Plos ONE: PFTK1 Spodbuja Rak želodca napredovanja urejanju proliferacijo, migracijo in Invasion

Povzetek

PFTK1, znan tudi kot PFTAIRE1, CDK14, je nov član, povezanih z Cdc2 serin /treonin protein kinaz. Nedavne študije so pokazale, da je PFTK1 močno izražena v številnih malignih tumorjih kot hepatocelularnega karcinoma, raka požiralnika, raka dojke in sodeluje pri regulaciji celične cikla tumorjev proliferacijo, migracijo in invazijo, ki dodatno vpliva na prognozo tumorjev. Vendar pa izraz in fiziološki pomen PFTK1 z rakom želodca, še vedno nejasna. V tej študiji smo analizirali izražanje in klinični pomen PFTK1 Western blot na 8 v paru sveže želodčne rakavih tkiv, nontumorous želodčne sluznice tkiva in imunohistokemično na 161 paraffinembedded rezine. Visoka izraz PFTK1 je v korelaciji s stopnjo tumorja, bezgavka invazijo kot tudi Ki-67. Preko mobilnega štetja Kit (CCK) -8 test, pretočna citometrija, nastajanja kolonija, celjenje ran in transwell teste, so vitro študije so pokazale, da PFTK1 prekomerno spodbuja proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih rakavih celic, medtem ko PFTK1 rasklapanje privedla do nasprotnih rezultatov. Naše ugotovitve prvič podprta, da bi PFTK1 igrajo pomembno vlogo pri urejanju želodca proliferacije raka, migracije in bi zagotovila novo obetavno terapevtsko strategijo za boj proti raku človeške želodčne

Navedba. Yang L, Zhu J, Huang H, Yang Q, Cai J Wang Q, et al. (2015) PFTK1 Spodbuja želodca Rak napredovanja, ki ga urejanju proliferacijo, migracijo in Invasion. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10,1371 /journal.pone.0140451

Urednik: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES

Prejeto: 7. maj 2015; Sprejeto: 25. september 2015; Objavljeno: 21. oktober 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v prispevku

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz Natural Science Foundation Kitajske (št 81302285, št 81402015)

nasprotujočimi si interesi. avtorji so izjavile, da ne obstajajo konkurenčne interese.

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši maligni tumor, in drugi najpogostejši vzrok smrti, povezanih z rakom v vseh vrstah raka po svetu [1]. To je težko zdraviti, če se ugotovi, v zgodnji fazi [2]. Zaradi pomanjkanja specifičnosti, zgodnja stopnja diagnoza je nizka in večina bolnikov z rakom želodca so pri srednjih pozno fazi, ko diagnoza. 40% -60% bolnikov z rakom želodca prejel rak želodca radikalna operacija bo pogosto pooperativne ponovitve in metastaze, te značilnosti močno vplivajo na dolgoročno preživetje pri bolnikih z rakom želodca [3,4]. Kljub veliki napredek novih strategij diagnostike in zdravljenja raka želodca, natančnih molekularnih mehanizmov raka želodca se slabo razumeli. Tako lahko identifikacija molekularni mehanizem v želodcu napredovanje raka in metastaz bolnikom z novimi diagnostičnih in terapevtskih strategij.

