PLoS ONE: Eksklusiv Association of p53 mutasjon med Super-High metylering av tumorsuppressorgener i p53 Pathway i en unik Gastric Cancer Phenotype

Abstract

Bakgrunn

Et omfattende søk etter DNA denaturert gener identifisert kandidat tumorsuppressorgener som har vist seg å være involvert i den apoptotiske prosessen med p53
veien. I denne studien undersøkte vi p53
mutasjon i forhold til slik epigenetisk endring i primærmagekreft

Metoder

metylering profiler av 3 gener. PGP9
. 5
, NMDAR2B
, og CCNA1
, som er involvert i p53 tumor suppressor vei i kombinasjon med p53
mutasjon var undersøkt i 163 primær mage kreft. Effekten av epigenetisk hjemfall i kombinasjon med cellegifter på apoptose ble også vurdert i henhold til svulsten p53
mutasjonsstatus.

Resultater

p53
genet mutasjoner ble funnet i 44 primær mage svulster (27%), og super-high metylering av noen av de 3 genene ble bare funnet i tilfeller med villtype p53
. Høyere p53
sti avvik ble funnet i tilfeller med mannlig kjønn (p = 0,003), intestinal type (p = 0,005), og ikke-infiltrerende type (p = 0,001). p53
pathway aberrasjon gruppe utstilt mindre tilbakefall i lymfeknuter, fjerne organer, og bukhinne enn p53
ikke-aberrasjon gruppe. I NUGC4 magekreft cellelinje ( p53
vill type), epigenetisk behandling utvidet apoptose av cellegifter, delvis gjennom p53
transkripsjonsaktivitet. På den annen side, i den KATO III-kreftcellelinje ( p53
mutant), epigenetisk behandling alene induserte apoptose robust, med ingen trans-aktivering av p53
.

Konklusjon

I magekreft, p53
relevante og ikke-relevante veier finnes, og svulster med enten pathway typen utstilt unike kliniske funksjoner. Epigenetiske behandlinger kan indusere apoptose delvis gjennom p53
aktivering, men deres apoptotiske effekter kan forklares i stor grad av mekanisme annet enn gjennom p53
trasé

Citation. Waraya M, Yamashita K, Ema A, Katada N, Kikuchi S, Watanabe M (2015) Eksklusiv Association of p53
Mutation med Super-High metylering av tumorsuppressorgener i p53
Pathway i en unik Gastric kreft Phenotype. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10,1371 /journal.pone.0139902

Redaktør: Qian Tao, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hongkong

mottatt: 31 mars 2015; Godkjent: 18 september 2015; Publisert: 08.10.2015

Copyright: © 2015 Waraya et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grant-in Aid for kreftforskning fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan og av den japanske Foundation for tverrfaglig behandling av kreft. Virkemiddelapparatet hadde ingen rolle i utformingen av studien, datainnsamling, eller analyse; i tolkningen av resultatene; i utarbeidelsen av manuskriptet; eller i beslutningen om å sende inn manuskript for publisering

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

DNA metylering spiller en sentral rolle i. genet Slå av tumorsuppressorgener i menneskelig kreft. En kreftspesifikke metylering genet er en sjelden enhet, og hyppige avvik av metylering i grunnskolen tumorvev er enda mer sjeldent [1, 2]. Vi identifiserte kreftspesifikke denaturert gener i hvert organ ved hjelp av en farmakologisk avsløring microarray (PUM) [1, 2] og en modifisert PUM [3-5]. Vi identifiserte mange kandidat tumorsuppressorgener (TSGs), for eksempel PGP9
. 5
i hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [2], esophageal SCC (ESCC) [6] , magekreft [4], og andre kreftformer [7], NMDAR2B
i ESCC [3] og magekreft [8], og CCNA1
i HNSCC [2]. Metyleringen profiler av disse genene har blitt validert av andre grupper, og /eller i andre former for kreft [9-14]. Gener som viste over 60% metylering i tumorvev ble betegnet som svært relevante denaturert gener (HRMGs) [15]. Videre vi videre sammenlignet hyppigheten av slike avvikende metylering av kandidat HRMGs med andre rapporter av magekreft [16], og gen kandidater ble snevret ned til spesifikke gener.

