PLOS ONE: PFTK1 Favorise cancer gastrique Progression de régulation de la prolifération, la migration et l'invasion

Résumé

PFTK1, également connu sous PFTAIRE1, CDK14, est un nouveau membre de kinases de sérine /thréonine protéine Cdc2 liées. Des études récentes montrent que PFTK1 est fortement exprimé dans plusieurs tumeurs malignes telles que le carcinome hépatocellulaire, le cancer de l'oesophage, le cancer du sein, et impliqué dans la régulation du cycle cellulaire, les tumeurs prolifération, la migration et l'invasion qui influencent davantage le pronostic de tumeurs. Toutefois, l'expression et physiologique signification de PFTK1 dans le cancer gastrique restent peu claires. Dans cette étude, nous avons analysé l'expression et la signification clinique de PFTK1 par Western blot dans 8 appariés tissus frais gastriques de cancer, les tissus de la muqueuse gastrique et non tumoral immunohistochimie sur 161 tranches paraffinembedded. expression haute PFTK1 était corrélée avec le grade de la tumeur, l'envahissement ganglionnaire, ainsi que Ki-67. À travers le kit cellule de comptage (CCK) -8 dosage, la cytométrie en flux, des analyses formation de colonies, la guérison des plaies et Transwell, les études in vitro ont démontré que PFTK1 surexpression favorisé la prolifération, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques, tandis que PFTK1 effet de choc a conduit à des résultats opposés. Nos résultats pour la première fois pris en charge que PFTK1 pourrait jouer un rôle important dans la régulation de la prolifération du cancer gastrique, la migration et fournirait une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse contre le cancer gastrique humaine

Citation:. Yang L, Zhu J, Huang H, Yang Q, Cai J, Wang Q, et al. (2015) PFTK1 Favorise cancer gastrique Progression de régulation de la prolifération, la migration et l'invasion. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10.1371 /journal.pone.0140451

Editeur: Keping Xie, l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center, ETATS-UNIS

Reçu: 7 mai 2015; Accepté le 25 Septembre 2015; Publié le 21 Octobre, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Yang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de Chine (n ° 81302285, n ° 81402015)

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré que aucun conflit d'intérêts existent.

introduction

le cancer gastrique est la quatrième tumeur maligne la plus fréquente et la deuxième cause de mortalité liée au cancer dans toutes sortes de cancers dans le monde [1]. Il est difficile de guérir à moins qu'il ne se trouve à un stade précoce [2]. En raison du manque de spécificité, le taux de diagnostic précoce est faible et la majorité des patients atteints de cancer gastrique sont au stade de la mi-fin lorsque le diagnostic. 40% -60% des patients atteints de cancer gastrique reçu le cancer gastrique opération radicale aura souvent récidive postopératoire et les métastases, ces caractéristiques affectent gravement la survie à long terme chez les patients atteints de cancer gastrique [3,4]. Malgré une grande promotion de nouvelles stratégies de diagnostic et de traitement du cancer de l'estomac, les mécanismes moléculaires exacts du cancer gastrique reste mal à comprendre. Ainsi, l'identification du mécanisme moléculaire au cours de la progression du cancer de l'estomac et les métastases peut fournir aux patients des stratégies diagnostiques et thérapeutiques.

