PLOS ONE: Perte de la protéine leucémie promyélocytaire dans le cancer gastrique: Implications pour IP-10 Expression et infiltrant les tumeurs Lymphocytes

Résumé

Le cancer gastrique est l'une des causes les plus fréquentes de mortalité liée au cancer dans le monde entier. Expression de la protéine suppresseur de tumeur, leucémie promyélocytaire (PML), est réduite ou supprimée dans les carcinomes gastriques, en association avec un niveau accru d'envahissement ganglionnaire, le développement de plus la mise en scène de pTNM, et le pronostic défavorable. Ici, nous avons étudié la relation entre l'étendue des lymphocytes infiltrant la tumeur et le statut de la PML expression de la protéine dans le cancer gastrique avancé. Nous avons observé un nombre plus élevé de l'infiltration des lymphocytes T dans les tissus de carcinome gastrique dans lequel l'expression PML a été réduit ou supprimé, par rapport aux tissus positifs pour PML. L'étendue de la migration des lymphocytes T vers les surnageants de culture obtenus à partir des lignées cellulaires de carcinome gastrique, l'interféron-gamma (IFN-γ stimulées a en outre été affectée par l'expression de la PML in vitro.
Interferon-gamma-inductible protéine 10 (IP -10 /CXCL10) l'expression a été augmentée dans les tissus de carcinome gastrique affichant des niveaux PML réduit. de plus, à la fois Pml
knock-out et les cellules knock-down affiché une expression améliorée IP-10 et l'ARNm de la protéine en présence de l'IFN-γ. PML knockdown augmentation de l'IFN-γ induite par des signaux du transducteur et activateur de la transcription-1 (STAT-1) la liaison au promoteur IP-10, ce qui entraîne une transcription élevée du gène IP-10. A l'inverse, la PML IV expression de la protéine supprimée-10 IP activation du promoteur . d'après ces résultats, nous proposons que la perte de la PML expression de la protéine dans les cellules cancéreuses gastriques contribue à augmenter IP-10 de transcription via
amélioration de STAT-1 activité qui, à son tour, favorise la circulation des lymphocytes dans des régions tumorales .

Citation: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) La perte de la protéine leucémie promyélocytaire dans le cancer gastrique: Implications pour IP-10 Expression et infiltrant les tumeurs Lymphocytes. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264

Editeur: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), États-Unis d'Amérique

Reçu le 21 Avril 2011; Accepté le 23 Septembre 2011; Publié: 12 Octobre, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Kim et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche en sciences de base par la national Research Foundation de Corée (NRF), financé par le Ministère de l'éducation, de la science et de la technologie (2.010 à 0.015.506) à Y-HC, par la national Research Foundation de Corée (NRF) financé par le gouvernement de Corée (MEST) (2.010 à 0.029.353) à JLK, et par RO1 NS50665 à ENB. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'une des causes les plus fréquentes de décès liés au cancer dans le monde entier. Des progrès récents en génétique ont facilité la détection d'événements qui se produisent au cours de la carcinogenèse gastrique, y compris l'activation des oncogènes, réduire au silence des gènes suppresseurs de tumeur, et la mutation de gènes impliqués dans la réparation de l'ADN [1]. Parmi ces événements génétiques, il est connu que l'expression de gène suppresseur de tumeur de leucémie promyélocytaire (PML), la protéine est réduite ou supprimée dans le cancer gastrique, et que ceci est associé à plus vaste invasion lymphatique, plus élevée intermédiaire pTNM et le pronostic défavorable, ce qui suggère que la perte PML liée à la progression du cancer de la carcinogenèse et gastrique [2]. Des études antérieures impliquées Pml de la dysfonction dans la progression d'une variété de cancers, et l'expression réduite ou supprimée de LEMP a été rapporté dans la prostate, du sein, du système nerveux central, du côlon, du poumon et les cancers gastriques [2], [3] .