Viktigst disse kandidat tumorsuppressorgener hadde vært rapportert å være i p53
tumor suppressor pathway (fig 1). For eksempel PGP9
. 5
direkte samhandler med p53 Hotell og stabiliserer p53
ved å hemme nedbrytningen gjennom ubiquitinering sti i lever [17] , bryst [18], og nasofaryngeal kreft [19]. NMDAR2B
induserer apoptose gjennom direkte interaksjon med DAPK product: [20], som i sin tur, har vist seg å motvirke onkogen-indusert transformasjon ved å aktivere en p19ARF Twitter / p53
-avhengig apoptotisk sjekkpunkt [21]. CCNA1
er en p53
indusert genet som formidler apoptose, G2 /M arrest, og mitotisk katastrofe i menneskelig nyre, eggstokk, og lungekreft celler [22]. Derfor er p53
veien er ablated i tumorvev av primære kreft i en epigenetisk måte sammen med villtype p53
, men det har vært noen rapport om sammenslutning av p53
mutasjon og epigenetiske forandringer i primær tumorvev.

i denne studien har vi undersøkt DNA metylering status av gener i p53
sti som er unormalt regulert i en epigenetisk måte i primær mage kreft, og sammenlignet deres metylering mønster med p53
mutasjonsstatus for å bestemme den kliniske betydningen av p53
aberrasjon fenotyper.

Metoder

Cell linjer og vevsprøver

de magekreft cellelinjer, KatoIII, NUGC4, AZ521, og SH10 ble kjøpt fra Riken Bioresource Senter (Ibaraki, Japan). Og leverkreft cellelinje HepG2 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Disse cellelinjene, bortsett fra AZ521 og HepG2 ble dyrket i RPMI 1640 medium (GIBCO, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum. AZ521 og HepG2 ble dyrket i DMEM-medium (GIBCO), supplert med 10% FBS.

parene (n = 163) av formalinfiksert, parafin-innleiret (FFPE) tumorvev og tilsvarende normale slimhinneprøver ble oppnådd ved minst 5 cm fra tumor kanten ble innhentet fra pasienter som gjennomgår kirurgi mellom 1 januar 2000 og 31. desember 2010. Alle pasienter med stadium II /III GC hadde gjennomgått en potensielt kurativ reseksjon for primær GC, og gjennomgikk adjuvant S -1 cellegift etter operasjonen (S-en standard behandling). Neo-adjuvant behandling ble ikke utført i denne pasient kohort. Svulster ble klassifisert ved hjelp av TNM klassifisering i henhold til 7 ^{th utgaven av Union for International Cancer Control (UICC) og 14 th utgaven av den japanske Klassifisering av magekarsinom (JCGC). Pasientenes egenskaper er avbildet i tabell 1. Alle vevsprøver var samlet på Kitasato universitetssykehus, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og friske donorer før prøvetaking. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Kitasato University.}

Analyse av muterte p53
gener ved hjelp av enkelt-strand konformasjon polymorfisme (SSCP)

Mutasjoner i eksoner 5, 6, 7 og 8 i p53
genet ble undersøkt av ikke-radioaktive single-strand konformasjon polymorfisme (SSCP) analyse, som ble utført ved hjelp av våre tidligere etablerte metoder [23]. PCR-produktprøver på 10 ul ble fortynnet tredelt med gel-ladningsbuffer (95% deionisert formamid, 20 mmol /l EDTA, 0,01% bromfenolblått og 0,01% xylencyanol) og oppvarmet til 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av bråkjøling på is. Aliquoter på 3 ul ble påført på modifiserte polyakrylamidgeler (PAFG: 18% polyakrylamid-bis- (49: 1), 0,5x TBE, 10% glycerol, 10% formamid, 0,05% ammoniumpersulfat, og 30 ml TEMED) med dimensjoner 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. Elektroforese ble utført med 1,5x TBE-buffer ved 500 V og 30 mA i en time ved romtemperatur. Bånd ble påvist ved å farge gelene ved hjelp av en sølvfarging pluss kit (Bio-Rad, Hercules, CA), fulgt av fiksering, skylling, utvikling og stopping av reaksjonen. Muterte band oppdages med PCR-SSCP var tydelig på 1:64 fortynning av muterte alleler.