PFTK1 (également connu sous le nom PFTAIRE1, CDK14) est un nouveau membre de la sérine /thréonine liée Cdc2 les protéines kinases qui est d'abord identifié dans le système nerveux de la souris et est un régulateur essentiel de cyclines et cycle cellulaire [5,6]. Peu d'études ont été réalisées pour caractériser sa fonction physiologique ou de l'importance biologique. Il est rapporté que PFTK1 est fortement exprimé dans le cerveau, le pancréas, le rein, et de l'ovaire. CDK se lient à la boîte de cycline spécifique pour former des complexes protéine kinase fonctionnelle et régulée en partie par sa localisation subcellulaire [7]. Par exemple, la cycline Y, une nouvelle cycline associée à la membrane, coopère avec PFTK1 augmente l'activité de la kinase PFTK1 et recrute PFTK1 à la membrane plasmique [8]. PFTK1 interagit avec la cycline B2 co-localisation dans le noyau dans le carcinome hépatocellulaire [9]. La fonction fondamentale du PFTK1 est signalée comme une kinase dépendante de la cycline (CDK), la régulation de la progression du cycle cellulaire et la prolifération des cellules en interagissant spécifiquement avec les membres des protéines de la cycline, tels que la cycline D3 (CCND3), cycline Y (CCNY) et forme un complexe ternaire avec le cycle cellulaire inhibiteur p21, phosphoryle ainsi le suppresseur de tumeur Rb pour transition G1 /S [10]. Knock-out de la cycline Y dans des lignées cellulaires de gliome rend le cycle cellulaire bloqué dans la période S [11]. Cycline Y interagit avec PFTK1 ajuster phase M de la mitose [12]. Ces résultats impliquent que PFTK1 ensemble peut fonctionner comme un promoteur de tumeur par l'intermédiaire de la régulation du cycle cellulaire. Entre-temps, plusieurs études ont démontré que PFTK1 a également d'autres fonctions importantes. PFTK1 modulant la différenciation des oligodendrocytes par voie PI3K /AKT [13]. Récemment PFTK1 confère HCC motilité cellulaire par inactiver la fonction de suppression motile liant l'actine de TAGLN2 via la phosphorylation [14]. PFTK1 permet une phosphorylation à médiation par l'association de filaments CaD de la F-actine, conduisant à l'amélioration de la polymérisation des fibres de stress d'actine, favorisant ainsi la migration et l'invasion cellulaire dans les cellules HCC [15,16]. La surexpression de PFTK1 peut conférer un phénotype motile dans les hépatocytes malignes [9]. En accord avec les résultats moléculaires, CCNY et /ou PFTK1 seul peut activer la signalisation Wnt non canonique pour améliorer la motilité cellulaire dans les cellules de CHC [17]. Toutes ces études impliquent que PFTK1 peut être impliqué dans la prolifération cellulaire et de la motilité, mais l'expression et la signification de PFTK1 dans les cellules de cancer gastrique sont encore obscures.

Dans notre étude, nous avons cherché à mener une analyse complète de expression PFTK1 et son rôle de pronostic dans les cellules de cancer gastrique. Nous avons examiné l'expression de PFTK1 et son association avec les caractéristiques cliniques et Ki-67 par Western blot et immunohistochimie (IHC). Notre étude a montré que PFTK1 augmentation de la prolifération, la migration et l'invasivité de cellules de cancer gastrique par la CCK-8, le flux des analyses de cytométrie, des analyses de formation de colonies, Transwell dosage, affecté l'expression des protéines apparentées. Ces résultats ont d'abord été signalées dans des cellules de cancer gastrique et peuvent fournir un nouvel aperçu dans le développement de thérapies expérimentales dans le cancer gastrique.

Des échantillons de tissus de Matériels et méthodes

Cent soixante -one échantillons de tissus du cancer gastrique et les tissus non cancéreux adjacents appariés ont été sélectionnés parmi les patients ayant subi une chirurgie entre 2007 et 2013 au Département de pathologie, Hôpital de la tumeur Nantong. Ces tissus ont été stockés à -80 ° C immédiatement après l'ablation chirurgicale. Pour un examen histologique, tous les échantillons de tissus gastriques ont été fixés dans du formol tamponné à 10% et inclus dans la paraffine pour sectionner. spécimens réséqués ont été classés en fonction de la septième édition de la classification TNM pour le cancer gastrique [1] .Toutes les informations clinicopathologique comprenaient l'âge, le sexe, la profondeur d'infiltration, de l'état de différenciation, envahissement ganglionnaire, l'invasion du nerf et le stade TNM. L'approbation de tissus prélevés à des fins de recherche a été obtenu à partir de l'hôpital comité d'éthique de Nantong de la tumeur. consentement éclairé signé a également été obtenu à partir de chaque patient. Les principales variables cliniques et pathologiques ont été résumées dans le tableau 1.