le gène de Pml a été identifiée à l'origine par fusion avec le récepteur de l'acide rétinoïque impliqué dans la translocation t (15; 17), une translocation chromosomique associée à la leucémie aiguë promyélocytaire (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. La LMP est une protéine suppresseur de tumeur qui régule la progression du cycle cellulaire, la transcription génique, la suppression de la transformation, et l'apoptose. Pml
souris knock-out sont beaucoup plus sensibles à la formation de tumeurs après l'exposition à des agents cancérigènes que sont les contrôles de type sauvage, et Pml
cellules déficientes sont moins susceptibles de subir l'apoptose après l'application de certains types de stress cellulaire [9]. En plus des rapports portant sur le rôle de suppresseur de tumeur joué par PML, plusieurs études ont confirmé que les actes de protéines en tant que régulateur transcriptionnel, via
association avec la protéine co-activateur CREB contraignant; co-répresseurs y compris HDAC, N-CoR et mSin3A; et les facteurs de transcription Nur77, AP-1, myc, p53, et STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

mutation progressive et altérations génétiques dans plusieurs gènes suppresseurs de tumeur favorisent le développement et la progression tumorale [18]. En plus des modifications génétiques dans les cellules tumorales, les cellules inflammatoires et les médiateurs contribuent à la formation des micro-environnements particuliers de tumeurs [19], [20]. fibroblastes associés à une tumeur (TAF) et les macrophages (TAM) sont également impliqués dans la modulation du microenvironnement tumoral via
production de cytokines, les chimiokines, les interférons et d'autres facteurs biologiquement actifs [21], [22]. Cross-talk entre les cellules tumorales, TAFs, TAMs, et les lymphocytes, est important dans le développement et la progression tumorale, et contribue à la mise en place de microenvironnements tumoraux enrichis dans l'expression d'une variété de facteurs biologiquement actifs [23], [24], [25] , [26], [27].

TAMs se trouvent en corrélation avec l'angiogenèse et un pronostic défavorable dans plusieurs types de cancer, y compris le cancer gastrique [22], [28]. mastocytes produit de nombreux facteurs angiogéniques et une variété de cytokines, et sa densité a été rapporté une forte corrélation avec l'étendue de la néovascularisation tumorale et de mauvais pronostic [29], [30]. CD4 ^{+ et CD8 + lymphocytes sont également présents dans une variété de tissus de cancer solide. Jusqu'à présent, les mécanismes moléculaires précis par lesquels le type et le nombre de cellules tumorales infiltrant sont réglementées sont en grande partie inconnus. Il existe plusieurs rapports controversés en ce qui concerne le nombre et la fonction des lymphocytes infiltrant les tumeurs. En particulier, CD8 + T lymphocytes, tandis que leur fonction est connue pour éliminer les cellules transformées naissants et contribuer à l'immunosurveillance [31], il est rapporté que + cellules T infiltrant les tumeurs CD8 sont défectueuses en fonction de phase effectrices lors du contact avec des cellules tumorales [32], et leur infiltration est liée à un pronostic défavorable dans certains types de cancers tels que le cancer non à petites cellules du poumon et cancer du nasopharynx [33], [34].}

chimiokines sécrétées par les cellules du stroma ou d'une tumeur les cellules influencent la migration des cellules tumorales, l'invasion, la prolifération, l'angiogenèse et l'infiltration des cellules immunitaires dans la masse tumorale [35]. IFN-γ inductible par la protéine 10 (IP-10, CXCL10) est l'un des chimiokines CXC qui joue plusieurs rôles dans les maladies inflammatoires et le cancer [36], [37]. Etant donné que IP-10 favorise préférentiellement des réponses immunitaires Th1 en attirant vigoureusement les cellules NK et T, il est suggéré comme l'un des mécanismes possibles de la cellule T infiltration des tumeurs.

Si la perte de gènes suppresseurs de tumeur dans des cellules tumorales induit le recrutement de les lymphocytes et la modulation des fonctions de ces cellules à l'intérieur des micro-environnements de la tumeur est actuellement peu clair. Dans la présente étude, nous avons examiné la fonction PML en ce qui concerne le recrutement de lymphocytes et la modulation de l'expression de facteurs d'origine tumorale. Expression de LEMP a été inversement corrélée à l'étendue de l'infiltration de CD8 ^{+ T-cellules dans les carcinomes gastriques. la perte de la PML a également été associée à une expression accrue de l'IP-10, l'un des chimiokines CXC lymphocytes attracteurs dans des cellules et des tissus de carcinome gastrique. PML knockdown promu l'IFN-γ induite par STAT-1 se liant au promoteur IP-10, ce qui entraîne une augmentation de la transcription du gène IP-10. Nos données appuient l'idée que la PML est impliquée dans le recrutement de lymphocytes dans les tumeurs, via
modulation des niveaux de facteurs d'origine tumorale, y compris IP-10 expression, fournissant une preuve supplémentaire que la perte de gènes suppresseurs de tumeur dans la tumeur cellules participe activement à la création de microenvironnements tumoraux.}