Bisulfite behandling av ekstrahert DNA

Genomisk DNA fra FFPE- vev og cellelinjer ble ekstrahert med QIAamp DNA FFPE tissue-sett (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) og den QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoller. For DNA-denaturering, ble 2 pg av genomisk DNA inkubert med 5 ug laksesperm DNA i 0,3 mol /l NaOH i 20 minutter ved 50 ° C. DNA-prøven ble så fortynnet med 500 mL av en løsning inneholdende 2,5 mol /l natrium-metabisulfitt (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hydrokinon (Sigma) /0,4 mol /l natriumhydroksyd-løsning, og ble inkubert ved 70 ° C i 1,5 timer. Prøven ble deretter applisert på en kolonne (Wizard DNA rensesystemer, Promega Inc., Madison, WI), inkubert med 0,3 mol /l NaOH i 10 minutter, og ble deretter behandlet med 3 mol /l ammonium-acetat i 5 minutter. Prøven ble utfelt i 100% etanol og DNA ble resuspendert i 50 ul Lote inneholdende 10 pM Tris-HCl, pH 8 og 2,5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), pH 8, og ble deretter amplifisert ved en polymerase-kjedere reaksjon (PCR). Bisulfite behandlingsresultater i kjemisk modifisering av unmethylated, men ikke denaturert, cytosines til uraciler, slik at skillet mellom metylert og unmethylated genomisk DNA.

Kvantitativ-metylering spesifikke PCR (Q-MSP)

For kvantitativ metylering analyse, TaqMan metylering spesifikk PCR (Q-MSP) ble utført ved hjelp av iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) i tre eksemplarer på iCycler iQ ™ real-Time PCR Detection system (Bio-Rad). PCR-betingelser og sekvenser er gitt i tabell S1. Serielle fortynninger av bisulfitt modifisert CpGenome universell metylert DNA (Chemicon International, Temecula, CA) ble anvendt for å konstruere kalibreringskurven på hver plate som metylering positive kontroller og CpGenome universell unmethylated DNA (Chemicon International) ble anvendt som den negative kontroll. Metylering verdi (TaqMeth verdi) ble definert som forholdet mellom metylert PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, eller DAPK
normalisert til metylert β-aktin
, som deretter ble multiplisert med 100.

Immunhistokjemisk farging av PGP9.5, NMDAR2B, og CCNA1

for farging, antigen avsløring ble utført med autoklav soaking, ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert ved inkubering i 3% H _{2o 2 /metanol i 5 minutter, og ikke-spesifikk binding ble blokkert ved inkubering med 1% fortynnet normal hesteserum i 30 minutter. Seksjonene ble deretter inkubert ved 4 ° C over natten med følgende antistoffer: kanin PGP9.5 polyklonalt antistoff (fortynning på 1:. 200, Nonus Biogenesis), kanin NMDAR2B polyklonalt antistoff (fortynning på 1: 100, Millipore) eller mus syklin A monoklonalt antistoff (6E6, fortynning på 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Immunkomplekser ble påvist med Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Disse immunkomplekser ble detektert ved bruk av 3,3'-diaminobenzidin-substrat (Vector) som et kromogen (PGP9.5 1,5 minutter, NMDAR2B 6 minutter, CCNA1 10 minutter). Seksjoner ble kontra med hematoksylin.}

epigenetisk behandling med 5-Aza-DC og TSA, og kjemoterapeutisk behandling med CDDP