PFTK1 (znan tudi kot PFTAIRE1, CDK14) je nov član, povezanega s Cdc2 serin /treonin proteinske kinaze, da je prvi, opredeljene v miške živčnega sistema in je ključni regulator ciklini in celični cikel [5,6]. Nekaj ​​študije so bile izvedene za označitev njene fiziološke funkcije ali biološki pomen. To je poročal, da je PFTK1 zelo izražena v možganih, trebušne slinavke, ledvic in jajčnikov. CDK vežejo na specifične ciklin polju tvori funkcionalni protein kinaz kompleksov in urejeno delno njen subcelično lokalizaciji [7]. Na primer, ciklin Y nov membrano povezano ciklin, komunicira z PFTK1 poveča PFTK1 kinazno aktivnost in zaposluje PFTK1 na membrano plazme [8]. PFTK1 komunicira z ciklin B2 sodelovanju lokalizacijo v jedru v karcinomom jetrnih celic [9]. Temeljna funkcija PFTK1 poroča kot ciklin-odvisne kinaze (CDK), ki ureja napredovanje celičnega ciklusa in proliferacijo celic, ki jih posebej v stiku s člani ciklin proteinov, kot so ciklin D3 (CCND3), ciklin Y (CCNY) in tvori ternarni kompleks z inhibitor p21 celica cikel, s čimer fosforilira na zaviralnih Rb za G1 /s prehoda [10]. Knockout ciklin Y v celičnih linijah gliomom naredi cikel celic blokiran v S obdobju [11]. Ciklin Y komunicira z PFTK1 prilagoditi M fazo mitoze [12]. Te ugotovitve skupaj implicirajo, da lahko PFTK1 deluje kot promotor tumorjev preko regulacijo celičnega cikla. Medtem, številne študije kažejo, da je PFTK1 tudi druge pomembne funkcije. PFTK1 modulira razlikovanje oligodentrocitnega preko PI3K /AKT poti [13]. Pred kratkim PFTK1 daje HCC celic gibljivost skozi inaktivira aktina veže premikajoči zatirati funkcijo TAGLN2 preko fosforilacije [14]. PFTK1 posredovano fosforilacija omogoča združenje CAD F-aktinskih filamentov, kar je povzročilo povečanje polimerizacijo aktina stresnih vlaken, s čimer se spodbuja migracijo celic in vdor v HCC celic [15,16]. Čezmerno PFTK1 lahko podeli premikajoči fenotip pri malignih jetrnih celicah [9]. V dogovoru z molekularnimi ugotovitvami, CCNY in /ali PFTK1 samo lahko aktivirate noncanonical NT signalizacijo za krepitev celic gibljivost v HCC celic [17]. Vse te študije kažejo, da se PFTK1 lahko sodelujejo pri širjenju celic in gibljivost, pa izraz in pomen PFTK1 v želodčnih rakave celice še vedno nejasna.

V naši raziskavi smo želeli izvesti celovito analizo PFTK1 izražanja in njene prognoze vlogo v želodčnih rakavih celic. Proučili smo izraz PFTK1 in njegovo povezavo s kliničnimi lastnostmi in Ki-67 po zahodni blot in imunohistokemijo (IHC). Naša raziskava je pokazala, da PFTK1 okrepljeno proliferacijo, migracijo in invazivnosti želodčnih rakavih celic, ki jih CCK-8, pretočna citometrija analize, analize oblikovanje kolonija, transwell test, vplivala na izražanje sorodnih proteinov. Te ugotovitve so bile prvič poročali v želodčnih rakavih celic in lahko zagotovi nov vpogled v razvoj eksperimentalnih zdravljenja raka želodca.

Materiali in metode

tkivnega vzorca

Sto šestdeset on vzorci želodčne rak tkiva in se ujema sosednje noncancer tkiva so bili izbrani iz bolnikov, ki so bili operirani med letoma 2007 in 2013 na Oddelku za patologijo, Nantong tumor Hospital. Te tkiva smo hranili pri -80 ° C takoj po kirurški odstranitvi. Za histološko preiskavo, so bili vsi želodčne vzorce tkiva določen v 10% formalinu zapufrani in vdelali v parafin za odseke. Odstranjenimi vzorci so bili razvrščeni glede na sedmi izdaji TNM klasifikacije za Rak želodca [1] .Preverite vse clinicopathological informacije vključene starost, spol, globina pronicanja, stanje diferenciacije, bezgavka invazijo, živčno invazijo in stopnjo TNM. Odobritev odstranjenih tkiv za raziskovalne namene je bilo pridobljeno iz tumor bolnišnici etiko v Nantong. Podpisana privolitev bili pridobljeni tudi od vsakega bolnika. Glavni klinični in patološki spremenljivke so bile povzete v tabeli 1.

