PLOS ONE: Association exclusive de p53 Mutation avec Super-High méthylation de gènes suppresseurs de tumeurs dans la voie de p53 dans un unique cancer gastrique Phenotype

Résumé

Contexte

Une recherche exhaustive de l'ADN méthylé les gènes identifiés gènes suppresseurs de tumeur candidat qui ont fait leurs preuves pour être impliqués dans le processus apoptotique de la p53
voie. Dans cette étude, nous avons étudié p53
mutation par rapport à une telle modification épigénétique dans le cancer gastrique primaire

Méthodes

Les profils de méthylation des gènes 3:. PGP9
. 5
, NMDAR2B
et CCNA1
, qui sont impliqués dans la voie de suppresseur de tumeur p53 en combinaison avec p53
mutation étaient examiné dans 163 cancers gastriques primaires. L'effet de réversion épigénétique en combinaison avec des médicaments chimiothérapeutiques sur l'apoptose a également été évaluée en fonction de la tumeur statut p53
mutation

p53
gène

Résultats. mutations ont été trouvées dans 44 tumeurs gastriques primaires (27%), et super-haute méthylation de l'un des 3 gènes n'a été trouvée que dans les cas de type sauvage p53
. Supérieur p53
voie aberration a été trouvé dans les cas de sexe masculin (p = 0,003), type intestinal (p = 0,005), et le type non infiltrant (p = 0,001). Le p53
groupe voie d'aberration présentaient moins de récidives dans les ganglions lymphatiques, des organes éloignés, et le péritoine que le groupe non d'aberration p53
. Dans la lignée cellulaire de cancer gastrique NUGC4 ( p53
de type sauvage), le traitement épigénétique apoptose augmentée par des médicaments chimiothérapeutiques, en partie par p53
activité de transcription. D'autre part, dans la ligne KATO III des cellules cancéreuses ( p53
mutant), le traitement épigénétique seule l'apoptose induite robuste, sans trans-activation de p53
.

Conclusion

Dans le cancer gastrique, p53
filières pertinentes et non pertinentes existent, et les tumeurs avec les deux types de voie présentaient des caractéristiques cliniques uniques. traitements épigénétiques peuvent induire l'apoptose en partie par p53
activation, mais leurs effets apoptotiques peut être expliquée en grande partie par un mécanisme autre que par p53
voies

Citation:. Waraya M, Yamashita K, Ema a, Katada N, Kikuchi S, Watanabe M (2015) Association exclusive de p53
Mutation avec super-High méthylation de gènes suppresseurs de tumeurs dans le p53
Pathway dans un estomac unique Phénotype cancer. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10.1371 /journal.pone.0139902

Editeur: Qian Tao, l'Université chinoise de Hong Kong, HONG KONG

Reçu: 31 Mars 2015; Accepté le 18 Septembre 2015; Publié 8 Octobre, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Waraya et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention en aide pour la recherche sur le cancer du ministère de la Santé, du travail et des Affaires sociales du Japon et par la Fondation japonaise pour la Traitement multidisciplinaire du cancer. Les organismes de financement ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données, ou d'analyse; dans l'interprétation des résultats; dans la préparation du manuscrit; ou dans la décision de soumettre le manuscrit pour publication

Intérêts concurrents:. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

méthylation de l'ADN joue un rôle central dans. silençage génique des gènes suppresseurs de tumeur dans le cancer humain. Un gène de méthylation spécifique du cancer est une entité rare, et l'aberration fréquente de la méthylation dans les tissus tumoraux primaires est encore plus rare [1, 2]. Nous avons identifié des gènes méthylés spécifiques du cancer dans chaque organe en utilisant un microréseau pharmacologique démasquage (PUM) [1, 2] et un PUM modifié [3-5]. Nous avons identifié de nombreux gènes suppresseurs de tumeur candidat (STG), tels que PGP9
. 5
dans la tête et le cou carcinome épidermoïde (CETC) [2], de l'œsophage SCC (ESCC) [6] , le cancer gastrique [4], et d'autres cancers [7], NMDAR2B
en ESCC [3] et le cancer gastrique [8], et CCNA1
dans CETC [2]. Les profils de méthylation de ces gènes ont été validés par d'autres groupes et /ou même dans d'autres cancers [9-14]. Les gènes qui ont montré plus de 60% de méthylation dans les tissus tumoraux ont été désignés comme des gènes hautement pertinentes méthylés (les HRMGs) [15]. De plus, nous avons encore comparé la fréquence de cette méthylation aberrante de HRMGs candidats avec d'autres rapports de cancer gastrique [16], et des gènes candidats ont été réduites à des gènes spécifiques.