Celler ble splittet og sådd til en lav tetthet (1x10 ^{6 /T-75 kolbe) 24 timer før behandling. Cellene ble deretter behandlet hver 24. time i 4 dager med enten en eller 5 uM 5-aza-2'-deoksycytidin (5-Aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) oppløst i 50% eddiksyre eller ble behandlet mock med PBS herunder den samme mengde av eddiksyre. Som antydet, 100 nM trichostatinA (TSA, Sigma-Aldrich). Og /eller 12,5 mikrometer av Cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) tilsatt for de siste 24 timer}

Western blot-analyse

Total-protein ble ekstrahert fra cellelinjer som ble epigenetiske behandlet med /uten kjemoterapeutisk behandling, og ble underkastet Western blotting-analyse ved anvendelse av følgende antistoffer: mus-anti-p53 monoklonalt antistoff (1C12, fortynning på 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) eller mus anti-β-aktin IgG _{2a monoklonalt antistoff (fortynning på 1: 10 000, Sigma-Aldrich)}

p53 reporter analysen

Cells (2x 10 ^{4 celler /96 vel plate) som ble epigenetiske behandlet med /uten kjemoterapeutisk behandling ble transfektert med en p53
reporter vektor (Qiagen) ved hjelp Signal ™ Pathway reporter Kits ( QIAGEN), og Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). Etter 24 timers inkubasjon ble rapportøraktivitet, målt ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega). Transfections ble utført i tre eksemplarer og analysert ved hjelp av Softmax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).}

apoptose analysen

Behandlet celler (1x 10 ^{5 celler /sample) ble farget med Annexin V og 7-AAD (Guava nexin reagent, Guava Technologies, Hayward, CA) for diskriminering av tidlige og sene apoptotiske celler, henholdsvis. Eksperimentet ble utført ved hjelp av Guava PCA System, utført i tre eksemplarer og analysert ved hjelp av CytoSoft 2.1.5 programvare (Guava Technologies).}

Statistisk analyse

Fishers eksakte test eller Mann-Whitney U test ble brukt for kategoriske variabler, og Student t
-test ble brukt for kontinuerlige variabler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Kaplan-Meier metoden ble brukt til å beregne kumulative overlevelse, og forskjeller i overlevelse ble vurdert ved hjelp av log-rank test. Relapse overlevelse (RFS) og total overlevelse (OS) ble målt fra tidspunktet for operasjonen til datoen for tilbakefall og død, eller den siste oppfølging. Med hensyn til RFS eller OS, ble pasienter som overlevde i mer enn 60 måneder (5 år) analysert som overlevende. P < 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans. Alle statistiske analyser ble utført med SAS programvarepakker (SAS Institute, Cary, NC).

Resultater

p53
genet status og metylering profiler av PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, og DAPK
i pStage II-III magekreft

p53
mutasjoner ble identifisert i 44 av 163 primær mage kreftpasienter (27%) av SSPC analyse. p53
genmutasjon ikke har prognostisk betydning (figur 2A). Vi analyserte metylering profiler av PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, og DAPK
i disse vev ved hjelp av Q-MSP. Den TaqMeth verdien av alle genene var høyere i primære svulster i magekreft med villtype p53
enn hos dem med mutant p53 plakater (genet metylering rekkefølge:. PGP9
5
> NMDAR2B
> CCNA1
> DAPK
) (figur 3A og S1 og S2 figurene). Metylering av arrangøren DNA var signifikant høyere for CCNA1 product: (p < 0,0001) og PGP9
5 product: (p = 0,03), og marginalt signifikant høyere for NMDAR2B product: (p = 0,10) og DAPK product: (p = 0,05) i primærmagekreft sammenlignet med tilsvarende normal slimhinne. Viktigere, en super-high metylering nivå av PGP9
. 5
, NMDAR2B
, og CCNA1
ble utelukkende funnet i primære svulster uten p53
mutasjon, cut-off TaqMeth verdier var 50, 163, og 133, henholdsvis (figur 3A). Slike super-high metylering av PGP9
. 5
, NMDAR2B Hotell og CCNA1
ble funnet i 14, 19, og henholdsvis 8 prøver, og noen av disse prøvene ble overlappende (fig 3B). DAPK
ikke vise denne trenden, fordi DAPK
metylering nivået var ganske høyt i de tilsvarende normal slimhinne vev av en betydelig del av tilfellene (S2 Fig).