Résultats

Perte de la protéine PML est associée à une infiltration accrue de CD8 ^{+ T-cellules dans le tissu de carcinome gastrique avancé}

de coloration immunohistochimique pour PML et CD8 a été effectuée pour déterminer si l'étendue de l'infiltration des lymphocytes a été associée avec le statut d'expression PML dans le cancer gastrique avancé. cellules CD8-immunopositives ont été dénombrées comme décrit dans Matériels et Méthodes. Au total, 35 échantillons (71,4%) ont montré une perte partielle à complète de PML dans les noyaux de cellules tumorales de stade IV carcinomes gastriques avancés. Les échantillons provenant de 14 patients avancés de carcinome gastrique étaient diffusément positif pour PML, et contenaient une moyenne de 32,7 CD8 ^{+ T-cellules par champ (figure 1A). Nous avons identifié 19 cas de carcinome gastrique avancé présentant positivité focale de LEMP, avec une moyenne de 47,2 CD8 + T-cellules par champ. En outre, la perte complète de LEMP a été observée chez 16 patients avancés de carcinome gastrique; les échantillons contenaient un nombre moyen de 52,8 CD8 + T-cellules par champ. Les échantillons présentant la positivité focale ou une perte complète de LEMP ont montré une augmentation plus marquée dans CD8 + numéro cellules T que les spécimens n'ont présentant positivité diffuse pour PML. Des images représentatives sont montrées sur la figure 1B. Bien que l'expression des protéines PML a été réduite ou supprimée dans les cellules tumorales, toutes les glandes normales de la muqueuse gastrique, les tissus stromales et les cellules lymphoïdes, exposées immunopositivité nucléaire modérée à forte diffuse pour PML.}

influences PML T-infiltration de cellules /migration in vitro

Compte tenu de la perte de l'expression des protéines PML et l'augmentation de l'infiltration de CD8 ^{+ lymphocytes T dans les tissus de carcinome gastrique avancé, nous avons émis l'hypothèse que la PML a contribué à l'infiltration de cellules T /migration dans le cancer gastrique. Pour déterminer si le niveau PML dans les cellules de cancer gastrique influencé la migration des lymphocytes T, conditionnée médias de SNU-638 cellules transfectées transitoirement avec soit Pml
siRNA ou vecteur d'expression PML IV, puis traités par l'IFN-γ a été utilisé dans TRANSWELL tests de migration. SNU-638 cellules de cancer gastrique exprimées des niveaux élevés de la protéine PML, concorde avec les résultats précédents [2], alors SNU-638 cellules transfectées avec Pml
siRNA affiché des niveaux d'expression PML endogène réduite (~46-56%) , confirmée par immunotransfert (figure 2A). IFN-γ induit une légère augmentation de l'expression de protéine PML, en accord avec les résultats précédents [38]. La migration des cellules T Jurkat vers le milieu conditionné à partir de cellules d'ARNsi transfectées SNU-638 PML était significativement améliorée par rapport à celle des cellules d'ARNsi transfectées témoins, après le traitement avec l'IFN-γ (figure 2B). Lors de la transfection de SNU-638 avec le vecteur d'expression PML IV, la migration des lymphocytes T Jurkat vers le milieu conditionné à partir de cellules surexprimés PML IV a été réduit par rapport à celui de vecteur vide (figure 2C). Ces résultats suggèrent que la PML régule les niveaux de molécules sécrétoires produites par et libérés de l'IFN-γ stimulée par les cellules de cancer gastrique, et influe également sur la migration des lymphocytes T.}