Western blot analyse

test Western blot a été utilisé pour détecter certaines protéines [18-20]. Tout d'abord, les tissus et les cellules caner gastriques ont été craqués dans un tampon de lyse (1 M de Tris-HCl pH 7,5, 1% de Triton X-100, 10% de sulfate de sodium (SDS), 1% de NP-40, 0,5 M d'EDTA, 0,5% de sodium désoxycholate, 10 pg /ml d'aprotinine, 1 mM de PMSF, 10 pg /ml de leupeptine), puis on centrifuge à 10 000 x g pendant 30 minutes pour récupérer le surnageant. Le surnageant a été dilué dans 2 x tampon de charge de SDS et on fait bouillir. Une quantité équivalente de protéines à partir de chaque échantillon ont été soumis à une électrophorèse de 10% de sodium dodécyl électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) puis transférés sur un fluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore, Bedford, MA). Ensuite, les membranes ont été bloquées pendant 2 h à température ambiante, puis incubées pendant une nuit à 4 ° C avec les anticorps primaires. Après lavage avec du tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,1% de Tween 20 trois fois, chacune pendant 5 min, les membranes ont été ensuite mises en incubation avec la peroxydase de raifort liée à une IgG en tant que l'anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. Les membranes ont ensuite été développées en utilisant les systèmes de détection ECL (Imaging Technology, Ontario, Canada). Les anticorps utilisés dans cette étude comprenaient: l'anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-cycline E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-PCNA (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-caténine (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl1 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, Cell Signaling), anti-MMP2 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology).

immunohistochimique analyses

en bref, des coupes de tissus ont été déparaffinées dans du xylène et réhydratées par éthanols graduées. Ensuite, les sections trempées dans 3% de peroxyde méthanolique pendant environ 10 minutes pour bloquer l'activité de peroxydase endogène. Par la haute pression et la température dans un autoclave, son immunoréactivité a été améliorée dans un tampon de citrate 0,1 M pendant 3 min. Des sections de tissu ont été incubées avec l'anticorps anti-PFTK1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) et anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) pendant 120 minutes à la température ambiante. Selon les instructions du fabricant, après lavage dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), les tissus ont été incubés avec la peroxydase de raifort conjuguée à un polymère Ig anti-souris comme anticorps secondaire (kit Envision, Dako) pendant 20 min à température ambiante. Enfin, les lames ont été contre l'hématoxyline, déshydratées, et monté sur la montagne de résine. Pour quantifier PFTK1 et Ki-67 l'expression des protéines, à la fois l'étendue de l'immunoréactivité et l'intensité ont été évalués et notés. Cinq champs de forte puissance ont été choisis au hasard pour chaque section et au moins 300 cellules ont été comptées par champ. Pour une analyse statistique de PFTK1, chaque lame a été évaluée en utilisant un système de notation pour les deux semi-quantitative de l'intensité de la coloration et le pourcentage de cellules malignes positives. Les cellules ont été notés comme suit: 1 (cellules ≤25 en% tumorales colorées), 2 (26% des cellules tumorales -50% coloré), 3 (51% des cellules tumorales -75 en% coloré), 4 (76% de cellules à 100% de tumeurs coloré). Pour l'évaluation de la densité: 1 faible coloration; 2 coloration modérée; 3 forte coloration. Ensuite, nous avons multiplié les deux scores et de les classer en deux groupes: une faible expression et de haute expression. En ce qui concerne l'analyse statistique de Ki-67, < cellules 50% tumorales colorées aussi faible expression et ≥50% des cellules tumorales colorées aussi élevé expression. Afin d'éviter des erreurs techniques, la coloration a été répétée trois fois et des résultats similaires ont été obtenus.