Immunhistokjemisk analyse av PGP9.5, NMDAR2N, og CCNA1 protein uttrykk i primærmagekreft

Immunhistokjemisk farging for PGP9.5 ble NAMDR2B og CCNA1 protein uttrykk deretter utføres både i tilfeller med super-high metylering og de med lav metylering av disse genene. En sterk reduksjon i uttrykket av PGP9.5, NMDAR2B, og CCNA1 ble observert i primær mage kreft vev når arrangøren DNA metylering var super-høy (figur 3). På den annen side ble ingen reduksjon i protein ekspresjon av PGP9.5, NMDAR2B, eller CCNA1 funnet når promotor-DNA-metylering var lav (Fig 4).

Clinicopathological analyse i primær magekreft med patologisk stadium II /III magekreft med standard behandling

Clinicopathological funksjoner og prognose (5-års RFS og OS) ble deretter analysert i en univariable måte i magekreft med patologisk stadium II /III magekreft med standard behandling (kirurgi pluss postoperativ S-1-administrering) (tabell 1). Vi klassifisert mage kreftpasienter inn i 3 kategorier basert på p53
mutasjonsstatus samt DNA metylering status for PGP9
. 5
, NMDAR2B
og CCNA1
, som vi utpekt som genomisk og epigenetiske kategorier, henholdsvis (GEC). Disse tre kategoriene var p53
mutant, p53
villtype med super-high metylering (SHM) av de ovennevnte 3 p53
pathway gener ( p53
WT /SHM), og p53
villtype uten (w /o) SHM ( p53
WT w /o SHM).

Interessant, pasientgrupper klassifisert basert på GECs ble signifikant korrelert med kjønn (p = 0,0003), alder (p = 0,08), Laurens histologi (p = 0,005) og infiltrasjon mønster (p = 0,001), men ikke med prognostiske faktorer som stillas faktorer. Pasientgrupper klassifisert basert på GECs viste også at p53
mutant og p53
WT /SHM gruppene var like med hensyn til pasientens nummer for hver klinisk karakteristiske, men skilte seg i så måte i forhold til p53
WT w /o SHM gruppe. Dermed har vi nylig utpekte de tidligere gruppene ( p53
mutant pluss p53
WT /SHM grupper) som p53
aberrasjon gruppe, og den sistnevnte gruppen ( p53
WT w /o SHM) ble utpekt som p53
ikke-aberrasjon gruppe.

Selv om prognosen var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene kategorisert i henhold til GEC (fig 2B ), flere residiv ble funnet i p53
avvik gruppe sammenlignet med p53
ikke-aberrasjon gruppe (tabell 1, ingen statistisk signifikant forskjell). Denne trenden ble bevart i form av gjentakelse mønster av hver av lymfeknuter, bukhinne, og fjerne organer (tabell 2), noe som tyder på at p53
aberrasjon gruppe er sannsynlig vise et klinisk unik fenotype selv fra en prognostisk synspunkt. Når kun tilfeller med tilbakefall ble analysert, p53
aberrasjon gruppe ble igjen signifikant assosiert med Lauren histologi (tabell 2, P = 0,01), men det var ingen tilbakefall mønstre som var unike for p53
aberrasjon.