Perte de LEMP augmente IFN-γ induite IP-10 expression

chimiokines, une famille de cytokines chimiotactiques, favoriser la migration des leucocytes circulants /lymphocytes aux sites d'inflammation et des blessures. Pour déterminer si les niveaux de chimiokines ont été affectés par Pml
statut génétique, l'expression du gène de chimiokine a été examiné en utilisant un dosage de protection de ribonucléase (RPA). Pml
<sup>+ /+ et Pml
- /- souris fibroblaste embryonnaire (MEF), les cellules ont été incubées en l'absence ou en présence d'IFN-γ pour 0-24 h , l'ARNm total a été recueilli à divers points de temps, et soumis à l'APR. Dans Pml
- /- FAE, IP-10 niveaux d'ARNm ont augmenté de 1,5 fois à 2 h, et se sont considérablement élevés (8 fois) par 4 h (figure 3A). les niveaux d'ARNm de RANTES ont augmenté de 3,2 fois à 0,5 h, et sont restés élevés, mais dans une moindre mesure (1,3 fois), le traitement post-IFN-γ 8 h dans Pml
- /- MEFs . D'autres gènes chimiokines, y compris MIP-1, MIP-2 et MCP-1, ne sont pas décelable exprimés en Pml
+ /+ ou Pml
- /- FAE (données non représentées). STAT-1 expression a été augmentée après exposition à l'IFN-γ dans les deux types de cellules, mais aucune différence n'a été évidente lorsque les niveaux d'IFN-y ont été comparées entre Pml
+ /+ et Pml
- /- cellules. Comme la transcription du gène IP-10 a été sensiblement élevé dans IFN-γ stimulée par Pml
- /- MEF, nous avons mesuré les niveaux de protéines pertinentes dans les surnageants de culture de Pml
+ /+ et Pml
- /- FAE, en utilisant un dosage immuno-enzymatique (ELISA). Conformément aux résultats de l'APR, des niveaux plus élevés de IP-10 protéines étaient évidentes dans le milieu conditionné de l'IFN-γ-traité Pml
- /- MEF (figure 3B). En outre, IP-10 dans l'expression d'ARNm Les cellules NIH3T3 transfectées par siRNA de Pml a été améliorée, comparée à celle des cellules transfectées siRNA contrôle, après traitement par IFN-γ (figure 3C). La réduction de l'expression de la protéine PML dans les cellules NIH3T3 de siRNA-transfectées
Pml a été confirmée par immunotransfert.</sup>

expression PML réduite est inversement corrélée à IP-10 niveaux de protéines dans les tissus du cancer gastrique et SNU- 638 cellules

ensuite, nous avons examiné la relation entre IP-10 et PML expression de la protéine dans le tissu de carcinome gastrique avancé. les tissus cancéreux ont été immuno-colorées pour la PML et IP-10, et l'intensité de immunopositivité IP-10 a été mesurée comme décrit dans Matériels et Méthodes. L'intensité moyenne de IP-10 a des échantillons de 1,2 à 14 montrant la positivité diffuse (DP) pour PML, 2,2 dans 19 cas de positivité focale (FP), et 2.0 dans 16 échantillons dans lesquels il y avait une perte totale (CL) de l'expression PML ( Figure 4A, panneau de gauche). Des augmentations significatives dans l'expression IP-10 ont été observées dans des échantillons montrant positivité focale de LEMP ( P
= 0,034), par rapport à ceux montrant diffus expression PML positive. Une augmentation des IP-10 expression a été observée lorsque la perte complète de LEMP était évident, par rapport à ce qui a été noté quand PML était diffusément exprimé; Cependant, cette différence n'a pas atteint la signification statistique. Des exemples représentatifs de variations de LEMP état de protéine qui en corrélation avec différents IP-10 niveaux d'expression dans les cellules tumorales de carcinomes gastriques avancés sont représentés (figure 4A, à droite). Pour examiner davantage la relation entre l'expression de la protéine IP-10 et PML dans des lignées cellulaires de carcinome gastrique, IP-10 niveaux de protéines ont été mesurées dans les surnageants de culture de SNU-638 cellules transfectées transitoirement avec soit Pml
siRNA ou PML IV exression vecteur. Les cellules ont été cultivées en absence ou en présence de l'IFN-γ pendant 8 h, les surnageants collectés, et IP-10 niveaux quantifiés dans celui-ci (par ELISA). IFN-γ induite par IP-10 de la sécrétion a été significativement améliorée dans SNU-638- Les cellules transfectées siRNA PML, par rapport à celle de la SNU-638 transfectées avec le siRNA contrôle (figure 4B). Transfection de SNU-638 avec le vecteur d'expression PML IV supprimé IFN-γ induite par IP-10 sécrétion (figure 4C). Les résultats montrent clairement que la sécrétion d'IP-10 à partir de cellules de cancer gastrique est augmentée lorsque l'expression PML est réduite.