Cultures cellulaires et transfection transitoire

MGC803 et HGC27 étaient des lignées de cellules gastriques, qui ont été achetés à partir de la bibliothèque de cellules de l'Académie chinoise des sciences. Tous deux ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). SGC7901 et GES1 étaient encore gastriques lignées cellulaires qui ont été gracieusement fournis par le Département de Pathologie de recherche de l'Université de Nantong. SGC7901 et GES1 ont été cultivées dans du milieu DMEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). Tout le milieu ont été faites avec du sérum de veau fœtal à 10% (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) additionné de 2 mM de L-glutamine, 100 U /mélange de pénicilline-streptomycine ml (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA ), à 37 ° C et 5% de CO _{2. PFTK1 petits ARN interférents (siRNA) ont été conçus et synthétisés par Shanghai Genechem (Chine). SiRNA ciblant des séquences PFTK1 étaient les suivantes: 5'-GTTCATTCTTTACCACATT-3 ', 5'-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3', 5'-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 ', 5'-ACCCATACAGGAAATCCAA-3'. Le plasmide Flag-PFTK1 a été acheté à Shanghai Genechem (Chine). Lipofectamine 2000 réactif de transfection (Life Technologies) a été utilisé pour les cellules transfection suivant les instructions du fabricant.}

Débit d'analyse cytométrique

Tout d'abord, toutes les lignées cellulaires gastriques ont été fixés dans 70% d'éthanol pendant une nuit à -20 ° C C. en second lieu, après avoir lavé par un tampon citrate-phosphate et du PBS, les cellules ont été mises en incubation avec 1 mg /ml de RNase A pendant 30 min à 37 ° C. Ensuite, les cellules ont été colorées avec 50 pg ml d'iodure de propidium /saline tamponnée au phosphate (PBS) -Triton pendant 20 min à 4 ° C. Enfin, les cellules ont été analysées en utilisant un cytomètre de flux Becton Dickinson FACScan BD (San Jose, CA) et CellQuest programmes d'analyse d'acquisition. L'expérience a été réalisée trois fois.

Colony tests de formation

MGC803 cellules ont été cultivées en culture à six puits plaques (Corning, Corning NY) à une densité de 200 cellules /puits après la transfection PFTK1 #siRNA et Flag-PFTK1 selon les instructions du fabricant. Au bout de deux semaines, les colonies cellulaires (≥ 50 cellules /colonie) ont été comptées par coloration avec 0,5% de violet cristallisé.

dosages de prolifération cellulaire

MGC803 cellules normales, qui comprennent la transfection de siRNA # PFTK1 et Flag-PFTK1 ont été ensemencées sur 96 puits grappe de culture cellulaire plaques (Corning, Corning NY) à une densité de 2 x 10 ^{4 cellules /puits dans 100 ul de la culture et cultivée pendant une nuit. Selon les instructions du fabricant, les cellules ont été mesurées en utilisant un spot de CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japon). CCK-8 réactifs ont été ajoutés à chaque puits pendant 2 heures d'incubation à 37 ° C. L'absorbance a été lue à la longueur d'onde de 450 nm dans un lecteur de plaque automatisé. Les expériences doivent répéter au moins trois fois.}

Wound guérison dosage

MGC803 cellules ont été cultivées en culture à six puits plaques (Corning, Corning NY) à une densité de 5 x 10 ^{5 cellules /puits et cultivées jusqu'à la confluence du jour au lendemain. Après transfection 48 heures, les cellules ont été incubées avec du milieu sans sérum. Une ligne a été rayée dans la couche cellulaire conflent en utilisant l'extrémité de la FIE d'une pointe de 10 ml de pipette (temps 0) et les cellules ont été lavées avec du PBS. Images de cellules migrantes ont été successivement prises après 24 h, 48 h lors de la fermeture de la région blessée.}

Trans-well test de migration

test de migration des cellules a été réalisée en utilisant Transwell chambre (taille des pores de 8,0 lm; Costar, Cambridge, NY, USA). Environ 1 x 10 ^{5 cellules /ml ont été ensemencées dans les chambres supérieures dans le milieu et le milieu RPMI-1640 ont été ajoutés aux chambres inférieures. Au bout de 24 h, les cellules supérieures qui ne sont pas migré ont été retirés et les cellules inférieures qui ont migré ont été fixées avec du paraformaldehyde et colorées avec du cristal violet. Le nombre de cellules qui migrent dans 5 champs a été compté sous un grossissement de 200 x, et les moyens de chaque chambre sont déterminées. Toutes les expériences ont été répétées trois fois}

