainen metyloinnin näistä geeneistä. Vahva vähentäminen ilmentymisen PGP9.5, NMDAR2B, ja CCNA1 havaittiin ensisijainen mahasyövän kudoksissa, kun promoottori-DNA: n metylaatio oli erittäin korkea (kuvio 3). Toisaalta, ei laskua proteiinin ilmentymisen PGP9.5, NMDAR2B tai CCNA1 havaittiin, kun promoottori-DNA: n metylaatio oli alhainen (kuvio 4).

kliinis analyysi ensisijainen mahasyövän patologisiin vaiheen II /III mahasyövän standardin hoitoon

kliinis-ja ennusteen (5 vuoden RFS ja OS) analysoitiin sitten joka univariable tavalla mahasyövän patologisen vaiheen II /III mahasyövän standardin hoitoon (leikkaus plus leikkauksen jälkeinen S-1 hallinto) (taulukko 1). Me luokitteli mahasyöpäpotilaista 3 ryhmään, joka perustuu p53
mutaatiostatus sekä DNA metylaatiostatuksen PGP9
. 5
, NMDAR2B
ja CCNA1
, jota nimetty genomista ja epigeneettiset luokkia, vastaavasti (GEC). Nämä kolme ryhmää olivat p53
mutantti, p53
villityypin super-korkea metylaatio (SHM) edellä 3 p53
reitin geenien ( p53
WT /SHM), ja p53
villityypin ilman (w /o) SHM ( p53
WT w /o SHM).

Mielenkiintoista, potilasryhmiä luokitusta on GECs merkittävästi korreloivat sukupuoli (p = 0,0003), ikä (p = 0,08), Lauren: n histologia (p = 0,005) ja tunkeutuminen kuvio (p = 0,001), mutta ei ennustetekijöiden kuten lavastus tekijöitä. Potilasryhmät luokiteltu perustuen GECs osoitti myös, että p53
mutantti ja p53
WT /SHM ryhmät olivat samanlaiset mitattuna potilaan numero kunkin kliinisen ominaisuuden mutta erosivat tässä suhteessa verrattuna p53
WT w /o SHM ryhmä. Niinpä äskettäin nimetty entinen ryhmät ( p53
mutantti plus p53
WT /SHM ryhmiä), kuten p53
poikkeavuus ryhmä, ja jälkimmäisen ryhmän ( p53
WT w /o SHM) nimettiin p53
ei poikkeavuus ryhmä.

Vaikka ennuste ei ollut merkitsevästi erilainen eri ryhmissä luokiteltava GEC (kuvio 2B ), lisää toistuminen löytyivät p53
poikkeavuus ryhmässä verrattuna p53
kuin poikkeamia ryhmä (taulukko 1, ei tilastollisesti merkitsevä ero). Tämä suuntaus on säilynyt kannalta toistumisen rakenteessa kunkin imusolmukkeiden, vatsakalvon ja kaukainen elimet (taulukko 2), mikä viittaa siihen, että p53
poikkeavuus ryhmä todennäköisesti näytteille kliinisesti ainutlaatuinen fenotyyppi jopa alkaen prognostisia näkökulmasta. Kun vain tapauksissa toistuminen analysoitiin, p53
poikkeavuus ryhmä jälleen merkitsevästi yhteydessä Laurenin histologia (taulukko 2, P = 0,01), ei kuitenkaan todettu uusiutumisen malleja, jotka olivat ainutlaatuisia p53
poikkeama.

Toisaalta, hajanainen tyyppi mahasyövän verrokkeja paremmin ennustetta kuin suolistosta tyyppi mahalaukun syövän p53
poikkeaman ryhmää (kuvio 5A). Koska tällaisia ​​potilaita yleensä jaetaan pitemmälle, nämä selviytymisen tiedot osoittivat, että S1 postoperatiivinen adjuvanttihoitoa on tehokkaampi hajanainen tyyppi mahasyövän kuin suoliston tyyppi mahasyövän tapauksissa p53
reitin poikkeama (kuvio 5B).