Western blot analiza

Western blot test je bil uporabljen za odkrivanje nekaterih proteinov [18-20]. Najprej so bile želodčne CANER tkiva in celice razpokani v liznega pufra (1 M Tris-HCl pH 7,5, 1% Triton X-100, 10% natrijevega sulfata (SDS), 1% NP-40, 0,5 M EDTA, 0,5% natrijevega deoksiholat, 10 ug /ml aprotinina, 1 mM PMSF, 10 ug /ml leupeptina) in nato centrifugiramo pri 10,000 x g za 30 minut za zbiranje supernatanta. Supernatant smo razredčili v 2 × SDS pufra in kuhano. Ekvivalentna količina beljakovin iz vsakega vzorca smo elektroforezo s 10% natrijev dodecil sulfat-poliakrilamidnem gelu z elektroforezo (SDS-PAGE) in nato prenese na v poliviniliden fluorid (PVDF) membrano (Millipore, Bedford, MA). Po tem smo membrane blokirana približno 2 uri pri sobni temperaturi in nato inkubirali preko noči pri 4 ° C s primarnimi protitelesi. Po spiranju s fosfatnim pufrom (PBS), ki vsebuje 0,1% Tween 20 trikrat, vsak 5 min, smo membrane nato inkubiramo s hrenovo peroksidazo vezanega IgG kot sekundarna protitelesa za drugo 2 h pri sobni temperaturi. Membrane smo nato razvili s pomočjo sistemov ECL zaznavanja (Imaging Technology, Ontario, Kanada). Protitelesa, ki se uporabljajo v tej študiji, so: anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz biotehnologija), anti-ciklin E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-PCNA (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-catenin (1: 1000, santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl1 (1: 600, santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, celična signalizacija), anti-MMP2 (1: 500, santa Cruz Biotechnology).

Imunohistokemijsko analize

na kratko, so odseki tkiva razvoskana v ksilena in hidracijo skozi razvrščenih ethanols. Potem oddelki kaliti v 3% metanola, peroksida, za približno 10 minut, da blokira endogenega peroksidaze dejavnost. Z visokim pritiskom in temperature v avtoklavu, je bila njena radioinkorporacijo razširjen v 0,1 M citratnem pufru za 3 min. Tkiva odseki inkubiramo z anti-PFTK1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) in anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) za 120 minut pri sobni temperaturi. V skladu z navodili proizvajalca, po pranju in-fosfatnim pufrom (PBS), smo tkiva inkubirali s hrenovo peroksidazo konjugiranih anti-miš Ig polimera kot drugo protitelo (predvidevamo kit, Dako) za 20 minut pri sobni temperaturi. Na koncu so diapozitivi jih nasprotno s hematoksilinom, dehidrirani, in vgrajeni v smolo gori. Količinsko PFTK1 in Ki-67 protein izraz, tako obseg radioinkorporacijo in intenzivnost bile ocenjene in zadetka. Pet high-power polja so bila izbrana naključno za vsak del in vsaj 300 celic so bili prešteti na polju. Za statistično analizo PFTK1 je vsak drsni ovrednotili s pomočjo semikvanititativnimi točkovanja tako intenzivnosti madež in odstotek pozitivnih malignih celic. Celice smo ocenili kot sledi: 1 (≤25% tumorske celice obarvane), 2 (26% -50% tumorskih celic barvanega), 3 (51% -75% tumorskih celic barvanega), 4 (76% -100% tumorske celice obarvano). Za oceno gostote: 1 šibka barvanje; 2 srednje barvanje; 3. močno obarvanje. Nato smo pomnožili dveh točk in jih razvrstili v dve skupini: nizki izražanja in visoko ekspresijo. Kot je za statistično analizo Ki-67, < 50% tumorskih celic, obarvanih tako nizko izražanja in ≥ 50% tumorskih celic, obarvanih tako visoka izraz. Da bi se izognili tehnične napake, je obarvanje ponovi trikrat in smo dobili podobne rezultate.