Plus important encore, ces gènes suppresseurs de tumeur candidats avaient été rapporté que dans le p53
voie suppresseur de tumeur (figure 1). Par exemple, PGP9
. 5
interagit directement avec p53
et stabilise p53
en inhibant sa dégradation par la voie d'ubiquitination dans hépatocellulaire [17] , du sein [18], et le cancer du nasopharynx [19]. NMDAR2B
induit l'apoptose par son interaction directe avec DAPK
[20], qui, à son tour, a été démontrée pour contrer la transformation induite par l'oncogène en activant un p19ARF
/ p53
-dépendantes checkpoint apoptotique [21]. CCNA1
est un p53
gène qui médie l'apoptose induite, G2 /M arrestation, et la catastrophe mitotique dans rénale humaine, de l'ovaire, et les cellules de cancer du poumon [22]. Par conséquent, le p53
voie est ablatée dans les tissus tumoraux des cancers primaires de manière épigénétique avec type sauvage p53
, mais il n'a pas eu de rapport sur l'association de p53
mutation et altérations épigénétiques dans les tissus tumoraux primaires.

dans cette étude, nous avons étudié l'état de méthylation de l'ADN des gènes dans le p53
voie qui sont anormalement régulée de manière épigénétique gastrique primaire cancer, et comparé leur modèle de méthylation avec le p53
état de mutation afin de déterminer la signification clinique de p53
aberration phénotypes.

cellule

Méthodes lignes et des échantillons de tissus

les lignées cellulaires de cancer gastrique, KatoIII, NUGC4, AZ521 et SH10 ont été achetés à partir du RIKEN BioResource Center (Ibaraki, Japon). Et la lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire HepG2 a été acheté auprès de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Ces lignées cellulaires, à l'exception AZ521 et HepG2 ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA) complété avec du sérum bovin fœtal à 10%. AZ521 et HepG2 ont été cultivées dans un milieu DMEM (GIBCO), complété avec 10% de FBS
.

Paires (n = 163) de, (FFPE) tissu tumoral inclus en paraffine fixés au formol et des spécimens muqueuses normales obtenues au correspondant moins 5 cm du bord de la tumeur ont été obtenus chez des patients subissant une chirurgie entre le 1er Janvier 2000, et le 31 Décembre 2010. Tous les patients de stade II /III GC avait subi une résection potentiellement curative pour la GC primaire, et a subi adjuvant S -1 chimiothérapie après la chirurgie (S-1 traitement standard). traitement néo-adjuvant n'a pas été effectuée dans cette cohorte de patients. Les tumeurs ont été classées selon la classification TNM selon le 7 ^{e édition de l'Union internationale contre le cancer (UICC) et le 14 e édition de la classification japonaise de gastrique Carcinome (JCGC). Les caractéristiques des patients sont représentés dans le tableau 1. Tous les échantillons de tissus ont été prélevés à l'hôpital universitaire de Kitasato, et le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients et les donneurs sains avant le prélèvement des échantillons. La présente étude a été approuvée par le Comité d'éthique de l'Université Kitasato.}

Analyse des mutées p53
gènes en utilisant le polymorphisme de conformation simple brin (SSCP)