IP-10 neutralisation diminue la migration des lymphocytes T

Comme SNU-638- Pml de cellules contenant siARN exprimant des niveaux réduits de protéine PML ont montré l'amélioration du recrutement des lymphocytes T et la sécrétion de IP-10 en réponse à l'IFN-γ (figures 2 et 4), nous avons ensuite examiné si une augmentation IP- 10 niveaux ont facilité la migration des lymphocytes T vers un milieu conditionné à partir de SNU-638 cellules de cancer gastrique stimulées par l'IFN-γ. SNU-638- Pml
cellules siARN ont été cultivées en absence ou en présence de l'IFN-γ pendant 8 heures, et les surnageants recueillis ont été prétraitées avec un anticorps neutralisant anti-IP-10 ou de contrôle non spécifique des IgG pour 1 h avant le début de l'essai transwell. Les surnageants d'anticorps neutralisants ou IgG contenant ont été placées dans les cavités inférieures et la migration des cellules Jurkat supérieure à partir de chambres inférieures ont été analysées en examinant les cellules récoltées à partir des chambres inférieures. Inclusion des IP-10-anticorps neutralisants inhibés Jurkat la migration des lymphocytes T vers le milieu conditionné de SNU-638- siRNA cellules (figure 5A)
LEMP. Ces résultats sont cohérents avec les données obtenues à partir de cellules NIH3T3; un anticorps IP-10 neutralisant inhibé EL-4 migration des lymphocytes T vers un milieu conditionné à partir de NIH3T3- Pml
cellules siRNA (figure 5B).

knockdown PML améliore IP-10 activation du promoteur

IP-10 expression a été augmentée dans les cellules PML knockdown, nous avons exploré plus avant si l'expression de la protéine PML affectée IP-10 l'activité du promoteur. L'IP-10 promoteur murin contient un élément GAS comme putative compris entre nts -246 et -238 (TTN _{5AA) (figure 6A). Nous avons précédemment rapporté que la PML régule négativement l'activité transcriptionnelle de STAT-1 [17]. Pour vérifier si la PML affectée IFN-γ induite par IP-10 l'expression du gène via
un mécanisme impliquant STAT-1, nous avons isolé et a généré une construction reporter débutant à la position -330 de l'IP-10 promoteur murin contenant le élément GAS analogue putatif, tel que décrit dans Matériels et Méthodes. L'IP-10- luc
rapporteur contenant l'élément GAS-like a été transitoirement transfecté dans des cellules NIH3T3 incubées avec ou sans IFN-γ pendant 24 h, et ensuite analysé pour déterminer l'activité de la luciférase. IFN-γ induite par IP-10 activité de promoteur a été significativement améliorée dans des cellules NIH3T3 transfectées avec Pml
ARNsi, par rapport aux cellules de réception siRNA contrôle (figure 6B). Lors de la transfection des cellules NIH3T3 avec le vecteur d'expression de la PML IV, l'IFN-γ induite par IP-10 l'activation du promoteur a été significativement réprimée. La régulation négative de l'expression PML utilisant Pml de siRNA et la surexpression de LEMP par le vecteur d'expression PML IV ont été vérifiées par immunoblot. Pour déterminer si l'effet inhibiteur de la PML sur IP-10 activité de promoteur d'IFN-γ induite est produite dans les cellules cancéreuses gastriques lignes, nous avons effectué des expériences similaires avec SNU-638 cellules cancéreuses gastriques. Les modes d'augmentation et de diminution de l'activité de la luciférase dans SNU-638 étaient similaires à celles des cellules NIH3T3 (figure 6C). Le niveau de l'expression des protéines PML dans SNU-638 cellules transfectées avec soit Pml
siRNA ou vecteur d'expression PML IV a été vérifiée par immunotransfert (données non présentées).}

augmente knockdown de LEMP IFN-γ- STAT-1 induite par liaison à l'ADN du promoteur IP-10