Celične kulture in prehodna transfekciji

MGC803 in HGC27 so celične linije želodca, ki so bile kupljene iz knjižnice celic kitajske akademije znanosti. Sta bili gojimo v RPMI-1640 medija (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, ZDA). SGC7901 in GES1 so še v želodcu celične linije, ki je prijazno, ki jih je Oddelek za patologijo raziskovanje Nantong univerze. SGC7901 in GES1 bili kultivirani v DMEM srednje (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, ZDA). Vse medij bile narejene z 10% fetalni goveji serum (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, ZDA) z dodatkom 2 mM L-glutamina, 100 E /ml penicilina-streptomicinom zmes (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, ZDA ), pri 37 ° C in 5% CO _{2. PFTK1 mali interferenčne RNA (siRNA) so bili oblikovani in sintetizirali Shanghai Genechem (Kitajska). SiRNA ciljanje PFTK1 sekvence so bile: 5'-GTTCATTCTTTACCACATT-3 ', 5'-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3', 5'-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 ', 5'-ACCCATACAGGAAATCCAA-3'. Zastava-PFTK1 plazmida je bila kupljena od Shanghai Genechem (Kitajska). Lipofectamine 2000 transfekciji reagent (Life Technologies) je bil uporabljen za celice transfekciji po navodilih proizvajalca.}

Flow citometrična analiza

Najprej so bili vsi v želodcu celične linije, določene v 70% etanolu čez noč pri -20 ° C C. drugič, potem speremo z citrat-fosfatnega pufra in PBS, smo celice inkubirali z 1 mg /ml RNaseA 30 minut pri 37 ° C. Nato smo celice obarvali z 50 ug /ml propidijevim jodidom v fosfatnim pufrom (PBS) -Triton za nadaljnjih 20 minut pri 4 ° C. Končno smo celice analizirali s pomočjo Becton Dickinson pretočnega citometra BD FACSCAN (San Jose, CA) in Cellquest programom za analizo pridobivanja. Eksperiment je bil izveden trikrat.

Colony sestavo teste

MGC803 celice gojimo v šestih tudi kulture plošč (Corning inc, Corning NY) z gostoto 200 celic /jamico po transfekcijo PFTK1 #siRNA in Flag-PFTK1 v skladu z navodili proizvajalca. Po dveh tednih, so celične kolonije (≥ 50 celic /kolonija) prešteti z barvanjem z 0,5% kristal vijolično.

teste proliferacije celic

MGC803 celice, ki so vključeni normalno, transfekcija PFTK1 # siRNA in Zastava-PFTK1 smo zasejali v 96-celična kultura kasetnega plošč (Corning inc, Corning NY) z gostoto 2 x 10 ^{4 celic /tudi v 100 ul kulturo in gojimo preko noči. V skladu z navodili proizvajalca, so bile celice merili z uporabo komercialno CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonska). CCK-8 reagenti dodamo v vsako vdolbinico za 2 h inkubacije pri 37 ° C. Absorbanco smo prebrali pri valovni dolžini 450 nm v avtomatiziran čitalniku ploščo. Poskuse je treba ponoviti vsaj trikrat.}

ran-zdravilne test

MGC803 celice gojijo v šestih ter kulture plošč (Corning Inc, Corning NY) z gostoto 5 × 10 ^{5 celic /dobro in gojijo do sotočja čez noč. Po transfektirana 48 urah smo celice inkubirali z mediju brez seruma. Linija je opraskan v celični plasti conflent uporabo konec FIE za pipeto 10 ml (čas 0) in celice speremo s PBS. Podobe odletijo celice so bile zaporedno delo po 24 h, 48 h pri zaprtju ranjenega regije.}

Trans-naredil migracije vsebnosti

Celica migracije test smo izvedli z uporabo transwell komoro (8,0 lm velikost por; Costar, Cambridge, NY, ZDA). Okoli 1 x 10 ^{5 celic /ml smo zasejali v zgornjem komor v mediju, in RPMI-1640 dodamo k dnu komore. Po 24 urah smo top celice, ki niso bile prehajali odstranili in dnom celice, ki so bile prehajali so bile določene s paraformaldehidom in obarvamo s kristalno vijolično. Število migrirali celic v 5 področjih smo šteli pod 200-kratni povečavi in ​​določimo sredstva za posamezne komore. Vse poskuse smo ponovili trikrat}