Trans-well test d'invasion

test de migration des cellules a été réalisée en utilisant Transwell chambre (la taille des pores de 8,0 lm; Costar, Cambridge, NY, USA).. BD MatrigelTM membrane basale Matrix a été ajouté à la chambre supérieure pendant 1 h à 37 ° C. Ensuite, 500 ul de milieu contenant le facteur chimiotactique a été placé dans la chambre inférieure. Environ 1 x 10 ^{5 cellules /ml ont été ensemencées dans les chambres supérieures à 37 ° C pendant 24 h.Cells ont ensuite été fixées avec du paraformaldehyde et colorées avec du cristal violet. Toutes les expériences ont été répétées trois fois.}

L'analyse statistique

Toutes les analyses statistiques ont été ont été effectuées en utilisant les statistiques SPSS 19 progiciel. Le PFTK1, Ki-67 expression et les caractéristiques clinico-pathologiques ont été analysées à l'aide du χ ^{Test 2. courbes de survie globale ont été calculés avec la méthode de Kaplan-Meier et ont été testés avec le test du log-rank. L'analyse multivariée a été analysé par des risques proportionnels de Cox modèle, le ratio de risque et son intervalle de confiance à 95% ont été enregistrés pour chaque marqueur. Les valeurs ont été exprimées en moyenne ± SE, et P
< 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.}

Résultats

PFTK1 est surexprimé dans les tissus tumoraux gastriques

Il est rapporté que PFTK1 est une importante kinase dépendante de la cycline qui peut réguler le cycle cellulaire, mais la recherche sur le cancer gastrique n'a jamais été étudiée. Etant donné que la surexpression de PFTK1 a été trouvé dans le cancer du foie et le cancer de l'œsophage par rapport aux tissus normaux. il est donc intéressant d'analyser l'expression de PFTK1 dans les tissus tumoraux gastriques et son coorelation avec antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA). Tout d'abord, nous avons examiné l'expression de PFTK1 en 8 paires de tissus tumoraux gastriques et leurs tissus de la muqueuse gastrique non tumoral correspondant par Western blot. Comme on le voit sur la figure 1, par rapport à des tissus normaux adjacents, une régulation positive de PFTK1 a été détectée dans huit tissus gastriques en accord avec PCNA. Afin de confirmer la signification clinique de PFTK1 dans la progression du cancer de l'estomac, immunohistochimique (IHC) analyses a été utilisé pour observer l'expression de la protéine PFTK1 dans 161 tissus de cancer gastrique. Comme prévu, l'expression de PFTK1 et le grade de la tumeur ont été négativement liée. PFTK1 avait une expression significativement plus élevée dans les échantillons différenciés mal que les spécimens dans bien différenciés, ce qui était compatible avec Ki-67. PFTK1 a été exprimée dans la membrane cellulaire, tandis que le cytoplasme, Ki-67 principalement dans le noyau. Le résultat est représenté sur la figure 2. Ensuite, nous avons étudié la corrélation entre PFTK1 et Ki-67 par le coefficient de corrélation de Pearson. On peut voir sur la figure 3A que PFTK1 était positivement associée à Ki-67 (le γ de Pearson = 0,833, P
< 0,001).

PFTK1 est associée à des caractéristiques cliniques défavorables et tumeur gastrique pauvres survie

l'étude de l'association clinique des patients a été explorée pour analyser la corrélation des PFTK1 avec cancer gastrique caractéristiques clinico parmi 161 tissus. Les données clinico ont été répertoriés dans le tableau 1. Une expression élevée de PFTK1 était lié avec le grade de la tumeur ( P
= 0,009), la profondeur d'infiltration ( P
= 0,002), l'invasion des ganglions lymphatiques ( P
= 0,000), ainsi que Ki-67 ( P
= 0,000). Mais il n'y avait pas de corrélation entre l'expression PFTK1 et d'autres variables cliniques, tels que l'âge, le sexe, l'invasion de nerf, et le stade TNM.