l'effet de la PML sur l'IFN-γ induite par STAT-1 liaison à l'ADN du promoteur IP-10 a également été examinée. PML surexpression de la protéine dans les cellules NIH3T3, après transfection transitoire avec le vecteur d'expression de la PML IV, partiellement bloqué l'IFN-γ induite par STAT-1 liaison à l'ADN du promoteur IP-10, y compris la séquence à -246 à -238 (figure 7A, comparer voies 3 et 5). Concours en utilisant un excès oligonucléotide non marqué 100 molaire codant pour le promoteur IP-10 a abrogé la formation du complexe (piste 6). Les niveaux de PML et STAT-1 expression de la protéine dans les lysats de cellules entières (WCL) et l'étendue de STAT-1 phosphorylation de la tyrosine dans les extraits nucléaires (NE) ont été vérifiées par immunotransfert. Utilisant NE de NIH3T3- Pml
cellules siARN obtenu après 0,5 h de traitement par IFN-γ, une forte liaison à l'IP-10 promoteur murin a été observé (figure 7B, le panneau supérieur, piste 5), par rapport à la liaison vu dans des cellules NIH3T3 siRNA contrôle (piste 3). Les mêmes éléments de réseau ont été exposés à la STAT-1 consensus oligonucléotide, et la liaison STAT-1 ADN a été renforcée dans le nord de NIH3T3- cellules siARN
Pml (Figure 7B, panneau central, comparer les pistes 3 et 5). À l'aide SNU 638 cellules gastriques du cancer, nous avons aussi trouvé que la liaison qui STAT-1 ADN cellules d'ARNsi transfectées SNU-638 PML a été améliorée par rapport à celle des cellules d'ARNsi transfectées témoins, après le traitement avec l'IFN-γ (figure 7C, comparer les pistes 3 et 5). Ces données indiquent que la PML inhibe partiellement STAT-1 se liant au promoteur IP-10, et que cet effet est corrélée à une augmentation de l'IFN-γ induite par IP-10 transcription en l'absence de LMP.

Discussion

des études histopathologiques ont montré que le microenvironnement inflammatoire des tumeurs est caractérisée par la présence d'infiltrats de cellules mononucléées, à la fois dans les régions du stroma et de la tumeur de soutien. Cependant, les mécanismes précis par lesquels les cellules mononucléaires infiltrent et sont soutenus dans les tissus cancéreux ne sont actuellement pas pleinement compris. Dans la présente étude, nous offrons des preuves que la perte d'expression de la protéine suppresseur de tumeur, PML, contribue à l'amélioration de l'infiltration des lymphocytes dans les tissus du cancer gastrique, via
régulation de IP-10 expression.

Nous avons examiné la fonction de PML en ce qui concerne le recrutement des lymphocytes en utilisant des échantillons de tissus de cancer gastriques humaines, Pml
<sup>+ /+ et Pml
- /- MEF, et PML knockdown à la fois NIH3T3 et SNU-638 cellules. Les données obtenues à partir des deux essais de tissus humains et les essais de migration Transwell ont montré que la perte de PML favorise le trafic des lymphocytes; ainsi, nous avons cherché des mécanismes qui pourraient éventuellement expliquer ces observations. Nous montrons qu'une augmentation des 10 niveaux IP dans les cellules cancéreuses exprimant de faibles niveaux de LMP contribue au recrutement des lymphocytes. En outre, IP-10 anticorps neutralisant a inhibé la migration des lymphocytes T vers un milieu conditionné à partir de fibroblastes NIH3T3 et SNU 638 cellules cancéreuses gastriques in vitro
, en accord avec les résultats de plusieurs in vivo, des études antérieures
, qui a montré que la neutralisation de IP-10 supprime des cellules T recrutement [39], [40]. Au meilleur de notre connaissance, ceci est la première étude montrant que le suppresseur de tumeur, PML, régule IP-10 chimiokine transcription et de la traite des lymphocytes dans le cancer gastrique, en modulant l'activité de la voie de signalisation de l'IFN-γ /STAT-1.</sup>

IP-10, une chemokine CXC ciblage des lymphocytes induite par les interférons de type I et II, joue un rôle important dans le recrutement des lymphocytes dans plusieurs conditions inflammatoires [41]. IP-10 est sécrétée par les cellules immunitaires infiltrant la tumeur, ainsi que par les cellules tumorales et de parenchymes dans un micro-environnement de cytokines et interferon enrichi. TAFs provenant de patients atteints de cancer du poumon produisent et sécrètent constitutivement IP-10 [27]. Hépatocytes infectés avec le virus de l'hépatite C produisent IP-10 et induisent la migration des cellules T activées au parenchyme hépatique, ce qui indique que la PI-10 niveaux sont mis en corrélation avec la sévérité histologique et l'inflammation [42]. Dans notre système, IP-10 sécrétion a été observée dans le cancer gastrique SNU-638 cellules, les fibroblastes NIH3T3, et MEF, en réponse à l'IFN-γ, et la sécrétion a été renforcée en l'absence de PML expression de la protéine. Étant donné que nous avons trouvé qu'il n'y avait aucune différence appréciable dans le niveau de STAT-1, l'expression et la phosphorylation en l'absence ou en présence de la PML sur l'IFN-γ (figures 3 et 7), l'augmentation de l'IFN-γ induite par IP-10 transcription en l'absence de LEMP a été causée principalement par un renforcement de STAT-1 liaison à l'ADN à IP-10 promoteur. Nous suggérons que l'inhibition de STAT-1 ADN conduit à la suppression de la liaison IP-10 expression de STAT-1-dépendante, PML-médiation en accord avec nos résultats précédents [17]. Dans la présente étude, nous identifions une région régulatrice potentiel de PML dans le promoteur IP-10, qui est un site STAT-1 liaison putatif. En outre, nous montrons que la liaison STAT-1 DNA PML knockdown augmente l'IFN-γ induite par le promoteur IP-10, et améliore IP 10 niveaux en l'absence de PML.