Les mutations dans les exons 5, 6, 7 et 8 de la p53
gène ont été criblés par un seul brin polymorphisme conformation (SSCP) non radioactif, qui a été réalisée en utilisant nos méthodes précédemment établies [23]. Des échantillons de produit de PCR de 10 ul ont été dilués trois fois avec un tampon de gel de charge (95% formamide désionisé, 20 mmol /L d'EDTA, 0,01% bleu de bromophénol, et 0,01% de xylene cyanol) et chauffés à 95 ° C pendant 10 min, suivi d'une trempe sur la glace. Des aliquotes de 3 ul ont été appliqués à des gels modifiés de Polyacrylamide (de PAFG: 18% de polyacrylamide-bis (49: 1), 0,5 x TBE, 10% de glycerol, 10% de formamide, 0,05% de persulfate d'ammonium et 30 ml de TEMED) de dimensions 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. L'électrophorèse a été réalisée avec un tampon TBE 1,5x fonctionnant à 500 V et 30 mA pendant 1 heure à température ambiante. Les bandes ont été détectées par coloration des gels en utilisant une coloration à l'argent plus kit (Bio-Rad, Hercules, CA), suivie par la fixation, le rinçage, le développement et l'arrêt de la réaction. bandes mutées détectées avec la PCR-SSCP sont évidents à la dilution de 1:64 allèles mutés.

Le traitement au bisulfite de l'ADN extrait

ADN génomique provenant de tissus FFPE et des lignées cellulaires a été extrait en utilisant le QIAamp DNA FFPE kit de tissu (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) et le kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN) selon les protocoles du fabricant. Pour l'ADN dénaturant, 2 pg d'ADN génomique ont été mises en incubation avec 5 ug d'ADN de sperme de saumon /l de NaOH 0,3 molaire pendant 20 minutes à 50 ° C. L'échantillon d'ADN a ensuite été dilué avec 500 ul d'une solution contenant du métabisulfite de sodium /l à 2,5 mol (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l d'hydroquinone (Sigma) /solution d'hydroxyde de sodium /l à 0,4 mol, et a été mis en incubation à 70 ° C pendant 1,5 heures. L'échantillon a ensuite été appliqué à une colonne (Assistant DNA Clean System-UP, Promega Inc., Madison, WI), incubées avec NaOH /l 0,3 mol pendant 10 minutes, et ensuite avec 3 mol /l d'acétate d'ammonium pendant 5 minutes. L'échantillon a été précipité dans 100% d'éthanol, et l'ADN a été remis en suspension dans 50 pi lote contenant 10 uM de Tris-HCl, pH 8 et 2,5 uM éthylènediaminetétraacétique l'acide acétique (EDTA), pH 8, et a ensuite été amplifié par une chaîne par polymérase la réaction (PCR). les résultats du traitement au bisulfite de la modification chimique de non méthylées, mais pas les cytosines méthylées, à uraciles, ce qui permet la distinction entre l'ADN génomique méthylé et non méthylé.

spécifique de la méthylation quantitative par PCR (Q-MSP)

Pour l'analyse quantitative de la méthylation, TaqMan PCR spécifique de méthylation (MSP-Q) a été réalisée en utilisant l'iQ ™ multiplexe Powermix (Bio-Rad) en triple exemplaire sur le iCycler iQ ™ en temps réel au système de détection par PCR (Bio-Rad). Les conditions de PCR et les séquences sont fournies dans le tableau S1. Des dilutions en série de bisulfite modifiées CpGenome ADN méthylé universel (Chemicon International, Temecula, CA) ont été utilisés pour construire la courbe d'étalonnage sur chaque plaque en tant que témoins positifs et méthylation de l'ADN non méthylé CpGenome universel (Chemicon International) a été utilisé comme témoin négatif. La valeur de la méthylation (valeur TaqMeth) a été définie comme le rapport de méthylé PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
, ou DAPK
normalisé à méthylé β-actine
, qui a ensuite été multiplié par 100.

coloration immunohistochimique de PGP9.5, NMDAR2B et CCNA1

pour immunocoloration, démasquage antigénique a été effectuée avec le trempage autoclave, l'activité de peroxydase endogène a été bloquée par incubation dans 3% de H _{2 O 2 /méthanol pendant 5 minutes, et la liaison d'anticorps non spécifique est bloquée par incubation avec 1% dilué du sérum de cheval normal 30 minutes. Les coupes ont été ensuite mises en incubation à 4 ° C pendant une nuit avec les anticorps suivants: anticorps de lapin PGP9.5 polyclonal (une dilution de 1:. 200, Nonus Biogenesis), un anticorps de lapin NMDAR2B polyclonal (dilution de 1: 100, Millipore), ou une souris cycline A anticorps monoclonal (6E6, dilution de 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Les complexes immuns ont été détectés avec le kit Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) selon les instructions du fabricant. Ces complexes immuns ont été détectés en utilisant le substrat de 3,3'-diaminobenzidine (Vector) comme chromogène (PGP9.5 1,5 minutes, 6 minutes, NMDAR2B CCNA1 10 minutes). Les articles ont été contre l'hématoxyline.}

traitement épigénétique avec 5-aza-dC et TSA, et le traitement chimiothérapeutique avec CDDP