En outre, l'analyse de Kaplan-Meier a été utilisée pour analyser l'association entre l'expression PFTK1 et 161 la survie des patients. Selon les courbes de survie, une expression élevée de PFTK1 était évidemment en corrélation avec la survie globale pauvres, alors que la faible expression de PFTK1 était corrélée à une meilleure survie globale. Et le temps de survie et de risque ratio médian a été montré dans la figure 3B. En outre, l'analyse univariée dans les tissus de cancer gastrique a montré que le grade tumoral ( P
= 0,020), la profondeur d'infiltration ( P
= 0,011), l'invasion des ganglions lymphatiques ( P
= 0,011), le stade TNM (P = 0,031), expression PFTK1 ( P
= 0,002), et Ki-67 expression ( P
= 0,013) étaient des facteurs pronostiques de survie globale (tableau 2 ). L'analyse multivariée en utilisant le modèle des risques proportionnels de Cox a suggéré PFTK1 était un des indicateurs pronostiques indépendants de la survie globale des patients ( P
= 0,048, tableau 3). Pour résumer, nos résultats ont démontré que l'expression de PFTK1 est significativement associée à des caractéristiques cliniques et la survie globale pauvres.

L'expression de PFTK1 dans les cellules de cancer gastrique non transfectées et transfectées

Comme PFTK1 est surexprimé dans les tissus tumoraux gastriques, puis on a analysé l'expression de PFTK1 dans des lignées cellulaires, y compris MGC803, SGC7901, HGC27, GES1. De la figure 4A, l'expression de PFTK1 dans la lignée cellulaire gastrique normale GES1 était plus faible que dans les lignées cellulaires gastriques MGC803, SGC7901, HGC27. Pour étudier davantage la fonction de PFTK1 dans les cellules de cancer gastrique in vitro,
MGC803 cellules ont été transfectées avec PFTK1-siRNA et SGC7901 cellules ont été transfectées avec Flag-PFTK1. Western blot a été utilisé pour mesurer l'expression de PFTK1. Quand Flag-PFTK1 a été transfecté dans SGC7901, PFTK1 avait une expression plus élevée (figure 4B). Alors que PFTK1-ARNsi a été transfecté dans MGC803, PFTK1-ARNsi n ° 4 a atteint le rendement le plus élevé effet de choc par rapport aux autres PFTK1-siRNA (figure 4C). Donc, nous avons choisi le drapeau-PFTK1 et PFTK1-siRNApour poursuivre les expériences suivantes.

PFTK1 peut favoriser les cellules migrent et invasive in vitro

Il est rapporté PFTK1 surexpression peut augmenter et améliorer la phosphorylation CaD CaD à se lier à F-actine, qui favorisent hépatocellulaire la migration des cellules de carcinome [16]. Étant donné que PFTK1 était liée à l'envahissement ganglionnaire dans les échantillons de cancer de l'estomac, nous avons étudié si PFTK1 gastrique pourrait affecter la migration des cellules cancéreuses et l'invasion. Cicatrisant le dosage et les dosages transwell ont montré que la migration des cellules Flag-PFTK1 a notamment été augmentée par rapport aux cellules témoins. Au contraire, la migration des PFTK1-siRNAcellules ont été réduits en comparaison avec des cellules témoins (figure 5A et 5B). En outre, des essais d'invasion de Matrigel ont également démontré que la régulation positive de PFTK1 par transfecter Flag-PFTK1 pourrait faire avancer la capacité invasive et knockdown de PFTK1 pourraient atténuer la capacité invasive des cellules cancéreuses gastriques (figure 5C). Dans l'ensemble, nous pourrions arriver à une conclusion que PFTK1 promouvoir la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique.