Trans-tudi invazija test

Cell migracije test je bil izveden s pomočjo transwell komoro (8,0 lm velikost por, Costar, Cambridge, NY, ZDA).. BD MatrigelTM bazalne membrane Matrica dodamo zgornjo komoro za 1 uro pri 37 ° C. Nato je bilo 500 ul medij, ki vsebuje kemotaktičnega faktor objavljen v spodnji komori. Okoli 1 x 10 ^{5 celic /ml smo zasejali v zgornjih komorah pri 37 ° C je bilo 24 h.Cells nato pritrdi s paraformaldehidom in obarvamo s kristalno vijolično. Vse poskuse smo ponovili trikrat.}

Statistična analiza

Vse statistične analize so bile izvedene s pomočjo statistike, SPSS 19 programski paket. PFTK1, Ki-67 izraz in clinicopathologic lastnosti smo analizirali z uporabo 2 testa χ ^{. Splošni Krivulje preživetja smo izračunali po metodi Kaplan-Meier in smo testirali s testom log-ranga. Multivariatne analize smo analizirali s Cox sorazmernih tveganj modela, razmerje tveganja in njegov 95% interval zaupanja je bilo zabeleženih za vsak označevalec. Vrednosti so izražene kot povprečje ± SE, in P
< 0.05 smo imeli za statistično značilne.}

Rezultati

PFTK1 se prekomerno v želodčnih tumorskih tkivih

To je poročala, da je PFTK1 pomemben ciklin odvisne kinaze, ki lahko uravnavajo celično cikla, vendar raziskave o raku želodca še nikoli ni bila raziskana. Ker je bila čezmernim PFTK1 najdemo v raka jeter in raka na požiralniku v primerjavi z običajnimi tkiva. Zato je zanimivo, da analize izraz PFTK1 v želodčnih tumorskih tkivih in njegova coorelation z bolj razširjeni jedrni antigen celic (PCNA). Najprej smo preučili izražanje PFTK1 v 8 parov želodca tumorskih tkiv in njihove ustrezne nontumorous želodčnega tkiva sluznice z Western blot. Kot je prikazano na sliki 1, v primerjavi s sosednjimi normalnih tkiv smo Povecanje od PFTK1 odkrili v vseh osmih želodčnih tkiva v soglasju z PCNA. Da se potrdi klinični pomen PFTK1 v želodcu napredovanje raka, imunohistokemični (IHK) analize je bila uporabljena za opazovanje izražanja PFTK1 beljakovin v 161 želodčnega tkiva raka. Kot je bilo pričakovati, so izraz PFTK1 in tumorja razredu negativno povezani. PFTK1 imeli bistveno višjo izraz v slabo diferenciranih osebkov kot dobro diferenciranih-primerkov, kar je bilo v skladu s Ki-67. PFTK1 bila izražena v celično membrano, medtem ko citoplazmo, Ki-67 v glavnem v jedru. Rezultat je prikazan na sliki 2. Nato smo raziskovali povezavo med PFTK1 in Ki-67 s korelacijskim koeficientom Pearson. Lahko vidimo na sliki 3A, ki je bil PFTK1 pozitivno povezana s Ki-67 (Pearson y = 0.833, P
< 0,001).

PFTK1 je povezana z neželenimi kliničnimi lastnostmi in slabe tumorja želodca preživetje

Klinična združenje študija bolnikov je bil raziskati analizirati korelacijo PFTK1 z rakom želodca clinicopathological funkcij med 161 tkivih. V clinicopathological podatki so navedeni v tabeli 1. Visoka izraz PFTK1 je bila povezana s stopnjo tumorja ( P
= 0,009), infiltracijo globino ( P
= 0,002), bezgavk invazije ( P
= 0,000), kot tudi Ki-67 ( P
= 0,000). Ampak ni bilo korelacije med PFTK1 izražanja in drugih kliničnih spremenljivk, kot so starost, spol, živcev invazije, in fazo TNM.