Lymphocytes, les neutrophiles, les macrophages, et mastocytes sont les principales composantes de la plupart des infiltrats de tumeur. Les lymphocytes infiltrant les tumeurs ont été identifiés dans une variété de tissus de cancer solide. Toutefois, les fonctions spécifiques de ces cellules dans les tumeurs et les mécanismes moléculaires précis de recrutement de lymphocytes dans les tumeurs, restent controversées. Le statut et la pertinence fonctionnelle des CD8 d'infiltration ^{+ T-cell dans les tumeurs, et l'association de ces cellules avec le pronostic du patient, ne sont pas claires. Dans le carcinome des cellules rénales, des lymphocytes T CD8 infiltration de + est associée à un pronostic favorable [43]. A l'inverse, cette imprégnation est lié à un pronostic défavorable chez les patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules [33]. Nous montrons que ici PML expression de la protéine dans les cellules tumorales est inversement corrélée avec le degré d'infiltration des CD8 + T-cellules dans les tissus tumoraux. Lorsque la fonction de LEMP dans l'invasion lymphatique est considéré conjointement avec l'association entre l'expression PML et le pronostic défavorable [2], il est évident que toute relation entre les caractéristiques cliniques et l'étendue de CD8 d'infiltration + T-cell chez les patients atteints de cancer gastrique nécessite de plus amples éclaircissements.}

noyaux des glandes normales de la muqueuse gastrique, les tissus stromales et les cellules lymphoïdes sont diffusément immunopositif (modérée à forte) pour PML expression de la protéine, tandis que les niveaux LEMP ont été réduites ou supprimées dans les cellules tumorales (Figure 1). Ces résultats soutiennent l'idée que les cellules cancéreuses ont des mécanismes de dégradation spécifiques pour PML. Nous proposons que la dégradation post-traductionnelle protéasome-dépendante explique la perte de la protéine PML. En d'autres termes, la dégradation au niveau transcriptionnel ne fonctionnant [2], [44]. PML expression de la protéine est réduite ou supprimée dans de nombreux types de cancers, y compris de la prostate, du sein, du système nerveux central, du côlon, du poumon et le cancer gastrique [2], [3]. Conformément à ces résultats, nous avons observé une expression réduite ou négligeable de LEMP dans les tissus de cancer gastrique avancé. De plus, nos résultats suggèrent que les cellules cancéreuses exprimant différents niveaux de protéine PML varient dans leur capacité à attirer et à retenir des lymphocytes dans les zones tumorales, fournissant ainsi une preuve supplémentaire que ces cellules participent activement à la mise en place de microenvironnements tumoraux inflammatoires, via
mécanismes PML-médiée.

NF-kB et STAT-3 de signalisation sont proposés pour servir les systèmes réglementaires majeurs reliant l'inflammation au cancer [45]. IL-6, un facteur de croissance inflammatoire NF-kB-dépendante, est essentielle pour le développement de l'inflammation associée à la cancérogenèse [46]. une preuve circonstancielle récente a renforcé l'idée que le STAT-3 axe IL-6 /gp130 /signalisation sert à la fois une boucle d'amplification autocrine et paracrine dans l'adénocarcinome du poumon, les cellules cancéreuses de myélome multiple, Ras-transformées, et un modèle de cancer de colite associée [47], [48], [49], [50]. PML a été montré pour supprimer l'IL-6 induite par STAT 3-activité [51], afin de favoriser l'apoptose
via un processus à médiation par le TNF, et de sensibiliser les cellules à l'apoptose en inhibant la survie de NF-kB à médiation voie [52]. Cependant, il reste à déterminer si la perte de la PML suppresseur de tumeur contribue à modifier la réponse immunitaire de l'hôte ou le microenvironnement tumoral, peut-être obtenu soit immunosurveillance ou d'échappement immunitaire, par la modulation de facteurs de transcription. Ainsi, il serait intéressant de comparer les effets de la perte de LEMP expression de la protéine sur NF-kB /STAT-3 et STAT-1 de signalisation, et de déterminer si la fonction de ces facteurs de transcription d'une manière coordonnée pour réguler l'expression d'un sous-ensemble de chimiokines contribuant à l'établissement de microenvironnements tumoraux inflammatoires.