Expression de PFTK1 promouvoir la prolifération des cellules cancéreuses gastriques

Selon les résultats présentés ci-dessus, PFTK1 était positive en corrélation avec PCNA, Ki-67 expression et le grade de la tumeur, qui étaient des cellules marqueur de prolifération. Nous analysons le rôle de PFTK1 sur la régulation de la capacité de prolifération. Tout d'abord, MGC803 cellules ont été transfectées avec PFTK1-siRNA, Flag-PFTK1 et ont été déterminées CCK-8 essai. La surexpression de PFTK1 démontré à améliorer le taux de croissance des cellules gastriques de contrôle, tandis que knockdown de PFTK1 a montré le résultat opposé (figure 6A). Conforme à l'amélioration de taux de croissance cellulaire suivant PFTK1 surexpression, le dosage de formation de colonies a également montré qu'elle pouvait augmenter la formation de colonies. Et knockdown de PFTK1 a montré le même résultat avec la CCK-8 essai (figure 6B). Enfin, nous avons étudié le mécanisme de prolifération des PFTK1 par analyse cytométrique en flux, et des données suggèrent que les cellules cancéreuses plus gastriques ont été trouvés dans la phase S, en présence d'PFTK1 extra-utérine, les cellules cancéreuses moins gastriques ont été trouvés dans la phase S en transfectant avec PFTK1- siRNA(Fig 6C). Pour résumer, ces données ont démontré que PFTK1 a participé à la régulation du cycle cellulaire en accélérant la transition de G0 /G1.

La voie de signalisation de PFTK1 dans la promotion de la prolifération et la migration

Pour étudier davantage le mécanisme de qui PFTK1 régulée des cellules de cancer gastrique prolifération, la migration, l'invasion, nous avons décidé de détecter la protéine apparentée changé par Western blot quand PFTK1 a été surexprimé ou knockdown en MGC803. Comme l'a signalé, PFTK1 pourrait activer noncanonical signalisation Wnt dans le carcinome hépatocellulaire [17]. signalisation Wnt a été liée à des tumeurs prolifération et la migration. La régulation positive de PFTK1 partiellement activé Dvl2, Naked1, MMP2 et élevé de l'expression du régulateur du cycle cellulaire cycline E, mais ne change pas Dvl1, β-caténine. De plus, nous avons constaté que knockdown de l'expression PFTK1 endogène pourrait diminuer Dvl2, Naked1, MMP2, cycline E expression, mais pas changé Dvl1, β-caténine (figure 7).

Discussion

Être l'un des cancers d'incidence les plus élevés dans le monde, le taux de survie à 5 ans du cancer gastrique est inférieur à 20% -25% aux Etats-Unis, en Europe et en Chine en raison de facile de rechute et le taux de métastases élevé postopératoire [2]. l'infection à Helicobacter pylori, la modification des gènes oncogènes et suppresseurs de tumeur, la régulation du cycle cellulaire et l'activation de la télomérase est associée au cancer gastrique [21]. la régulation du cycle cellulaire anormale dans le développement du cancer de l'estomac a été l'objet de recherches ces dernières années. une régulation précise et rigoureuse du cycle cellulaire dépend de certains facteurs de contrôle, y compris la kinase du cycle cellulaire dépendante (CDK), la protéine du cycle cellulaire (cyclines) et les inhibiteurs de kinase dépendant du cycle cellulaire (CKI). Tout le monde est familier avec 11 CDK classiques (CDK1-11), PFTK1 comme une kinase dépendante du cycle cellulaire nouvelle se trouve pas le long et le lien entre PFTK1 et cancers est pas beaucoup, aussi dans le cancer gastrique [22].