på den annen side, den diffuse typen magekreft viste signifikant bedre prognose enn intestinal type magekreft i p53
aberrasjon gruppe (fig 5A). Siden slike pasienter tendens til å bli distribuert til et mer avansert stadium, disse overlevelsesdata antydet at S1 postoperativ adjuvant kjemoterapi er mer effektivt for diffuse typen magekreft enn for intestinal typen magekreft i tilfeller med p53
pathway aberrasjon (Fig 5B).

til slutt, som referansedata (tabell 1), univariable prognostisk analyse for RFS og operativsystemet til alle pasienter identifisert klinisk signifikante potensielle prognostiske faktorer som representerer dårlig overlevelse som kjønn (P = 0,03, P = 0,1) , alder ≥67 år (p = 0,009, p = 0,001), øvre svulst beliggenhet (P = 0,06, P = 0,1), den 14 ^{th JGCA /7 th UICC pT (P = 0,08, P = 0,4), den 14 th JGCA PN (P = 0,001, p = 0,06), og 14 th JGCA /7 th UICC scenen (P <. 0,0001, P = 0,03)}

epigenetisk behandling indusert p53 protein uttrykk, konkordant med p53 transkripsjonen aktivitet

epigenetisk behandling av NUGC4 magekreftcellelinjer (villtype p53
) med fem mikrometer 5-aza-2' deoksycytidin eller 5 uM 5-aza-2'-deoksycytidin plus trichostatin En robust indusert apoptose i fravær av det kjemoterapeutiske middel CDDP. Ytterligere behandling med CDDP utvidet ytterligere betydelig disse apoptotiske effekter (Fig 6C). Interessant, CDDP i kombinasjon med epigenetiske behandlinger robust økt p53-protein-nivå, som er delvis, men ikke helt, reflektert p53
transkripsjonen aktivitet av et luciferase reporter-gen (figur 6A og 6B). Disse funnene antydet at p53
transkripsjon aktivitet kan reaktiveres ved epigenetiske behandlinger, men det tyder også på at apoptose er bare delvis indusert gjennom p53
sti.

Videre epigenetisk behandling av KATOIII magecancercellelinjer ( p53
null), med 1 uM 5-aza-2'-deoksycytidin eller 1 uM 5-aza-2'-deoksycytidin plus trichostatin En robust indusert apoptose i fravær av CDDP, men ytterligere CDDP behandling ikke lenger signifikant forsterker den apoptotiske effekter (figur 6C). CDDP i kombinasjon med epigenetiske behandlinger økte ikke p53-protein-nivå, som ble reflektert av mangelen på p53
transkripsjonen aktivitet av et luciferase reporter-gen (figur 6A og 6B). Disse funnene antydet at p53
transkripsjon aktivitet er ikke nødvendig for apoptose av epigenetiske behandlinger i KATOIII celler ( p53
null-celler).

Diskusjoner

Dette studien er den første rapporten som SHM av tumorsuppressorgener i p53
pathway finnes utelukkende i patologisk stadium II /III magekreft med villtype p53 plakater (figur 3). Vi valgte pStage II /III mage kreftpasienter med standard behandling for p53
pathway analyse, fordi tverrfaglig behandling i slike pasienter ha de beste mulighetene for å oppnå prognostisk forbedring med komplett curability [24, 25]. Dette hensynet bør være første prioritet når de vurderer videre utvikling av nye terapeutiske strategier.

Nesten komplett metylering av promoter DNA CpG øyer er nødvendig for fullstendig genet Slå, og selv små mengder av unmethylated alleler kan robust indusere genuttrykk [ ,,,0],1-5]. I den primære tumor-vev, må SHM representere nesten fullstendig metylering i kreftceller, og SHM i de primære tumorvev var faktisk forbundet med redusert protein ekspresjon av slike gener (figur 4). Dette resultatet antydet at SHM av gener i p53
veien kan være funksjonelt likeverdig med p53
funksjonelle avvik som oppstår som følge av p53
mutasjon, siden disse 3 molekyler funksjon i samme p53
sti.