Lopuksi vertailutiedot (taulukko 1), univariable ennustetekijöitä analyysi RFS ja OS kaikista potilaista todettu kliinisesti merkittäviä mahdollisuuksia ennustetekijöiden edustavat huono selviytyminen kuten sukupuoli (P = 0,03, P = 0,1) , ikä ≥67 vuotta (P = 0,009, P = 0,001), ylempi kasvaimen sijainti (P ​​= 0,06, P = 0,1), 14 ^{th JGCA /7 th UICC pT (P = 0,08, P = 0,4), 14 th JGCA pN (P = 0,001, P = 0,06), ja 14 th JGCA /7 th UICC vaiheessa (P < 0,0001, P = 0,03).}

Epigeneettiset indusoi p53-proteiinin ilmentymisen, yhtäpitävä p53 transkriptioaktiviteettia

Epigeneettiset hoidossa NUGC4 mahasyövän solulinjoissa (villityyppinen p53
) kanssa 5 uM 5-atsa-2' deoksisytidiinin tai 5 uM 5-atsa-2'-deoksisytidiinin ja trikostatiini robustisti aiheuttaman apoptoosin ilman kemoterapeuttisen aineen CDDP. Muita hoito CDDP edelleen merkittävästi lisätyn nämä apoptoottisia vaikutuksia (kuvio 6C). Mielenkiintoista on, CDDP yhdessä epigeneettisiä hoitojen voimakkaasti lisääntynyt p53-proteiinin tasoa, joka osittain, mutta ei kokonaan, mikä näkyy p53
transkriptionaalista aktiivisuutta lusiferaasireportterigeeniin (kuvio 6A ja 6B). Nämä havainnot ehdottivat, että p53
transkription aktiivisuutta voidaan aktivoida uudelleen epigeneettiset hoitoja, mutta se osoittaa myös, että apoptoosin vain osittain indusoi kautta p53
reitin.

Lisäksi epigeneettiset hoito KATOIII mahasyövän solulinjoissa ( p53
null), 1 uM 5-atsa-2'-deoksisytidiinin tai 1 uM 5-atsa-2'-deoksisytidiinin ja trikostatiini robustisti aiheuttaman apoptoosin puuttuessa CDDP, mutta ylimääräisiä CDDP hoito ei vielä merkittävästi lisätä apoptoottista vaikutusta (kuvio 6C). CDDP yhdistettynä epigeneettisellä hoitoja ei suurentanut p53-proteiinin tasoa, mikä heijastui puute p53
transkriptionaalista aktiivisuutta lusiferaasireportterigeeniin (kuvio 6A ja 6B). Nämä havainnot ehdottivat, että p53
transkription aktiivisuutta ei vaadita apoptoosi epigeneettiset hoitoja KATOIII soluissa ( p53
null-solut).

Keskustelu

Tämä nykyinen tutkimus on ensimmäinen raportti, joka SHM kasvainten synnyssä p53
reitin löytyy yksinomaan patologinen vaiheen II /III mahasyövän villin tyypin p53
(kuva 3). Valitsimme pStage II /III mahasyöpäpotilaista standardin hoitoja p53
koulutusjakson analyysi, koska monitieteellinen hoitojen näillä potilailla on parhaat mahdollisuudet saavuttaa ennustetekijöiden parannus täydellinen kovettuvuuteen [24, 25]. Tämä näkökohta tulisi olla ensisijainen tavoite, kun otetaan huomioon edelleen kehittää uusia hoitostrategioita.

Lähes täydellinen metylaatio promoottori DNA CpG-saarekkeiden tarvitaan täydellinen geenien, ja pienetkin osuudet metyloitumattomien alleelien uskottavasti aiheuttaa geeniekspression [ ,,,0],1-5]. Ensisijaisen kasvaimen kudokset, SHM on muodostettava lähes täydellinen metylointi syöpäsoluissa, ja SHM ensisijaisen kasvaimen kudokset todellakin liittyy alentunut proteiinin sellaisten geenien ekspression (kuvio 4). Tämä tulos viittasi siihen, että SHM geenien p53
reitti voisi olla toiminnallisesti vastaava p53
toiminnallinen poikkeavuus, joka tapahtuu seurauksena p53
mutaatio, koska nämä 3 molekyylien toimivat samalla p53
reitin.

mahasyövän, p53
poikkeavuus ryhmä merkitsevästi yhteydessä ainutlaatuinen kliinis fenotyypit, kuten Lauren suoliston histologia, miessukupuoli, vanha ikä, ja vähemmän infiltroiva kasvun (taulukko 1). Nykyinen havainnot voivat liittyä Aiempien raporttien, joka osoitti, että p53
mutaatio korreloi varhaisessa vaiheessa suoliston tyypin mahasyöpä, tai myöhäisessä vaiheessa hajanainen tyyppi mahasyövän [26, 27], tai korkeasta iästä [ ,,,0],28], mutta meidän kliinis analyysi koostuivat pääosin keskivaiheen mahasyövän. Mielenkiintoista, polku poikkeavuus on ainutlaatuinen ja kestävä jopa toistuvia potilailla (taulukko 2).