Les cellules ont été divisées et ensemencées à une faible densité (1x10 ^{6 /flacon T-75) 24 heures avant le traitement. Les cellules ont ensuite été traitées toutes les 24 heures pendant 4 jours avec soit 1 ou 5 pM de 5-aza-2'-désoxycytidine (5-aza-dC, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) dissous dans de l'acide acétique à 50% ou ont été mock traités avec du PBS, y compris la même quantité d'acide acétique. Comme indiqué, 100 nM de trichostatinA (TSA; Sigma-Aldrich). Et /ou 12,5 uM de Cis-diaminedichloroplatine (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japon) a été ajouté pour les dernières 24 heures}

analyse Western blot

la protéine totale a été extrait des lignées cellulaires qui ont été épigénétique traitées avec /sans traitement chimiothérapeutique, et a été soumis à une analyse par transfert de Western en utilisant les anticorps suivants: anticorps de souris monoclonal anti-p53 (1C12, dilution de 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) ou IgG _{anticorps 2a monoclonal anti-β-actine de souris (dilution de 1: 10000, Sigma-Aldrich)}

essai rapporteur p53

cellules (2x 10 ^{4 cellules /96 de la plaque puits) qui ont été épigénétique traités avec /sans traitement chimiothérapeutique ont été transfectées avec un vecteur p53
rapporteur (QIAGEN) en utilisant signal ™ Pathway Kits reporter ( QIAGEN) et le réactif Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Après 24 heures d'incubation, l'activité du rapporteur a été mesurée en utilisant le système de dosage de rapporteur Dual-luciferase (Promega). Les transfections ont été réalisées en triple et analysées en utilisant le logiciel SoftMax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).}

Apoptose test

Les cellules traitées (1x 10 ^{5 cellules /échantillon) ont été colorées avec Annexin V et 7-AAD (réactif Guava Nexin, Guava Technologies, Hayward, CA) pour la discrimination des cellules apoptotiques précoces et tardives, respectivement. L'expérience a été réalisée en utilisant le système PCA Guava, réalisée en triple et analysé à l'aide CytoSoft 2.1.5 logiciel (Guava Technologies).}

L'analyse statistique

test exact de Fisher ou de Mann-Whitney U test a été utilisé pour les variables catégorielles et étudiants de t
-test a été utilisé pour les variables continues. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (SD). La méthode de Kaplan-Meier a été utilisée pour estimer les taux cumulatifs de survie, et les différences dans les taux de survie ont été évalués en utilisant le test du log-rank. Relapse survie libre (RFS) et la survie globale (OS) ont été mesurées à partir de la date de l'opération à la date de la récidive et la mort, ou le dernier suivi. En ce qui concerne RFS ou OS, les patients qui ont survécu pendant plus de 60 mois (5 ans) ont été analysés comme des survivants. P < 0,05 a été considéré pour indiquer la signification statistique. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec des logiciels SAS (SAS Institute, Cary, NC).

Résultats

statut et de méthylation profils p53
gènes de PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
et DAPK
dans pStage II-III cancer gastrique