Poleg tega je bila Kaplan-Meier analizo uporabljajo za analizo povezavo med PFTK1 izražanja in 161 preživetje bolnikov. Po krivulj preživetja, je bila visoka izraz PFTK1 očitno povezana s slabim celokupno preživetje, medtem ko je nizka izraz PFTK1 povezana z boljšo celokupno preživetje. Mediana razmerje čas preživetja in nevarnosti, je pokazala na sliki 3B. Poleg tega, univariatne analize v želodčnih tkivih raka je pokazala, da je tumor razred ( P
= 0,020), globina infiltracijo ( P
= 0,011), bezgavko invazija ( P
= 0,011), stopnja TNM (P = 0,031), PFTK1 izraz ( P
= 0,002), in Ki-67 izraz ( P
= 0,013) so napovedni dejavniki celokupnega preživetja (tabela 2 ). Multivariatna analiza z uporabo Cox je sorazmernih tveganj modela predlagal PFTK1 je neodvisni napovedni kazalci za celokupno preživetje bolnikov ( P
= 0,048, tabela 3). Če povzamemo, so naši rezultati pokazali, da je izražanje PFTK1 značilno povezana s kliničnimi lastnostmi in slabe celotnem preživetju.

Izraz PFTK1 v nontransfected in transfekciji želodčne rakavih celic

Kot PFTK1 je prekomerno v želodčnih tumorskih tkivih, nato smo analizirali izražanje PFTK1 v celičnih linij, vključno MGC803, SGC7901, HGC27, GES1. Od slika 4A, izražanje PFTK1 normalno želodca celične linije je GES1 nižja kot v celičnih linijah želodčnih MGC803, SGC7901, HGC27. Za nadaljnje študije funkcijo PFTK1 v želodčnih rakavih celic in vitro,
so MGC803 celice transfekciji s PFTK1-siRNA in SGC7901 celice smo transfektirali z zastavo-PFTK1. Western blot smo uporabili za merjenje ekspresije PFTK1. Ko je bil Flag-PFTK1 transfekcije v SGC7901 je imel PFTK1 višjo izraz (slika 4B). Medtem ko je bila PFTK1-siRNA transfekcije v MGC803, PFTK1-siRNAdosegel najvišjo rasklapanje učinkovitost v primerjavi z drugimi PFTK1-siRNA (slika 4C). Tako smo izbrali Flag-PFTK1 in PFTK1-siRNAza nadaljevanje naslednje eksperimente.

PFTK1 lahko spodbujajo celice selijo in invazivni in vitro

To je poročal PFTK1 overexpression lahko poveča CAD fosforilacije in krepitev CAD da se veže na F-actins, ki spodbujajo karcinomom jetrnih celic migracije [16]. Glede na to, da je bil PFTK1 povezana z bezgavk invazije v želodčnih vzorcih raka, smo raziskovali, ali bi PFTK1 vpliva želodčne rakavih celic migracije in invazijo. Ran-zdravilne metod in transwell testov so pokazali, da je migracija Flag-PFTK1 celic močno povečal, v primerjavi s kontrolnimi celicami. Nasprotno so migracija PFTK1-siRNAcelic v primerjavi s kontrolnimi celicami (slika 5A in 5B) zmanjša. Poleg tega poskusa vdora v Matrigel tudi pokazala, da bi Povecanje od PFTK1 s transfekcija zastave-PFTK1 napredovanje invazivno sposobnost in rasklapanje od PFTK1 bi zmanjšali invazivno sposobnost želodčne rakavih celic (slika 5C). Na splošno bi lahko pridemo do zaključka, da PFTK1 spodbujajo migracije in vdor želodčnih rakavih celic.