PFTK1 a été trouvé dans le système nerveux des rats [23]. PFTK1 modulant la différenciation des oligodendrocytes par voie PI3K /AKT [13]. La dernière recherche a rapporté que PFTK1 est régulée positivement dans le cancer de l'œsophage humain, un carcinome hépatocellulaire et associés avec la croissance tumorale, la migration et l'invasion [14,24]. Dans notre étude, nous avons examiné si l'expression de PFTK1 a été impliqué dans l'estomac des cellules cancéreuses prolifération, la migration et l'invasion. Dans un premier temps, nous avons démontré que PFTK1 exprimé plus élevé dans les tissus du cancer de l'estomac que dans les tissus non tumoraux adjacents par Western Blot que, conformément aux résultats dans d'autres cancers (figure 1). Par la suite, l'immunohistochimie a montré une expression élevée de PFTK1 était lié avec le grade de la tumeur, la profondeur de l'infiltration, l'envahissement ganglionnaire, ainsi que Ki-67 dans 161 tissus de cancer gastrique. Ces constatations ont incité PFTK1 pourrait affecter la prolifération du cancer gastrique et la migration. Kaplan-Meier analyse a révélé que PFTK1 prédit la survie globale médiocre (figure 3B). L'analyse multivariée en utilisant le modèle des risques proportionnels de Cox a suggéré PFTK1 était un des indicateurs pronostiques indépendants de la survie globale des patients. Afin de mieux comprendre l'effet réglementaire de PFTK1 sur les cellules gastriques, MGC803 cellules ont été transfectées avec PFTK1-siRNA, Drapeau-PFTK1 in vitro
(figure 4). La figure 6 montre PFTK1 pourrait favoriser une prolifération de la CCK-8, un essai de formation de colonies. Dans le même temps, PFTK1 a augmenté la transformation de phase G1-S selon la cytométrie en flux, qui coïncide avec la découverte de PFTK1 dans le carcinome hépatocellulaire [10]. La cycline E est l'un des facteurs régulateurs importants pendant G1-S transformation de phase et de la protéine cycline E pourraient définir en tant que facteur de pronostic pour les patients atteints d'un cancer gastrique [25]. Fait intéressant, le niveau PFTK1 a augmenté après la transfection avec le drapeau-PFTK1 consistented avec PCNA, MMP2 et cycline E (figure 7).

En outre, nous avons également examiné si PFTK1 pourrait affecter la migration des cellules et la capacité d'invasion par la guérison des plaies le dosage et les dosages transwell. Les résultats ont montré que la surexpression de PFTK1 pourrait renforcer la migration des cellules et de l'invasion, ce qui pourrait être due à un changement d'aval des voies de signalisation de PFTK1 (figure 5). Comme indiqué dans le cancer hépatocellulaire, PFTK1 et /ou CCNY seule pourrait activer la signalisation Wnt non canonique provoquant la migration des cellules et de l'invasion [17]. voies Wnt inclus canonique Wnt /β-caténine signalisation et la signalisation Wnt manière non canonique (Wnt /Ca ^{2+ et Wnt /Pcp). chemin de signalisation Wnt a joué un rôle important dans le développement des cancers et des cellules réglementé prolifération, la migration et l'invasion [26]. Par la suite, nous avons trouvé l'expression des protéines β-caténine, Dvl1, Dvl2, Naked1. Dvl2 et Naked1 étaient positivement corrélés avec PFTK1 et les protéines Wnt canonique /β-caténine liés ß-caténine, Dvl1 n'a pas changé (figure 7). De ce qui précède, nous avons donc supposé que PFTK1 pourrait favoriser la migration et l'invasion par la régulation de la signalisation Wnt non canonique. Et il y avait aussi des articles de signalisation Wnt non canonique invite favorise la migration et l'invasion capacité des cellules de cancer gastrique [27,28].}

En un mot, l'expression de PFTK1 significative a été augmentée dans les tissus de cancer gastrique humain. Surexpression ou knockdown de PFTK1 par transfection avec le drapeau-PFTK1 ou PFTK1-siRNAévidemment affecté gastrique des cellules cancéreuses prolifération, la migration et l'invasion. Nos résultats au premier fournissent de nouvelles preuves de PFTK1 dans le développement de la base de cancer et de fournitures de laboratoire gastrique pour le traitement clinique. Mais d'autres études sont nécessaires pour comprendre le mécanisme précis de PFTK1 affectant la prolifération, la migration et la capacité d'invasion des cellules cancéreuses gastriques.

• PLOS ONE: détection et caractérisation des cellules cancéreuses métastatiques dans le mésogastre de cancer gastrique Patients
• PLOS ONE: Dietary Intake Fat et risque de cancer gastrique: une méta-analyse de observationnelle Studies