Matériel et méthodes

cellules

primaire et immortalisés Pml
<sup>+ /+ et Pml
- /- ont été MEFs établi et maintenu comme décrit précédemment [53]. La lignée cellulaire de carconoma SNU-638 humaine gastrique, Jurkat lignée cellulaire lymphoblastique de type humain à cellules T, et EL-4 lignées de cellules T-lymphome de souris ont été maintenues comme décrit précédemment [2], [54].</sup>

tissus gastriques de carcinome

Un total de 49 carcinome gastrique blocs de paraffine ont été obtenus à partir de 49 patients (29 hommes, 20 femmes; âge médian 64 ans; intervalle 35-84) qui avaient subi une gastrectomie totale ou subtotale pour le stade IV avancé carcinomes gastriques à l'hôpital Mokdong, Ewha School of Medicine, Seoul Womans University, Corée de 2001 à 2007.

Réactifs et anticorps

murin recombinant et d'IFN-γ humain (mlFN-γ et hIFN- γ) et mip-10 et HIP-10 ont été achetés chez ProSpec (Rehovot, Israël). Les anticorps anti-PML (d'anticorps monoclonal de souris) et STAT-1 ont été achetés chez Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) et des anticorps neutralisants à IP-10 a été acheté auprès de R &D Systems (Minneapolis, MN, États-Unis). Anticorps à p-Y701-STAT-1 a été acheté auprès de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Les anticorps anti-histone, Lamin B et PML (lapin polyclonaux) ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), et de l'anticorps anti-tubuline a été acheté auprès de Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) .

immunohistochimie, le nombre de cellules, et la mesure des zones immunoréactives de

tissus de cancer gastrique humain ont été traitées pour l'analyse immunohistochimique comme décrit précédemment [2] avec des modifications mineures. Les anticorps primaires pour PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), et IP-10 (1:50; R & D Systems) ont été utilisés. Toutes les lames ont été colorées avec de l'hématoxyline de Mayer. Des contrôles positifs ont été obtenus en utilisant les amygdales palatines pour la protéine PML et CD8, et les carcinomes indifférenciés du nasopharynx pour IP-10. Les contrôles négatifs ont été obtenus en omettant des anticorps primaires de toutes les diapositives. Immunopositivité pour la protéine PML a été classée comme la positivité diffuse (immunoréactivité nucléaire dans ≥50% des cellules tumorales), la positivité focale (en ≥10%, mais < 50%), ou la perte totale (en < 10% des cellules tumorales). Le nombre de cellules CD8 immunopositives dans un champ de haute puissance (HPF, x40) de 0,25 mm ^{2 pour cinq tumeurs choisis au hasard frontières infiltrants ont été comptés pour chaque échantillon, suivie du calcul du nombre moyen et SD. Immunopositivité pour IP-10 a été définie comme toute expression positive nucléaire ou cytoplasmique dans les cellules tumorales. Pour déterminer le niveau exprimé de chaque lame, les images numériques ont été obtenues en utilisant une caméra numérique montée sur un microscope. En utilisant le logiciel ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij), chaque image a été convertie en 8 bits gris densités d'échelle et de la région ont été mesurés à partir des pixels dans la région d'intérêt; seulement pixels dépassant un certain niveau (> 50 valeur d'intensité). ont été inclus pour éliminer l'erreur de fond}

siRNA transfection

cellules NIH3T3 ont été transitoirement transfectées en utilisant Mirus réactif de transfection (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLOS ONE: La régulation négative de RPL6 par siRNA inhibe la prolifération et la progression du cycle cellulaire de la cellule cancer gastrique humain Lines
• PLOS ONE: miR-29a Empêche la prolifération cellulaire et induit un arrêt du cycle cellulaire par la régulation négative de p42.3 dans Human gastrique Cancer