i magekreft, p53
aberrasjon gruppen var signifikant assosiert med unike clinicopathological fenotyper som Lauren intestinal histologi, mannlig kjønn, gammel alder, og mindre infiltrerende vekst (tabell 1). Vår nåværende observasjoner kan være relatert til tidligere rapporter som viste at p53
mutasjon er korrelert med tidlig stadium av intestinal typen magekreft, eller med sent stadium av diffuse typen magekreft [26, 27], eller eldre alder [ ,,,0],28], men vår clinicopathological analysen inkluderte hovedsakelig midtre fasen magekreft. Interessant, er veien aberrasjon unik og vedvarende selv i tilbakevendende pasienter (tabell 2).

Positiv prognostisk betydning av p53
mutasjon i magekreft er kontroversielt med både tilhengere [29] og dissentere [30 ] av denne mulighet. Ved første øyekast våre data synes å støtte den sistnevnte gruppen, men bør det tas hensyn til at vår overlevelse data er sannsynlig å ha blitt modifisert av postoperativ adjuvant kjemoterapi (standardbehandling i Japan). Mens, i motsetning til denne studien, den diffuse typen magekreft viste dårligere prognose enn intestinal type magekreft i våre sykehus tiår siden [15, 31], de siste oppdaterte overlevelsesdata støtter motsatte resultater (dvs. tarm typen av magekreft viser dårligere prognose enn den diffuse type magekreft), som er putatively skyldes S-1 postoperative adjuvant effekt [32]. Post-operativ adjuvans S-1-kjemoterapi er blitt foreslått å være vesentlig mer effektivt for peritoneal sykdom enn for fjern organ metastase [24], og det er sannsynlig å være mer effektive for diffus typen magekreft enn for intestinal typen magekreft [32] . Av disse grunner, indikerer den siste overlevelsesanalyse som prognose av diffus type magekreft er forbedret i forhold til det i tarmtypen av magekreft.

Det var ingen statistisk forskjell i tilbakefall eller i det unike tilbakefall områder mellom p53
aberrasjon gruppen og p53
ikke-aberrasjon gruppe, men flere residiv ble funnet i hver av tilbakefall stedene i p53
ikke-aberrasjon gruppen sammenlignet med p53
aberrasjon gruppe. Disse funnene kan tyde på at p53
ikke-aberrasjon gruppen har en mer aggressiv fenotype enn p53
aberrasjon gruppen som helhet. I vår studie, den diffuse typen magekreft viste signifikant bedre prognose enn intestinal type magekreft i p53
aberrasjon gruppe. Siden slike pasienter tendens til å bli distribuert til et mer avansert stadium, disse overlevelsesdata antydet at S1 postoperativ adjuvant kjemoterapi er mer effektivt for diffuse typen magekreft enn for intestinal typen magekreft i tilfeller med p53
pathway aberrasjon. Disse funnene var i samsvar med tidligere rapporter som mutant p53 Hotell og /eller farging av p53 protein kan være prediktive biomarkører for positive effektene av høydose neoadjuvant kjemoterapi i magekreft [30].