Izražanje PFTK1 spodbujanje širjenja želodčnih rakavih celic

Glede na rezultate zgoraj navedenih, je bil PFTK1 pozitivno povezana z PCNA, ki-67 izražanja in tumorja razreda, ki so bile celice dvojno podajo orožja. Analiziramo vlogo PFTK1 o urejanju sposobnost širjenja jedrskega orožja. Najprej MGC803 celice smo transfektirali z PFTK1-siRNAzastave-PFTK1 in določimo CCK-8 testa. Čezmerno PFTK1 dokazano, da poveča celic stopnjo rasti v želodcu kot nadzor, medtem ko rasklapanje od PFTK1 pokazala nasprotni učinek (slika 6a). V skladu s krepitvijo rast celic po PFTK1 prekomerno, test, ki tvorijo kolonije je tudi pokazala, da lahko poveča nastanek kolonij. In rasklapanje od PFTK1 pokazala enak rezultat z CCK-8 testom (slika 6B). Končno smo raziskovali mehanizem proliferacijo PFTK1 s pretočno citometrično analizo in podatki kažejo, da je bilo več želodčnih rakave celice so v fazi S, v prisotnosti zunajmaternične PFTK1 so manj želodčne rakave celice so v fazi S na transfekcijo s PFTK1- siRNA(slika 6C). Če povzamemo, ti podatki pokazali, da PFTK1 sodelovala pri regulaciji celičnega cikla s pospeševanjem G0 /G1 -S prehod.

Pot signala PFTK1 pri spodbujanju širjenja in migracije

Da bi še dodatno preučiti mehanizem ki PFTK1 urejeno želodčni rak celic proliferacijo, migracijo, invazijo, smo se odločili za ugotavljanje povezano beljakovin z Western blot spremenilo, ko je PFTK1 prekomerno ali rasklapanje v MGC803. Kot poročajo, je lahko PFTK1 aktivirati noncanonical NT signalizacijo v karcinomom jetrnih celic [17]. NT signalizacija je bila povezana z tumorji orožja in migracij. Uravnavanjem PFTK1 delno aktivira Dvl2, Naked1, MMP2 in povišano izražanje regulatorja celični cikel ciklin E, vendar ni spremenilo Dvl1, beta-catenin. Še več, smo ugotovili, da je rasklapanje endogenega PFTK1 izražanja lahko zmanjša Dvl2, Naked1, MMP2, ciklin E izraz, vendar niso spremenile Dvl1, beta-catenin (slika 7).

Pogovor

Kot eno najvišjih incidence raka na svetu, 5-letno preživetje raka želodca, je manj kot 20% -25% v ZDA, Evropi in na Kitajskem, ker enostavno do ponovitve in visoke stopnje metastaz v postoperativne [2]. okužba pylori Helicobacter, sprememba onkogenskimi in zaviralnih genov, regulacija celičnega ciklusa in aktivacijo telomeraze so povezani z rakom želodca [21]. Uredba nenormalno celični cikel pri razvoju raka želodca je bila predmet raziskav v zadnjih letih. Natančno in stroga regulacija celičnega cikla je odvisen od nekaterih kontrolnih dejavnikov, med drugim odvisne kinaze celičnega ciklusa (CDK), proteinov celičnega cikla (ciklini), in odvisnih kinaz inhibitorji celičnega ciklusa (CKIs). Vsakdo pozna 11 klasičnih CDK (CDK1-11), PFTK1 kot odvisne kinaze novega celičnega cikla je ugotovilo, da niso skupaj in povezava med PFTK1 in raka ni veliko, tudi pri raku želodca [22].