positiivinen ennustetekijöiden merkitystä p53
mutaatio mahasyövän on kiistanalainen sekä kannattajien [29] ja toisinajattelijoita [30 ] tästä mahdollisuudesta. Ensi silmäyksellä tietomme näyttävät tukevan jälkimmäiseen ryhmään, mutta se on otettava huomioon, että selviytyminen data on todennäköisesti muutettu leikkauksen jälkeinen adjuvanttihoitoa (tavanomaista hoitoa Japanissa). Katsovat, toisin kuin esillä olevassa tutkimuksessa, hajanainen tyyppi mahasyövän osoitti huonompi ennuste kuin suolistosta tyyppi mahasyövän meidän sairaalassa vuosikymmeniä sitten [15, 31], päivitettyä selviytymisen tiedot tukevat päinvastaista tulosta (eli suoliston tyyppinen mahasyöpä näyttää huonompi ennuste kuin hajanainen tyyppi mahalaukun syöpä), joka on oletettavasti johtuu S-1 postoperatiivinen adjuvanttivaikutukset [32]. Leikkauksen jälkeisen adjuvantti S-1 kemoterapia on ehdotettu olevan merkitsevästi tehokkaampia vatsakalvon tauti kuin kaukainen organ etäpesäke [24], ja se on todennäköisesti tehokkaampi hajanainen tyyppi mahasyövän kuin suoliston tyyppi mahasyövän [32] . Näistä syistä, viimeisin selviytyminen analyysi osoittaa, että ennusteen hajanainen tyyppi mahalaukun syöpä on parantunut, että suolen tyyppiä mahasyövän.

ei ollut tilastollista eroa toistumisen määrä tai ainutlaatuinen toistuminen sivustojen välillä p53
poikkeavuus ryhmä ja p53
ei poikkeavuus ryhmä, mutta enemmän toistuminen havaittiin kussakin toistumisen sivustoja p53
ei-poikkeavuus ryhmässä verrattuna p53
poikkeama ryhmä. Nämä havainnot saattavat ehdottaa, että p53
ei poikkeavuus ryhmä on aggressiivisempi fenotyyppi kuin p53
poikkeavuus ryhmä kokonaisuutena. Tutkimuksessamme hajanainen tyyppi mahasyövän verrokkeja paremmin ennustetta kuin suolistosta tyyppi mahalaukun syövän p53
poikkeama ryhmä. Koska tällaisia ​​potilaita yleensä jaetaan pitemmälle, nämä selviytymisen tiedot osoittivat, että S1 postoperatiivinen adjuvanttihoitoa on tehokkaampi hajanainen tyyppi mahasyövän kuin suoliston tyyppi mahasyövän tapauksissa p53
reitin poikkeamaa. Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien että mutantti p53
ja /tai immuno- p53-proteiinin voisi ennustaa biomarkkereita myönteisiä vaikutuksia suuren annoksen neoadjuvanttikemoterapian mahasyövän [30].