p53
mutations ont été identifiées dans 44 des 163 patients primaires gastriques de cancer (27%) par analyse de SSPC. mutation p53
gène n'a pas eu intérêt pronostique (figure 2A). Nous avons ensuite analysé les profils de méthylation de PGP9
. 5
, NMDAR2B
, CCNA1
et DAPK
dans ces tissus en utilisant Q-MSP. La valeur TaqMeth de tous les gènes était plus élevée dans les tumeurs primaires de cancer gastrique de type sauvage p53
que chez ceux avec mutant p53
(gène afin de méthylation:. PGP9
5
> NMDAR2B
> CCNA1
> DAPK
) (Fig 3A et S1 et S2 figures). La méthylation du promoteur de l'ADN était significativement plus élevée pour CCNA1
(p < 0,0001) et PGP9
5
(p = 0,03), et marginalement significativement plus élevé pour NMDAR2B
(p = 0,10) et DAPK
(p = 0,05) dans le cancer gastrique primaire par rapport à la muqueuse normale correspondante. Fait important, un niveau de méthylation super-haute de PGP9
. 5
, NMDAR2B
et CCNA1
a été exclusivement dans les tumeurs primaires sans p53
mutation, les valeurs TaqMeth coupure étaient 50, 163, et 133, respectivement (figure 3A). Cette méthylation super-haute de PGP9
. 5
, NMDAR2B
et CCNA1
a été trouvé dans 14, 19 et 8 échantillons respectivement, et certains de ces échantillons se chevauchaient (figure 3B). DAPK
ne pas afficher cette tendance, parce que le DAPK
niveau de méthylation était assez élevé dans les tissus de la muqueuse normale correspondant d'une partie considérable des cas (S2) Fig.

L'analyse immunohistochimique de PGP9.5, NMDAR2N et expression de la protéine CCNA1 dans le cancer gastrique primaire

la coloration immunohistochimique pour PGP9.5, NAMDR2B et expression de la protéine CCNA1 a ensuite été réalisée à la fois dans les cas avec des super-haute méthylation et ceux avec une faible méthylation de ces gènes. Une forte réduction de l'expression de PGP9.5, NMDAR2B et CCNA1 a été observé dans les tissus de cancer gastrique primaire lorsque la méthylation de l'ADN promoteur est super-haute (figure 3). D'autre part, aucune diminution de l'expression de la protéine de PGP9.5, NMDAR2B ou CCNA1 a été trouvé lorsque la méthylation de l'ADN de promoteur était faible (figure 4).

Analyse clinicopathologique dans le cancer gastrique primaire avec le stade pathologique II /cancer gastrique III avec un traitement standard

caractéristiques clinicopathologiques et le pronostic (5 ans RFS et OS) ont ensuite été analysées de manière univariée dans le cancer gastrique avec le stade pathologique II /III cancer gastrique avec un traitement standard (chirurgie, plus postopératoires S-1 'administration) (tableau 1). Nous avons classé les patients atteints de cancer gastrique dans 3 catégories en fonction de la p53
état de mutation ainsi que l'état de méthylation d'ADN de PGP9
. 5
, NMDAR2B
et CCNA1
, que nous avons désignés comme catégories génomiques et épigénétiques, respectivement (GEC). Ces trois catégories étaient p53
mutant, p53
type sauvage avec des super-haute méthylation (SHM) des 3 gènes p53
de la voie ci-dessus ( p53
WT /SHM), et p53
type sauvage sans (w /o) SHM ( p53
WT w /o SHM).

Fait intéressant, les groupes de patients classés en fonction sur GEC étaient significativement corrélées avec le sexe (p = 0,0003), l'âge (p = 0,08), l'histologie de Lauren (p = 0,005) et le modèle d'infiltration (p = 0,001), mais pas avec les facteurs pronostiques tels que les facteurs de mise en scène. Les groupes de patients classés selon GEC a également montré que p53
mutant et p53
groupes WT /SHM étaient similaires en termes du nombre des patients pour chaque caractéristique clinique, mais différaient à cet égard par rapport à la p53
WT w /o groupe SHM. Ainsi, nous avons récemment désigné les anciens groupes ( p53
mutant plus les p53
WT /groupes SHM) comme p53 groupe
d'aberration, et ce dernier groupe ( p53
WT w /o SHM) a été désigné comme p53
groupe non-aberration.

Bien que le pronostic était pas significativement différente entre les groupes classés en fonction de GEC (Fig 2B ), plus récurrences ont été trouvés dans le p53
groupe d'aberration par rapport à la p53
groupe non-aberration (tableau 1, aucune différence statistiquement significative). Cette tendance a été préservée en termes de modèle de récurrence de chacun des ganglions lymphatiques, du péritoine et des organes éloignés (tableau 2), ce qui suggère que le groupe p53
d'aberration est susceptible de présenter un phénotype clinique unique, même à partir d'un le point de vue pronostique. Lorsque seuls les cas de récidives ont été analysés, le groupe p53
aberration a de nouveau été associés de façon significative avec l'histologie de Lauren (tableau 2, P = 0,01), mais il n'y avait pas des motifs de récurrence qui étaient uniques à p53
aberration.

d'autre part, le type de cancer gastrique diffus a montré significativement meilleur pronostic que le type intestinal du cancer gastrique dans le p53 groupe
d'aberration (figure 5A). Étant donné que ces patients ont tendance à être distribué à un stade plus avancé, ces données de survie ont suggéré que la chimiothérapie S1 adjuvant postopératoire est plus efficace pour le type diffus cancer gastrique que pour le cancer gastrique de type intestinal dans les cas avec p53
voie aberration (Fig 5B).