PFTK1 je bil prvotno nahajajo v živčnem sistemu podgan [23]. PFTK1 modulira razlikovanje oligodentrocitnega preko PI3K /AKT poti [13]. Najnovejše raziskave so poročali, da je PFTK1 povečana pri požiralnika rakom pri ljudeh, karcinomom jetrnih celic in sodelavcev z rastjo tumorja, migracije in invazije [14,24]. V naši raziskavi smo raziskali, ali je izraz PFTK1 vključeni v želodčnem rakavih celic proliferacije, migracije in invazije. Sprva smo dokazali, da PFTK1 izražena višja v želodčnih tkivih rakavih kot v sosednjih nontumor tkivih po Western Blot, da v skladu z rezultati v drugih rakih (slika 1). Kasneje, imunohistokemija pokazala visoko izraz PFTK1 je bila povezana s stopnjo tumorja, globina infiltracijo, bezgavk invazije, kakor tudi Ki-67 v 161 želodčnega raka tkiva. Te ugotovitve pozvani PFTK1 lahko vpliva na želodcu proliferacijo in migracijo raka. Kaplan-Meier analiza je pokazala, da PFTK1 napovedano slabo celokupno preživetje (slika 3B). Multivariatna analiza z uporabo Cox je sorazmernih tveganj modela predlagal PFTK1 je neodvisni napovedni kazalci celotnem preživetju bolnikov. Da bi še razumeli regulatorni učinek PFTK1 na želodčnih celic, so MGC803 celice transfekciji s PFTK1-siRNA, Zastava-PFTK1 in vitro
(slika 4). Slika 6 je pokazala PFTK1 lahko spodbujajo širjenje s CCK-8, test naselju oblikovanje. Hkrati, PFTK1 povečala faze preoblikovanja G1-S po katerem teče citometrijo, kar sovpada z ugotovitvijo PFTK1 v hepatocelularnega karcinoma [10]. Ciklin E je bil eden od pomembnih regulativnih dejavnikov, med G1-S faznih transformacij in ciklin E beljakovin lahko opredeli kot prognostični dejavnik pri bolnikih z rakom želodca [25]. Zanimivo je, da je bila stopnja PFTK1 povečalo po transfekcijo z zastavo-PFTK1 consistented z PCNA, MMP2 in ciklin E (slika 7).

Poleg tega smo pregledali tudi, ali bi PFTK1 vpliva na celice migracije in invazijo sposobnosti s celjenjem ran Test in transwell testi. Rezultati so pokazali, da bi lahko prevelike količine PFTK1 povečanje celice migracije in invazije, ki je lahko posledica spremembe v smeri toka od PFTK1 signalnih poti (slika 5). Kot so poročali v jetrnih celic raka, PFTK1 in /ali CCNY sam lahko vključite nekanoničen NT signalizacijo povzročajo celice migracije in invazijo [17]. NT poti vključeni kanonično NT /β-catenin signalizacije in nekanoničen NT signalnih poti (NT /Ca ^{2 + in NT /PCP). NT signalizacija tako igral pomembno vlogo pri razvoju raka in reguliranega celic proliferacijo, migracijo in invazije [26]. Kasneje smo ugotovili izražanje proteinov β-catenin, Dvl1, Dvl2, Naked1. Dvl2 in Naked1 so pozitivni korelaciji z PFTK1 in povezanih kanonično NT /β-catenin beljakovine beta-catenin, Dvl1 ni spremenila (slika 7). Iz zgoraj navedenega smo zato razmišljal, da bi PFTK1 spodbujati migracije in napad z regulacijo nekanoničen NT signalizacijo. In tam so bili tudi predmeti hitro nekanoničen NT signalizacija spodbuja migracije in invazijo sposobnost želodčne rakavih celic [27,28].}

Z eno besedo, izraz PFTK1 pomembno je bilo v človeških želodčnega tkiva raka poveča. Prekomerno ali rasklapanje od PFTK1 s transfekcijo z Flag-PFTK1 ali PFTK1-siRNAje očitno vplivalo na želodcu rakave celice orožja, migracij in invazijo. Naši rezultati v prvem trenutku zagotoviti nove dokaze o PFTK1 pri razvoju raka in dobava laboratorijske podlagi želodca za klinično zdravljenje. Vendar so nadaljnje študije je potrebno razumeti natančen mehanizem PFTK1 vpliva na proliferacijo, migracijo in invazijo sposobnost želodca rakavih celic.

• Plos ONE: Odkrivanje in karakterizacija metastatskega raka celic v Mesogastrium želodčnega raka bolnikov
• Plos ONE: Prehranska Fat vnos in tveganja želodčnega raka: Meta-analiza opazovalne študije