lopuksi arvioitiin epigeneettiset hoidon vaikutuksia yhdistelmänä kemoterapeuttisen aineen, jotta voidaan verrata, kuinka tärkeää on p53
väylän epigeneettiset väylän mahasyövän käsitellyissä soluissa CDDP. Yllättäen kävi ilmi, että p53
polku tuskin olla hyvin kriittinen rooli apoptoosin induktion CDDP (Kuva 6). Äskettäin osoitettiin, että epigeneettisellä syövän synty on todellakin mahdollista. Tässä järjestelmässä, systeeminen iPS indusoi uudelleenohjelmoinnin tekijät johtaa systeeminen syövän esiintyminen dynaamisilla epigeneettiset muutokset, vaikka systeeminen palautuminen näistä uudelleenohjelmointi tekijöiden palaa syöpäsolujen normaaliin soluihin [33]. Mahasyöpä todennäköisesti satama vähemmän mutaatioita kuljettajan geenejä [34] kuin peräsuolen syöpä [35], ja vastaavasti mutaatiot muita kuin p53
geeni ovat harvinaisia ​​rintasyövän [35], mikä viittaa siihen, että epigeneettisten karsinogeneesiä on mahdollinen merkittävä etiologia kautta krooninen infektio Helicobacter pylori [36-38]. Olemme äskettäin osoittaneet hyper-metyloinnin Reprimo
[39], joka taas on geenin p53
reitin, mutta joita ei voitu sisällyttää tässä tutkimuksessa, ja HOPX
[16] ja CDO1
[40], jotka molemmat osallistuvat apoptoosiin, mutta oletettavasti ei läpi p53
kautta. Perustuvat tämänhetkiseen toiminnallisia kokeita, p53
reitin osuus epigeneettiset hoidon vaikutuksia on todennäköisesti paljon pienempi kuin muut reitit (kuvio 5). Käytimme muita solulinjoja (2 mahasyövän solulinjoista ja 1 hepatosellulaarinen syöpä solulinja) määritellä tarkasti panos p53
polku indusoiman apoptoosin CDDP yhdessä epigenetic hoitoja. Ylimääräiset suoritetuissa kokeissa on esitetty S3 kuvassa. AZ521 ja HepG2 solulinjat ovat p53
villityypin ja SH10 solulinja on p53
mutantti. p53
aktiivisuutta havaittiin p53
villityypin soluissa, mutta sen aktiivisuus riippui kustakin solulinjasta. Siten p53
aktiivisuutta havaittiin NUGC4 solujen CDDP hoitoon sekä AZ521 ja HepG2-soluissa ilman CDDP hoitoa. Vahva apoptoosin arvioituna apoptoosimäärityksessä (kaspaasi 3 tai neksiini Pitoisuus) ei välttämättä asteinen p53
transkription aktivaation. In p53
mutantti (SH10) tai p53
null-soluissa, p53
transkriptionaalista aktiivisuutta ei indusoi lainkaan, mutta apoptoosi havaittiin olevan samanlainen kuin p53
villityypin soluista. Siksi mahasyövän, apoptoottisten reittien muu kuin p53
reitti voi olla merkitystä apoptoosin induktioon kuin p53
reitin.

Yhteenvetona p53
poikkeavuus ja ei-aberraation potilasryhmät olemassa mahasyövän, p53
polkuja voi olla poikkeava seurauksena epigeneettisiä muutoksia geenien reitit sekä vuoksi genomisen mutaation. p53
poikkeavuus ryhmä voi ainutlaatuisia kliinisiä piirteitä verrattuna p53
ei poikkeamaa ryhmä. Epigeneettiset valvonta p53
reitin geenit olla vähäinen merkitys apoptoosin induktion kemoterapeuttinen aine, ja apoptoosin mahasyövän jonka aiheuttaa epigeneettiset palautuminen saattaa johtua paljolti mekanismilla kuin p53
polku. Siten p53
reitti on todennäköisesti keskeinen rooli indusoiman apoptoosin CDDP yhdessä epigenetic hoitoja. Kuitenkin p53
reitin on raportoitu tärkeitä rooleja luonnon mahasyövän [41-44]. Niinpä meidän löytö, että p53
reitin geenin metylaatio yksinomaan löytyi mahasyövän kanssa p53
villityypin tila voi olla tärkeä havainto, ja tällaiset muutokset kasvainkudoksessa voi aiheuttaa syövän etenemiseen . Näistä syistä, että p53
reitin poikkeama voi olla ennustearvo kemoterapeuttisen vaikutuksia mahasyövässä.

tukeminen Information
S1 Kuva. Erityisyys metylaation PGP9
. 5
, NMDAR2B
, ja CCNA1
mahasyövän.
(EN) TaqMeth arvot kunkin geenin mahasyövän ja vastaavat normaali limakalvo on esitetty. (B) toinen TaqMeth arvot kunkin geenin luokiteltu p53
geenin asema kasvaimen esitetty. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0139902.s001
(TIF)
S2 kuviossa.

• PLoS ONE: sääntelemättömään ilmentymiseen SRC, LYN ja CKB kinaasien DNA Metylointi ja sen mahdollisen roolin mahasyövän invasiivisuus ja Metastasis
• PLoS ONE: Geneettinen vaihtelu 3-Kääntämättömät alue NBN Gene liittyy mahasyövän riski kiinalaisessa Väkiluku