Enfin, en tant que données de référence (tableau 1), l'analyse pronostique univariée pour RFS et OS de tous les patients identifiés facteurs pronostiques potentiels cliniquement significatifs représentant une faible survie tels que le sexe (P = 0,03, P = 0,1) , l'âge ≥67 ans (P = 0,009, P = 0,001), l'emplacement de la tumeur supérieure (P = 0,06, P = 0,1), le 14 ^{e JGCA /7 e UICC pT (P = 0,08, P = 0,4), le 14 e JGCA pN (P = 0,001, P = 0,06), et le 14 e JGCA /7 ème étape UICC (P <. 0,0001, P = 0,03)}

épigénétique traitement induite par p53 expression de la protéine, concordant avec l'activité p53 transcriptionnelle

traitement épigénétique des NUGC4 lignées cellulaires de cancer gastrique (type sauvage p53
) avec 5 pM de 5-aza-2' désoxycytidine ou 5 pM de 5-aza-2'-désoxycytidine, plus la trichostatine A induit une apoptose robuste en l'absence de l'agent chimiothérapeutique CDDP. Un traitement supplémentaire avec CDDP encore augmenté considérablement ces effets apoptotiques (figure 6C). Il est intéressant de CDDP en combinaison avec des traitements épigénétiques robuste a augmenté le niveau de la protéine p53, qui a partiellement, mais pas totalement, réfléchi p53
activité de transcription d'un gène rapporteur de la luciférase (figure 6A et 6B). Ces résultats suggèrent que p53
activité de transcription peut être réactivée par des traitements épigénétiques, mais il suggère également que l'apoptose est seulement partiellement induite par la p53
voie.

De plus, épigénétique le traitement des KATOIII lignées cellulaires de cancer gastrique (
p53 nul), avec 1 uM de 5-aza-2'-désoxycytidine ou 1 uM de 5-aza-2'-désoxycytidine, plus la trichostatine A induit une apoptose robuste en l'absence de CDDP, mais le traitement CDDP supplémentaire ne plus augmentent de manière significative les effets apoptotiques (figure 6C). CDDP en combinaison avec des traitements épigénétiques n'a pas augmenté le niveau de la protéine p53, qui se traduit par l'absence de p53
activité transcriptionnelle d'un gène rapporteur de la luciférase (figure 6A et 6B). Ces résultats suggèrent que l'activité p53
de transcription est pas nécessaire pour l'apoptose par des traitements épigénétiques dans les cellules KATOIII ( p53
cellules nulles).

Discussion

étude est le premier rapport que SHM de gènes suppresseurs de tumeurs dans le p53
voie se trouvent exclusivement dans le stade pathologique II /III cancer gastrique de type sauvage p53
(figure 3). Nous avons sélectionné pStage II /III patients atteints de cancer gastrique avec les traitements standards pour Analyse p53
de la voie, parce que les traitements multidisciplinaires chez ces patients ont le meilleur potentiel pour atteindre l'amélioration pronostique avec curabilité complète [24, 25]. Cette considération devrait être la première priorité lorsque l'on considère le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

méthylation presque complète du promoteur îles ADN CpG est nécessaire pour l'inactivation de gène complet, et même de faibles proportions d'allèles non méthylés peut robuste induire l'expression du gène [ ,,,0],1-5]. Dans les tissus tumoraux primaires, SHM doit représenter la méthylation presque complète dans les cellules cancéreuses, et SHM dans les tissus de la tumeur primaire a en effet été associée à l'expression de la protéine réduite de ces gènes (figure 4). Ce résultat suggère que SHM des gènes dans le p53
voie pourrait être fonctionnellement équivalent à aberration fonctionnelle de p53 qui se produit à la suite de p53
mutation, puisque ces 3 molécules fonction dans le même p53
voie.