avsluttende vurdering epigenetiske behandlingseffekter i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel for å sammenligne betydningen av p53
sti til epigenetisk sti i magekreftceller behandlet med CDDP. Uventet, det viste seg at p53
veien var usannsynlig å spille en svært viktig rolle i apoptose induksjon av CDDP (fig 6). Det ble nylig vist at epigenetisk karsinogenese er faktisk mulig. I dette systemet, systemisk IPS indusert ved reprogrammering faktorer resulterer i systemisk kreftforekomst med dynamiske epigenetiske forandringer, mens systemisk reversering av disse faktorene reprogrammerings går tilbake kreftceller til normale celler [33]. Magekreft er sannsynlig å huse færre mutasjoner av driver gener [34] enn tykktarmskreft [35], og likeledes andre enn p53
genet er sjeldne i brystkreft [35], noe som tyder på at epigenetisk carcinogenesen mutasjoner er en mulig stor etiologi gjennom kronisk infeksjon av Helicobacter pylori [36-38]. Vi har nylig demonstrert den hyper-metylering av Reprimo product: [39], som igjen er et gen i p53
sti, men som ikke kunne inkluderes i denne studien, og av HOPX product: [16] og CDO1 product: [40] som er begge involvert i apoptose, men putatively ikke gjennom p53
veien. Basert på våre nåværende funksjonelle eksperimenter, er p53
vei bidrag til epigenetiske behandlingseffekter sannsynlig til å være mye mindre enn for andre baner (fig 5). Vi brukte andre cellelinjer (2 magekreft cellelinjer og en leverkreft cellelinje) for å nøyaktig bestemme bidraget fra p53
vei til apoptose indusert av CDDP i kombinasjon med epigenetiske behandlinger. De ytterligere eksperimenter utført, er vist i S3 fig. AZ521 og HepG2 cellelinjer er p53
villtype, og SH10 cellelinjen er p53
mutant. p53
aktivitet ble detektert i p53
villtype-celler, men dens aktivitet var avhengig av hver cellelinje. Dermed p53
aktivitet ble påvist i NUGC4 celler med CDDP behandling og i AZ521 og HepG2 celler uten CDDP behandling. Sterk apoptose som vurderes av apoptose analysen (Caspase 3 eller nexin analyse) ikke nødvendigvis gjenspeiler graden av p53
transkripsjonen aktivering. I p53
mutant (SH10) eller p53
null-celler, p53
transkripsjonen aktivitet ble ikke indusert i det hele tatt, ble imidlertid apoptose funnet å være lik som i p53
villtype celler. Derfor, i magekreft, annet enn p53
veien kan være mer relevant for induksjon av apoptose enn p53
pathway apoptotiske trasé.

I konklusjonen, p53
aberrasjon og ikke-aberrasjon pasientgrupper finnes i magekreft, p53
trasé kan være avvikende som et resultat av epigenetisk modifikasjon av gener i banene så vel som på grunn av genomisk mutasjon. p53
aberrasjon gruppe kan utvise unike kliniske egenskaper sammenlignet med p53
ikke-aberrasjon gruppe. Epigenetisk kontroll av p53
pathway gener spiller en mindre rolle i apoptose induksjon av en kjemoterapeutisk middel, og apoptose i magekreft som er indusert av epigenetisk hjemfall kan forklares i stor grad av mekanisme annet enn p53
veien. Dermed er usannsynlig å spille en sentral rolle i apoptose indusert av CDDP i kombinasjon med epigenetiske behandlinger p53
veien. Imidlertid har p53
vei blitt rapportert å spille viktige roller i naturlig mage karsinogenese [41-44]. Således vår oppdagelse at p53
sti-genet metylering ble utelukkende funnet i magekreft med en p53
villtype-status kan være en viktig observasjon, og slike forandringer i tumorvev kan føre til tumorprogresjon . Det er for disse grunner som p53
pathway avvik kan ha prediktiv verdi av kjemoterapeutiske effekter i magekreft.

Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. Spesifisiteten av metylering av PGP9
. 5
, NMDAR2B
, og CCNA1
i magekreft. Product: (a) TaqMeth verdier av hvert gen i magekreft, og i den tilsvarende normal slimhinne er vist. (B) De TaqMeth verdiene av hvert gen klassifisert i henhold til p53
genet status av svulsten vises. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD
doi:. 10,1371 /journal.pone.0139902.s001 plakater (TIF)
S2 Fig.

• PLoS ONE: deregulert Expression of SRC, LYN og CKB kinaser av DNA Metylering og dens potensielle rolle i Gastric Cancer Invasivitet og metastase
• PLoS ONE: Genetisk variasjon i 3-uoversatt regionen NBN Gene er assosiert med Gastric Cancer Risk i en kinesisk Befolkning