dans le cancer gastrique, le p53
groupe d'aberration était significativement associé à des phénotypes clinicopathologiques uniques tels que l'histologie intestinale de Lauren, le sexe masculin, âgé de l'âge et la croissance moins infiltrante (tableau 1). Nos observations actuelles peuvent être liées à des rapports antérieurs qui ont démontré que p53
mutation est en corrélation avec le stade précoce du cancer gastrique de type intestinal, ou stade avancé du cancer de type diffus gastrique [26, 27], ou de l'âge des personnes âgées [ ,,,0],28] cependant, notre analyse clinicopathologique comprenait principalement le cancer gastrique de stade intermédiaire. Fait intéressant, la voie aberration est unique et soutenue même chez les patients récurrents (tableau 2).

pertinence pronostique positif de p53
mutation dans le cancer gastrique est controversée avec les deux partisans [29] et les dissidents [30 ] de cette possibilité. À première vue, nos données semblent soutenir ce dernier groupe, cependant, il devrait être pris en compte que nos données de survie est susceptible d'avoir été modifié par chimiothérapie adjuvante post-opératoire (traitement standard au Japon). Considérant que, contrairement à la présente étude, le type diffus du cancer gastrique a montré moins bon pronostic que le type intestinal du cancer gastrique dans nos décennies d'hôpital il y a [15, 31], les données de survie dernières mises à jour prennent en charge les résultats opposés (c.-à-intestinal type de cancer gastrique montre plus mauvais pronostic que le type de cancer gastrique diffus), qui est présumément en raison de S-1 effets adjuvants postopératoires [32]. Post-opératoire adjuvant S-1 chimiothérapie a été proposée pour être significativement plus efficace pour la maladie peritoneale que pour les métastases d'organes distants [24], et il est susceptible d'être plus efficace pour le type diffus cancer de l'estomac que pour le cancer gastrique de type intestinal [32] . Pour ces raisons, la dernière analyse de survie indique que le pronostic du type diffus du cancer gastrique est améliorée par rapport à celle du type intestinal du cancer gastrique.

Il n'y avait pas de différence statistique dans le taux de récidive ou dans le uniques sites de récurrence entre le groupe p53
d'aberration et de la le groupe non-aberration de p53, mais plus récurrences ont été trouvés dans chacun des sites de récurrence de la non-aberration
p53 groupe par rapport à la p53
groupe aberration. Ces résultats pourraient suggérer que le p53
groupe non-aberration a un phénotype plus agressif que le p53
groupe d'aberration dans son ensemble. Dans notre étude, le type de cancer gastrique diffus a montré significativement meilleur pronostic que le type intestinal du cancer gastrique dans le p53
groupe aberration. Étant donné que ces patients ont tendance à être distribué à un stade plus avancé, ces données de survie ont suggéré que S1 adjuvant postopératoire la chimiothérapie est plus efficace pour le type diffus cancer gastrique que pour le cancer gastrique de type intestinal dans les cas avec p53
voie aberration. Ces résultats étaient cohérents avec les rapports précédents que mutant p53
et /ou immunocoloration de la protéine p53 pourrait être des biomarqueurs prédictifs pour les effets positifs de la chimiothérapie néoadjuvante à haute dose dans le cancer gastrique [30].

Nous enfin évalué les effets du traitement épigénétiques en combinaison avec un agent chimiothérapeutique afin de comparer l'importance de la p53
voie à la voie épigénétique dans les cellules de cancer gastrique traités par CDDP. De façon inattendue, il est apparu que le p53
voie était peu probable à jouer un rôle très important dans l'induction de l'apoptose par CDDP (figure 6). Il a été récemment démontré que la carcinogenèse épigénétique est en effet possible. Dans ce système, iPS systémiques induites par la reprogrammation de facteurs résultats dans la survenue du cancer systémique avec des changements épigénétiques dynamiques, tandis que la réversion systémique de ces facteurs de reprogrammation revient cellules cancéreuses dans les cellules normales [33]. Le cancer gastrique est susceptible d'abriter moins de mutations de gènes du pilote [34] que le cancer colorectal [35], et, de même, des mutations autres que le p53
gène sont rares dans le cancer du sein [35], ce qui suggère que la carcinogenèse épigénétique est une possible étiologie majeure par infection chronique de Helicobacter pylori [36-38]. Nous avons récemment démontré l'hyper-méthylation de Reprimo
[39], ce qui est encore un gène dans le p53
voie, mais qui n'a pas pu être inclus dans cette étude, et de HopX
[16] et CDO1
[40] qui sont tous deux impliqués dans l'apoptose, mais putative pas par le p53
voie. Sur la base de nos expériences fonctionnelles actuelles, p53
voie de contribution à l'effet du traitement épigénétique est susceptible d'être beaucoup inférieure à celle des autres voies (figure 5). Nous avons utilisé d'autres lignées cellulaires (2 lignées cellulaires de cancer gastrique et 1 lignée cellulaire de cancer hépatocellulaire) pour déterminer avec précision la contribution de la p53
voie à l'apoptose induite par le CDDP en combinaison avec des traitements épigénétiques. Les expériences supplémentaires effectuées sont présentés dans S3 Fig. lignées cellulaires AZ521 et HepG2 sont p53
type sauvage et la lignée cellulaire de SH10 est p53
mutant. p53
activité a été détectée dans le p53
cellules de type sauvage, cependant, son activité était dépendante de chaque lignée cellulaire. Ainsi, p53
activité a été détectée dans les cellules NUGC4 avec traitement CDDP et dans les cellules AZ521 et HepG2 sans traitement CDDP. Forte apoptose évaluée par un test d'apoptose (Caspase 3 ou Nexin Assay) ne reflète pas nécessairement le degré de p53
activation de la transcription. Dans p53
mutant (SH10) ou cellules nulles p53
, p53
activité transcriptionnelle n'a pas été induit du tout, mais l'apoptose a été jugée similaire à celle de p53
cellules de type sauvage. Par conséquent, dans le cancer gastrique, les voies apoptotiques autres que le p53
voie peut être plus pertinent pour l'induction de l'apoptose que le p53
voie.

En conclusion, p53
aberration et des groupes de patients non-aberration existent dans le cancer gastrique, le p53
voies pourrait être aberrante à la suite de la modification épigénétique des gènes dans les voies ainsi que due à la mutation génomique. Le p53
groupe d'aberration peut présenter des caractéristiques cliniques uniques par rapport à la p53
groupe non-aberration. le contrôle épigénétique de gènes p53
de la voie jouent un rôle mineur dans induction de l'apoptose par un agent chimiothérapeutique, et l'apoptose dans le cancer gastrique qui est induite par la réversion épigénétique peut être expliquée en grande partie par un mécanisme autre que le p53
voie. Ainsi, le p53
voie est peu probable à jouer un rôle central dans l'apoptose induite par le CDDP en combinaison avec des traitements épigénétiques. Cependant, le p53
voie a été signalé à jouer un rôle important dans la carcinogenèse gastrique naturelle [41-44]. Ainsi, notre découverte que p53
gène de la voie méthylation a été exclusivement dans le cancer gastrique avec un p53
état de type sauvage peut-être une observation importante, et ces altérations dans les tissus tumoraux peut provoquer la progression tumorale . Il est pour ces raisons que p53
voie d'aberration peut avoir une valeur prédictive des effets chimiothérapeutiques dans le cancer gastrique.

Informations complémentaires
S1 Fig. Spécificité de la méthylation de PGP9
. 5
, NMDAR2B
et CCNA1
dans le cancer gastrique.
(A) Les valeurs TaqMeth de chaque gène dans le cancer gastrique et la muqueuse normale correspondante sont représentés. (B) Les valeurs TaqMeth de chaque gène classés selon le p53
état du gène de la tumeur sont représentés. Les données sont exprimées en moyenne ± SD
doi:. 10.1371 /journal.pone.0139902.s001
(TIF)
S2 Fig.

• PLOS ONE: Expression dérégulée du SRC, LYN et CKB kinases par méthylation de l'ADN et de son rôle potentiel dans le cancer gastrique et envahissement Métastase
• PLOS ONE: la variation génétique dans la région 3-Untranslated de NBN Gene est associée à des risques de cancer gastrique dans une population chinoise